专利名称：一种利用微生物降解苯并(a)芘的方法
技术领域：
本发明涉及ー种利用微生物进行有害物质的降解技木，特别涉及ー种用微生物降解苯并(a)芘的方法。
背景技术：
苯并(a)芘(以下縮写成BaP)是世界公认的强致癌性多环芳烃污染物，这是因为其自身具有五环结构，因此能积累在生物体中，导致生物染色体发生畸变，无序合成DNA，进而威胁到人类健康。BaP在环境中分布很广。人们通过呼吸、饮水和进食等途径都可能摄取到BaP。世界保健署和国际癌研究署曾将BaP定为2A类物质；美国环保局已将其列入优先控制有毒有机污染物的黑名単。由于BaP的次生代谢产物通常具有更强的毒性，因此利用 微生物实现BaP的有效降解一直是国内外的研究热点，但一直未能取得突破性进展。时至今日BaP对土壤污染问题已成为限制中国农业可持续发展的重大障碍之一。沈阳、兰州和广州等许多地区的土壌及地下水因BaP所造成的污染，已经导致居民癌症的发病和死亡率远高于无此类污染的其他地区。20世纪80年代初，谢重阁等的測定结果表明，沈抚灌渠渣油BaP含量高达29 30mg · kg—1。ー些多环芳烃污染区附近的土壌BaP含量更是高达28 82mg · kg'因此，寻求一种降解BaP的方法，减轻当前由其所至严重污染的状况已经迫在眉睫。目前国内许多BaP污染土壤的修复还主要围绕“降解率”进行研究。从环境毒性的角度来看，仅用BaP的高降解率来衡量其所造成的环境污染的修复程度是不全面而且不准确的。因为未能快速降解的中间产物如醌、醇、酚等未开环中间产物仍然含有类似BaP的“三致”结构一一 “K”区和“湾”区，而含有此“双区”的多环芳烃化合物仍然和环境毒性相关联，进而可以说BaP的有毒污染并未得到彻底消除。据Cerniglia等报道，BaP的致癌作用主要是其代谢产物与细胞大分子DNA相互作用所导致。因此，高降解率只是去除BaP的第一歩，而其次生代谢产物就像“邪恶黑客” 一样继续侵害人们健康的肌体，诱发致命的恶性肿瘤发生。努力探索BaP降解过程中的累积产物及其环境毒性，成为当今环境科学工作者的重要任务之一。发明目的本发明的目的在于提供ー种用微生物降解BaP的方法。本方法以BaP为目标污染物，运用经筛选驯化的真菌黑曲霉，通过调控降解的共代谢底物、酸度、污染物浓度、真菌加入量等技术參数实施对BaP污染废水的修复过程与机理，并应用于原位修复，实现良性生态循环，在经济效益、社会效益和环境效益等方面挑战过去BaP的降解难题，实现对有毒物质BaP的无毒无害无污染降解目标，达到有效降解BaP的目的。发明原理多环芳烃分子中具有致癌活性的物质大都含有菲环结构。对BaP分子来说，在相当于菲的4，5_键位(又称中菲键)能形成致癌中心，即“K区”，因此具有强致癌性，致畸性和致遗传毒性，严重威胁着人体的健康和安全，同时对土壌也有较强的污染作用。因此，本项发明的研究者采用具有降解作用的微生物对BaP分子进行强效降解，同时注重解决降解过程中可能遇到的各种极端环境条件对微生物的影响，比如高污染浓度、高酸度、碱性条件下，所用菌是否耐受，污染物质的吸附效果与降解率的实际数值等。经过反复试验，从而达到了较为理想的效果。
发明内容
为了达到上述的发明的目的，根据前述的原理及实验方案进行反复试验，通过如下技术方案，使得发明目的得以实现。(I)筛选降解菌种。利用现有菌库中的真菌、细菌各十株进行筛选和驯化，最后各选出1-2株进行降解实验。(2)代谢产物获得。利用ニ氯甲烷提取产物，经旋转蒸发仪浓縮，过硅胶小柱，常温下利用氮气N2吹干，甲醇定容，用HPLC定性和定量，用制备色谱分离样品得到少量各代谢产物的纯品。 (3)微生物降解途径的确定。对各中间代谢产物进行核磁谱分析，确定各产物的具体分子结构，最后对代谢产物的毒性和各种特性进行分析，从而最终确定出了微生物降解BaP的有效方法。新发明的BaP降解方法是(I)菌种选择与驯化。确定了真菌黑曲霉为BaP的降解菌，为了提高真菌黑曲霉对BaP的降解率，对真菌黑曲霉进行驯化，具体的方式是在培养液中接入该菌种，然后按照一般的驯化方式阶梯性加入一定浓度的目标污染物BaP，2个月后驯化基本完成。(2)菌种保存培养。选择试管斜面保存作为菌种的保存方式。其中试管中的固体培养基为土豆培养基，培养基成分按每升所含物质的重量并以克为单位(g/L)为土豆200g ;蔗糖20g，琼脂20g ;蒸馏水IOOOmL.经高压灭菌锅灭菌后，在试管斜面中接入真菌黑曲霉，使之起到活化和留种作用，将接入菌种的试管放入摇床，控制摇床转速为150r/min，在28°C 30°C温度下于培养箱中培养7天。(3)真菌黑曲霉种子培养。将种子培养液高压灭菌后，将固体培养基培养出的菌种接入种子培养液并置入摇床中进ー步繁育扩大，摇床转速为150r/min，在27°C 29°C下培养12 18h。然后即可按比例接入到被BaP污染的废水中进行降解处理。其中真菌黑曲霉的种子培养液成分，按每升营养液所含物质重量以克为単位(g/L)为:NH4N03，1 ;MgS04*7H20，
O.2 ；CaCl2 · 2H20,0. 01 ；FeS04 · 7H20,0. 01 ；KH2PO4,0. 4 ；Na2HP04 · 12H20,0. 6 ；MnS04,0 . 02 ;葡萄糖,0. 5。(4) BaP进行降解处理。利用筛选驯化出比较好的真菌黑曲霉，对污水中的污染物BaP进行降解，其条件是BaP的浓度为< 150mg/L ;真菌黑曲霉种子液的加入量按重量百分数计为污水重量的10%;ρΗ值为5. 0-7. 5 ;共代谢底物是琥珀酸钠，浓度低于BaP浓度的一半；降解适宜温度范围为18-32°C，最佳温度是28で。发明的优点与效果微生物降解法具有原材料来源丰富、成本低廉、吸附速度快、吸附量大等优点。本项发明是以微生物为实验的中心材料，以生活中的BaP为目标污染物，所完成的发明方法具有如下优点
(I)实验时结合BaP在其降解过程中的温度、pH、以及微生物自身的数量等影响因素的变化，利用微生物自身的有利条件，在菌类投放量为5% -15%的情况下可以收到较为理想的降解效果，其中10%时收到的效果最佳。(2)经对其代谢产物的详细分析(主要的降解代谢产物为BPl，6_quinone和3-0HBP)和计算表明，该方法对BaP的降解率可达到70 %，而且所有代谢产物在自然条件下均已成为无毒无害物质，有效地降低了 BaP的毒性，同时建立和丰富了 BaP的微生物降解途径。(3)此项发明的成功应用，在实际环境条件下，将为BaP污染废水的治理与修复提供经济可靠的先进处理方法。实现保护环境，改善生态的良性生态循环。不但实现社会效益和环境效益的最大化，也可获得可观的经济效益。实施方式
通过本项发明方法对于BaP污染废水进行处理，处理时地温度为28 V，摇床转数为150r/min，真菌黑曲霉的投加量为污水总重量的10%，降解时间为5d，经取样化验，BaP去除率已经达到了 80%以上。处理后废水达到的具体指标为pH = 6. 0-7. O ;生化需氧量B0D5 ( 30mg/L ;化学需氧量(重铬酸钾法)COD ( 90mg/L ;挥发酚< O. lmg/L ;氮(NH3形式存在)(2. 5mg/L ；SS (固体悬浮物)(20mg/L ;总汞< O. 03mg/L ;总铅< O. 008mg/L ;总镉< O. 01mg/L。表明用上述微生物对BaP复合污染废水进行治理是完全可行的。
权利要求
1.ー种降解苯并(a)芘用微生物的培养方法，其特征在于该方法选择真菌黑曲霉为苯并(a)芘的降解菌，经过2个月的苯并(a)芘降解驯化后，选择试管斜面固体培养基保存驯化后的真菌黑曲霉菌种，将接入菌种的试管放入摇床，控制摇床转速为150r/min，在28°C 30°C温度下于培养箱中培养7天，然后将试管斜面固体培养基保存的真菌黑曲霉菌种接入种子培养液中并置入摇床内进ー步繁育扩大，摇床转速为150r/min，在27°C 29°C下培养12 18h。
2.根据权利要求I所说的降解苯并(a)芘用微生物的培养方法，其特征在于方法中所使用的试管内的固体培养基为土豆培养基，培养基成分按每升所含物质的重量并以克为单位(g/L)为:土豆200g ;鹿糖20g，琼脂20g ;蒸懼水IOOOmLo
3.根据权利要求I所说的降解苯并(a)芘用微生物的培养方法，其特征在于方法中所使用的种子培养液成分，按每升营养液所含物质重量以克为単位(g/L)为=NH4NO3,1 ;MgSO4 · 7Η20，0· 2 ；CaCl2 · 2Η20，0· 01 ；FeSO4 · 7Η20，0· 01 ;ΚΗ2Ρ04，0· 4 ；Na2HPO4 · 12Η20，0· 6 ；MnSO4,0. 02 ;葡萄糖，O. 5。
4.ー种利用微生物降解苯并(a)芘的方法，其特征在于利用筛选驯化好的真菌黑曲霉对污水中的污染物苯并(a)芘进行降解，其条件是苯并(a)芘的浓度为< 150mg/L ;真菌黑曲霉种子液的加入量按重量百分数计为污水重量的10% ;pH值为5. 0-7. 5 ;共代谢底物是琥珀酸钠，浓度低于苯并(a)芘浓度的一半；降解温度范围为18-32°C。
全文摘要
一种降解苯并(a)芘用微生物的培养方法，其特征在于该方法选择真菌黑曲霉为苯并(a)芘的降解菌，经驯化后，选择试管斜面固体培养基和营养液保存驯化后的真菌黑曲霉菌种。利用真菌黑曲霉对污水中的污染物苯并(a)芘进行降解，真菌黑曲霉种子液的加入量为污水重量的10％；pH值为5.0-7.5；降解温度范围为18-32℃，经处理后苯并(a)芘的去除率可达到80％以上，收到了较为理想的效果。
文档编号C02F3/34GK102690758SQ20111007199
公开日2012年9月26日 申请日期2011年3月24日 优先权日2011年3月24日
发明者安宇, 席赛男, 常美佳 申请人:安宇, 席赛男, 常美佳