专利名称：一种短小芽孢杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及ー种短小芽孢杆菌及其应用。
背景技术：
石油污染土壌的微生物修复技术，近十几年来在国外得到了较大发展，但是石油烃类污染物降解速度缓慢，致使治理过程延续时间较长，一直是这项技术的ー个突出难点，因此寻找高效石油降解菌是当前石油污染土壌微生物修复技术的研究热点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供ー种可用于降解 石油污染物的短小芽孢杆菌。该菌株是以原油为唯一碳源筛选出来的优势菌株，菌株在生长繁殖过程中可改变原油的性质，使原油的组分发生变化，起到乳化、润湿和分散原油的作用。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是ー种短小芽孢杆菌，其特征在于，所述短小芽孢杆菌为Bacillus pumilus 4070，保藏编号CGMCC No. 6073，保藏日为2012年5月3日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。I、该菌株具有如下的性质形态特征菌落扁平较大，白色，表面微皱，直径3mm 4mm，菌体呈直或微弯的杆菌。生理生化特征革兰氏阳性细菌。2、该菌株的筛选方法为步骤一、富集将从西安市未央区长安大学渭水校区陕西省地下水与生态环境エ程研究中心试验场土壌石油污染10000mg/kg修复区IOcm左右红三叶草根际修复区采集的土样以无菌方式称取10. Og,接入100. OmL石油/无机盐液体培养基中，置于28土1°C、130r/min恒温摇床富集培养7d ;然后吸取5mL培养液重新转接入新鲜的石油/无机盐液体培养基中，再进行3次富集、驯化，每次7d ;所述石油/无机盐液体培养基的组成为NaNO3O. 15%, (NH4) SO4O. 15%, K2HPO4O. 1%，MgSO4 7H200. 05%, KC10. 05%, FeSO4 7H200. 001%,CaCl2O. 0002%,蒸馏水lOOOmL，原油(延长石油脱水原油)0. 5%，以上均为质量百分比，培养基 pH 值 7. 0 7. 5，105KPa 灭菌 20min 25min ；步骤ニ、筛选和纯化将步骤一中富集培养后的富集培养液按十倍稀释法稀释，取10_4、10_5、10_63个稀释度的培养液各0. ImL涂布于石油/无机盐固体平板培养基上，置于37土 TC恒温培养箱内培养48h，选取不同顔色及形态的优势单菌落，在石油/无机盐固体平板培养基上进行多次划线分离，以纯化得到形态一致的纯化菌株，将纯化菌株保存于牛肉膏蛋白胨固体培养基上进行进一步筛选、活化，得到菌株，待用；所述石油/无机盐固体平板培养基的组成为=NaNO3O. 15%，(NH4) SO4O. 15%，K2HPO4O. 1%，MgSO4 7H200. 05%,KC10. 05%, FeSO4 7H200. 001%, CaCl2O. 0002%，琼脂 2%，蒸馏水 lOOOmL，原油(延长石油脱水原油)0. 5%，以上均为质量百分比，培养基pH值7. 0 7. 5，105KPa灭菌20min 25min ；步骤三、复筛将步骤ニ中活化好的菌株分别接种于IOOmL含有lwt%正十二烷和lwt%环己烷的无机盐液体培养基中，28土 1°C、130r/min摇床培养，当培养液明显浑浊后，取ImL培养液接种到含lwt%正十二烷和lwt%环己烷的无机盐固体培养基中培养，然后再将培养的菌株接种于IOOmL含有lwt%正十二烷和lwt%环己烷的无机盐液体培养基中培养，如此重复3次，保存最终仍能使含有正十二烷和环己烷的无机盐液体培养基变浑浊的菌株。3、该菌株的鉴定方法为步骤一、提取总DNA 101、取过夜培养菌株(至多2X109个)，10000r/min离心Imin收集菌体，加入180 u L 溶菌溶液(20mg/mL 溶菌酶，20mMTris_HCl pH8，2. 5mMEDTA, l%TritonX-100),重悬菌液，37°C水浴30min 60min ;然后向重悬菌液中添加20 y L蛋白酶K溶液(10mg/mL)， 充分振荡混匀，56°C水浴30min至细胞完全裂解，接着加入200 u L溶液BD，充分振荡混匀，70°C水浴lOmin，再加入200 u L无水こ醇，充分振荡混匀；102、将吸附柱放入收集管中，用移液器将101中振荡混匀后的菌液全部加入吸附柱中，静置2min, 12000r/min离心3min,倒掉滤液；向吸附柱中加入500 u L溶液PW,10000r/min离心Imin,倒掉滤液；向吸附柱中加入500 u L漂洗溶液Wash buffer, IOOOOr/min离心lmin，倒掉滤液；将吸附柱放入收集管中，于12000r/min离心2min，除去残留的漂洗液 Wash buffer ；103、取出吸附柱，放入一个新的I. 5mL的离心管，加入50ii L预热(60°C)的洗脱液Elution buffer,静置3min, 10000r/min室温离心lmin,收集DNA溶液；采用浓度为2%琼脂糖对提取的总DNA进行检测，片段大小在13kb左右；步骤ニ、16SrDNA的PCR扩增以步骤一中提取的总DNA为模板进行PCR扩±曾，PCR反应体系DNA模板lOpmol，上游引物(IOiiM)IiU,下游引物(IOiiM)IiU ；dNTP (IOMm) I U I ; 10 X Taq reaction Buffer5 U I ；Taq (5U/ U I) 0. 25 U I ;加水至 50 U I ;PCR 反应条件预变性 98°C 5min ;循环 95°C 35s，55°C 35s，72°C 30s，35 个循环，最后 72 V延伸8min，4°C保存；所述PCR扩增的引物序列为上游引物(SEQID NO. I) :5，-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’ ；下游引物(SEQID NO. 2) :5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’ ；步骤三、菌株16SrDNA序列分析及比对对步骤ニ中PCR扩增的产物(片段大小I. 4kb左右)进行测序(由生エ生物工程(上海)有限公司协助完成)，得到的16SrDNA部分基因序列(SEQ ID NO. 3)与GenBank中已发表的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)的16SrDNA序列进行同源性比较，相似度达100%。 综合生理生化鉴定、16SrDNA序列分析鉴定結果，鉴定本发明的菌株为短小芽孢杆菌。本发明还提供了上述短小芽孢杆菌在降解石油污染物中的应用。本发明与现有技术相比具有以下优点I、本发明的短小芽孢杆菌源于土壤，因此该菌株进入土壤后很快成为优势菌群，占据一定生态位，有效促进石油烃类的降解，优化土壌微生物体系，改善土壌的物理性状，增强土壤的生物活性，修复板结退化的土壤。2、本发明的短小芽孢杆菌是以原油为唯一碳源筛选出来的优势菌株，菌株在生长繁殖过程中可改变原油的性质，使原油的组分发生变化，起到乳化、润湿和分散原油的作用。3、本发明的短小芽孢杆菌可在短时间内降解土壌中的石油污染物。下面通过实施例，对本发明的技术方案做进ー步的详细描述。
具体实施方式
菌株的筛选步骤一、富集将从西安市未央区长安大学渭水校区陕西省地下水与生态环境エ程研究中心试验场土壌石油污染10000mg/kg修复区IOcm左右红三叶草根际修复区采集的土样以无菌方式称取10. Og,接入100. OmL石油/无机盐液体培养基中，置于28土1°C、130r/min恒温摇床富集培养7d ;然后吸取5mL培养液重新转接入新鲜的石油/无机盐液体培养基中，再进行3次富集、驯化，每次7d ;所述石油/无机盐液体培养基的组成为NaNO3O. 15%, (NH4) SO4O. 15%, K2HPO4O. 1%，MgSO4 7H200. 05%, KC10. 05%, FeSO4 7H200. 001%,CaCl2O. 0002%,蒸馏水lOOOmL，原油(延长石油脱水原油)0. 5%，以上均为质量百分比，培养基 pH 值 7. 0 7. 5，105KPa 灭菌 20min 25min ；步骤ニ、筛选和纯化将步骤一中富集培养后的富集培养液按十倍稀释法稀释，取10_4、10_5、10_63个稀释度的培养液各0. ImL涂布于石油/无机盐固体平板培养基上，置于37土 TC恒温培养箱内培养48h，选取不同顔色及形态的优势单菌落，在石油/无机盐固体平板培养基上进行多次划线分离，以纯化得到形态一致的纯化菌株，将纯化菌株保存于牛肉膏蛋白胨固体培养基上进行进一步筛选、活化，得到菌株，待用；所述石油/无机盐固体平板培养基的组成为=NaNO3O. 15%，(NH4) SO4O. 15%，K2HPO4O. 1%，MgSO4 7H200. 05%,KC10. 05%, FeSO4 7H200. 001%, CaCl2O. 0002%，琼脂 2%，蒸馏水 lOOOmL，原油(延长石油脱水原油)0. 5%，以上均为质量百分比，培养基pH值7. 0 7. 5，105KPa灭菌20min 25min ；步骤三、复筛将步骤ニ中活化好的菌株分别接种于IOOmL含有lwt%正十二烷和lwt%环己烷的无机盐液体培养基中，28± I、130r/min摇床培养，当培养液明显浑浊后，取ImL培养液接种到含lwt%正十二烷和和lwt%环己烷的无机盐固体培养基中培养，然后再将培养的菌株接种于IOOmL含有lwt%正十二烷和lwt%环己烷的无机盐液体培养基中培养，如此重复3次，保存最终仍能使含有正十二烷和环己烷的无机盐液体培养基变浑浊的菌株。菌株的鉴定步骤一、提取总DNA 101、取过夜培养菌株(至多2X109个)，10000r/min离心Imin收集菌体，加入180 u L 溶菌溶液(20mg/mL 溶菌酶，20mMTris_HCl pH8，2. 5mMEDTA, l%TritonX-100),重悬菌液，37°C水浴30min 60min ;然后向重悬菌液中添加20 y L蛋白酶K溶液(10mg/mL)，充分振荡混匀，56°C水浴30min至细胞完全裂解，接着加入200 u L溶液BD，充分振荡混匀，70°C水浴lOmin，再加入200 u L无水こ醇，充分振荡混匀；102、将吸附柱放入收集管中，用移液器将101中振荡混匀后的菌液全部加入吸附柱中，静置2min, 12000r/min离心3min,倒掉滤液；向吸附柱中加入500 y L溶液PW,10000r/min离心lmin,倒掉滤液；向吸附柱中加入500 u L漂洗溶液Wash buffer, IOOOOr/min离心lmin，倒掉滤液；将吸附柱放入收集管中，于12000r/min离心2min，离去残留的漂洗液 Wash buffer ；103、取出吸附柱，放入一个新的1.5mL的离心管，加入50iiL预热(60°C)的洗脱液Elution buffer,静置3min, 10000r/min室温离心lmin,收集DNA溶液；采用浓度为2%琼脂糖对提取的总DNA进行检测，片段大小在13kb左右；步骤ニ、16SrDNA的PCR扩增以步骤一中提取的总DNA为模板进行PCR扩±曾，PCR反应体系DNA模板lOpmol，上游引物(IOiiM)IiU,下游引物(IOiiM)IiU ；dNTP (IOMm) I U I ； 10 X Taq reaction Buffer5 U I ；Taq (5U/ U I) 0. 25 U I ;加水至 50 U I ；PCR 反应条件预变性 98°C 5min ;循环 95°C 35s，55°C 35s，72°C 30s, 35 个循环，最后 72 V 延伸8min，4°C保存；所述PCR扩增的引物序列为上游引物(SEQID NO. I) :5，-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’ ；下游引物(SEQID NO. 2) :5，-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3，；步骤三、菌株16SrDNA序列分析及比对对步骤ニ中PCR扩增的产物(片段大小
I.4kb左右)进行测序(由生エ生物工程(上海)有限公司协助完成)，得到的16SrDNA部分基因序列(SEQ ID NO. 3)与GenBank中已发表的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)的16SrDNA序列进行同源性比较，相似度达100%。 综合生理生化鉴定、16SrDNA序列分析鉴定結果，鉴定本发明的菌株为短小芽孢杆菌,并命名为短小芽孢杆菌Bacillus pumilus4070，保藏编号CGMCC No. 6073。本发明的短小芽孢杆菌的应用效果试验I、短小芽孢杆菌对原油的降解能力试验将本发明的短小芽孢杆菌接种于含有原油的无机盐液体培养基中，于28± I °C，130rpm 发酵培养 7 天，培养基组成=NaNO3O. 15%, (NH4) SO4O. 15%, K2HPO4O. 1%，MgSO4 7H200. 05%, KC10. 05%, FeSO4 7H200. 001%, CaCl2O. 0002%，原油 1%，蒸馏水 IOOOmL,以上均为质量百分比，PH7. 0 7. 5，灭菌20min 25min ;与未接种短小芽孢杆菌的培养基相比，发酵液的顔色明显加深，而且，接种短小芽孢杆菌的发酵液中的原油具有不挂瓶的特点。这说明，本发明的短小芽孢杆菌以原油为唯一碳源生长，改变了原油的性质，使原油的组分发生了变化。将接种短小芽孢杆菌发酵后的原油在显微镜下观察，发现原油中有菌液存在，细菌存在在油水界面上，并以油为碳源，适应环境产生趋油物质，从而起到乳化、润湿和分散原油的作用。2、短小芽孢杆菌对培养基中石油的降解试验将本发明的短小芽孢杆菌接种于含有原油的无机盐液体培养基中，于28土TC，130rpm发酵培养7天，含有原油的无机盐液体培养基组成=NaNO3O. 15%，(NH4) SO4O. 15%，K2HPO4O. 1%，MgSO4 7H200. 05%, KC10. 05%g, FeSO4 7H200. 001%, CaCl2O. 0002%，原油 1%，蒸馏水IOOOmL,以上均为质量百分比，pH7. 0 7. 5，灭菌20min 25min ;然后分别取IOmL发酵液接种于IOOmL新鲜的含有原油的无机盐液体培养基(培养基组成同上)、含有正十二烷的无机盐液体培养基和含有环己烷的无机盐液体培养基中，于28土 TC，130rpm发酵培养7天，含有正十二烷的无机盐液体培养基组成=NaNO3O. 15%，(NH4) SO4O. 15%，K2HPO4O. 1%，MgSO4 7H200. 05%, KC10. 05%g, FeSO4 7H200. 001%, CaCl2O. 0002%,正十二烷 1%，蒸馏水IOOOmL,以上均为质量百分比，pH7. 0 7. 5，灭菌20min 25min ;含有环己烷的无机盐液体培养基组成=NaNO3O. 15%, (NH4) SO4O. 15%, K2HPO4O. 1%，MgSO4 7H200. 05%, KC10. 05%g,FeSO4 7H200. 001%, CaCl2O. 0002%,环己烷1%,蒸馏水IOOOmL,以上均为质量百分比，pH7. 0 7. 5，灭菌20min 25min ;以未接种的三种液体培养基为空白对照，于28土 1°C，130rpm发酵培养7天进行取样，分别检测接种短小芽孢杆菌的发酵液和空白対照的总石油烃(TPH)降解率、直链烷烃降解率和环烷烃降解率，结果见表I。表I菌株的石油降解率及其功能
TPH降解率直链烷烃降解率~ 环烷烃降解率
4070 菌株 37.4%41.6%26.9%
空白对照 9.8%13.8%11. 1%从表I中可以看出，在本发明的短小芽孢杆菌存在下总石油烃的降解率比空白对照提高27. 6%，直链烷烃和环烷烃的降解率均有较大幅度提高，说明本发明的短小芽孢杆菌能够有效降解直链烷烃和环烷烃。3、短小芽孢杆菌对土壤中石油的降解情况将本发明的短小芽孢杆菌接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基中37土TC活化36h，将活化后的菌种按照5% (质量百分比)比例添加到不同的污染度土壌中，土壌中均添加5%的麸皮，土壤中的C N P的比例为100 5 I，N、P源分别为NH4NO3和K2HPO4，土壤中石油的污染度分别为0. 3%、0. 7%和I. 5%，保持土壤含水率为20% 25%，以未添加菌种的土壤为空白対照。经过21天的降解，TPH (总石油烃)的降解率结果如表2所示。表2 土壤石油污染菌株的石油降解率
石油污染度 0. 3%|_ 0. 7%I. 5%
4070 菌株 43.5%39. 5%37.4%
空白对照15.6%12.2%10. 7%通过短小芽孢杆菌的降解，3种石油污染度条件下土壤中的TPH均有明显的降低，分别较空白提高了 27. 9%,27. 3%和26. 7%，可以看出短小芽孢杆菌在土壤中短期能够达到较好的降解效果。综上所述，本发明的短小芽孢杆菌源于土壤，因此该菌株进入土壤后很快成为优势菌群，占据一定生态位，可在短时间内降解土壌中的石油污染物，有效促进石油烃类的降解，优化土壌微生物体系，改善土壌的物理性状。以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何限制，凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
权利要求
1.一种短小芽孢杆菌，其特征在于，所述短小芽孢杆菌为Bacillus pumilus4070，保藏编号 CGMCC No. 6073 ο
2.一种如权利要求I所述短小芽孢杆菌在降解石油污染物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种短小芽孢杆菌Bacillus pumilus 4070，保藏编号CGMCC No.6073。另外，本发明还公开了该短小芽孢杆菌在降解石油污染物中的应用。本发明的短小芽孢杆菌源于土壤，因此该菌株进入土壤后很快成为优势菌群，占据一定生态位，有效促进石油烃类的降解，优化土壤微生物体系，改善土壤的物理性状，增强土壤的生物活性，修复板结退化的土壤。该短小芽孢杆菌是以原油为唯一碳源筛选出来的优势菌株，菌株在生长繁殖过程中可改变原油的性质，使原油的组分发生变化，起到乳化、润湿和分散原油的作用，可在短时间内降解土壤中的石油污染物。
文档编号B09C1/10GK102757920SQ201210264208
公开日2012年10月31日 申请日期2012年7月27日 优先权日2012年7月27日
发明者李春荣, 王周峰, 王文科, 申圆圆 申请人:长安大学