专利名称：一种处理油田压裂返排液的微生物复合菌剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及微生物及其复合菌剂，具体来说是一种处理油田压裂返排液的微生物复合菌剂及其制备方法。
背景技术：
通常油田提高油气井增产的主要措施是采用油气井的压裂液作业，然而在压裂作业的过程中，会产生大量的油田压裂返排液，压裂液返排液组成比较复杂。由于压裂液含有大量的高分子有机化合物，导致压裂液COD值浓度较高，处理技术难度较大。目前，国内针对油田压裂返排液的处理方法主要有以下几点I)焚烧主要是通过高温氧化将高浓度有机废液进行分解，使有机物转化成水和二氧化碳等无机产物，此方法对环境条件要求较高，耗能较大，应用起来较为困难。2)储备池在采油作业后，将压裂液储存在废液池中，此方法虽然能够暂时将废液进行搁置，却无法从根本上对压裂液进行处理，且由于敞口放置，同时也存在着二次污染的问题。3)回注目前大部分油田都采用回注法将作业废水从注水站打入底层，该方法可节约成本，并避免造成二次污染。在油田压裂返排液处理中，环境微生物技术是最具有发展前景的技术，也是未来环境治理的主导技术，微生物处理技术具有低运行成本、应用范围广等优点。与物理化学方法相比，生物处理法可通过在特定环境下对微生物进行筛选纯化，选育出能够适应特定环境下的微生物菌株，通过驯化培养，使微生物对生存环境适应性不断提高，最终实现对压裂液返排液中高分子有机污染物的生物降解处理。 通过中国专利数据库检索，并没有发现用微生物复合菌剂对油田压裂液返排液进生物降解的类似处理方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种处理油田压裂返排液的微生物复合菌剂，所述的这种处理油田压裂返排液的微生物复合菌剂要解决现有技术中的处理油田压裂返排液的方法降解困难、同时伴随二次污染的技术问题。本发明提供了一种枝孢霉菌,其分类命名为Cladosporium sp ,保藏号为CGMCCNo :5782。本发明还提供了一种紫金牛叶杆菌，其分类命名为Phyllobacteriummyrsinacearum,保藏号为 CGMCC No :5783。本发明还提供了一种处理油田压裂返排液的微生物复合菌剂，所述的复合菌剂中含有胍胶、KH2P04、K2HP04、MgS04、CaCl2、NaCl和水，在IL所述的水中，含有0. Ig 5g的胍胶、0. 05g Ig 的 KH2PO4、0. 05g 2g 的 K2HPO4、0. Olg 0. Ig 的 MgSO4、0. Olg 0. 5g 的 CaCl2和0. Olg 0. 2g的NaCl，在所述的菌剂中，还加入有保藏号为CGMCC No :5782和CGMCC No 5783的菌株，所述的CGMCC No :5782的菌株的接种体积为IL水的2. 50% 12. 5%，所述的CGMCC No 5783的菌株的接种体积为IL水的0. 833% 7. 5%。本发明还提供了一种制备上述处理油田压裂返排液的微生物复合菌剂的方法，其中，将保藏号为CGMCC No :5782的枝孢霉菌菌株和保藏号为CGMCC No :5783的紫金牛叶杆菌菌株分别放入两个培养基中进行摇床培养，所述的培养基由水组成，每升水中含有0. Ig 5g 的胍胶、0. 05g Ig 的 KH2P04、0. 05g 2g 的 K2HP04、0. Olg 0. Ig 的 MgSO4'0. Olg 0. 5g的CaCl2和0. Olg 0. 2g的NaCl，培养时间为3 10天，培养温度为5 30°C，然后再向装有上述培养基的两个反应器中按照体积百分比5% 15%的接种量分别接种上述两个菌种，连续培养8 48h，得到液体菌液，然后将含有枝孢霉菌的液体菌液和含有紫金牛叶杆菌的液体菌液按照体积比为I 5:1的比例进行复配，得到微生物复合菌剂。本发明还提供了一种培养基，由水组成,每升水中含有0. Ig 5g的胍胶、0. 05g Ig 的 KH2P04、0. 05g 2§的1(2册04、0. Olg 0. Ig 的 MgS04、0. Olg 0. 5g 的 CaCljPO. Olg 0. 2g 的 NaCl。本发明中的枝孢霉菌，其分类命名为Cladosporium sp.,属于真菌界、半知菌亚门、丝孢纲、丛梗孢目、暗色孢科、枝孢属。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)中，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号(中科院微生物研究所)，保藏日期为2012年2月21号，保藏号为 CGMCC No :5782。本发明中的紫金牛叶杆菌，其分类命名为Phyllobacterium myrsinacearum,该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)中，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号(中科院微生物研究所)，保藏日期为2012年2月21号，保藏号为CGMCC No :5783。本发明的枝孢霉菌和紫金牛叶杆菌是以压裂返排液中对COD影响最大的胍胶为食物，通过振荡培养，能够将压裂返排液中的胍胶以食物的形式进行消耗，降低压裂返排液中的胍胶的含量，从而降低了压裂返排液的COD值。本发明和已有技术相比较，其效果是积极和明显的。本发明的微生物菌剂及其制备方法是利用现在微生物技术，针对压裂液返排液中的高分子有机成分，选育出具有高效降解能力的微生物复合菌群，通过微生物在压裂液返排液中的生长繁殖和驯化，使微生物不断适应油田废水的生长环境，最终达到降解压裂液返排液化学需氧量的目的，本发明能够有效的用于压裂液返排液中高分子、有机物的降解，降解率高，水质清澈，降低了对水体环境和土壤环境的二次污染，具有较好的应用前景。
图I中A是枝孢霉IS383区的PCR产物电泳图谱，B是是标准marker。图2是紫金牛叶杆菌S1197区的PCR产物电泳图谱，B是是标准marker。
具体实施例方式下面实施例采用的设备主要是PCR反应扩增仪(加拿大BBI公司);3730测序列分析仪(美国ABI公司)；SW-CJ-1D洁净工作台(江苏苏洁净化设备厂);DK-8D型电热恒温水槽(上海森信实验仪器有限公司)；DYY-8型稳压稳流电泳仪(上海琪特分析仪器有限公司)；YXJ-2离心机(湘仪离心机仪器有限公司)H6-1微型电泳槽(上海精益有机玻璃制品仪器厂)；凝胶成像系统(Gene Genius公司)；U_3010紫外-可见分光光度计(Hitachi公司)；移液器(范围 IOO-IOOOu 1,20-200 u 1,0. 5-10 u I)(加拿大 BBI 公司)。实施例I :枝孢霉菌和紫金牛叶杆菌的分离纯化以油田压裂液返排液为取样源，按照逐级稀释要求将压裂液返排液以KT1 10,进行稀释，涂布于含有3%高分子有机化合物胍胶的固体培养基上，与温度30°C条件下培养5天。在上述平板上挑取单菌落经过平板划线分离纯化后得到两株具有优良性状的菌株 EBl 和 EB2。实施例2菌株EBl的测序和鉴定 一、基因组提取及电泳检测(一)、基因组提取过程按照上海生工生物工程技术服务有限公司的SK1375真菌基因组DNA抽提试剂盒说明书描述的方法进行提取。抽提步骤如下描述I 取50_100mg新鲜真菌或20mg干燥子实体或菌丝,液氮中充分研磨成粉末。依次加入700 ill 65 °C预热的FPCB Solution和7 P -巯基乙醇，充分混匀，65° C温浴25min,间或混勻。2. 12，OOOrpm离心lOmin，将上清转移至干净的1.5ml离心管中，加入700 y I氯仿，充分混勻，12, OOOrpm离心5min。3.吸取上清至一干净的I. 5ml离心管中，加入40 ii I RNase A (20mg/ml),充分混匀，室温放置IOmin。4.依次加入1/2体积BD Buffer和1/2体积无水乙醇，充分混匀。5.将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加至吸附柱中，静置2min，10, OOOrpm离心lmin，倒掉收集管中废液。6.将吸附柱放回收集管中，加入500 u I Pff Solution, 10，OOOrpm离心lmin,倒掉
收集管中废液。7.将吸附柱放回收集管中，加入500 u I Wash Solution, 10，OOOrpm离心lmin,倒
掉收集管中废液。8.将吸附柱放回收集管中，10，OOOrpm离心2min。9.将吸附柱放入干净的I. 5ml离心管中，在吸附膜中央加入50 y I预热(60°C)的Elution Buffer,静置5min, 10, OOOrpm离心lmin,将所得到的DNA溶液置于_20°C保存或用于后续试验。(二)、将得到的DNA进行PCR扩增I. PCR 体系建立(50ul):Template (基因组)IOpmolPrimer up (IOuM) IuIPrimer down (10 uM) IuldNTP mix (I OMin each) I ul
10*Taq reaction Buffer5ul
Taq (5u/ul)0.25 ul
加水至50ul2. PCR程序设定预变性98°C 5mim;循环95°C 35S, 55°C 35S, 72°C 40s, 35 个循环，延伸8min3. PCR产物电泳图谱如图IA所示。4. DNA琼脂糖切胶纯化由PCR产物电泳结果切割DNA目的条带，纯化方式按照上海生工生物工程技术服务有限公司的UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒描述方法进行操作。(I)从琼脂糖凝胶中回收DNAa)通过琼脂糖凝胶电泳将目的DNA片段与其它DNA尽可能分开，然后用干净的手术刀割下含需回收DNA的琼脂块，放入I. 5ml离心管中。b)称量凝胶的重量，以Img=Iul换算凝胶的体积。c)按照凝胶浓度,按下表提供的参数加入相应比例的Binding Buffer II
权利要求
1.一种枝孢霉菌，保藏号为CGMCC No :5782。
2.一种紫金牛叶杆菌，其保藏号为CGMCC No 57830
3.—种处理油田压裂返排液的微生物复合菌剂，其特征在于含有胍胶、KH2PO4、K2HPO4 'MgSO4、CaCl2 ,NaCl和水，在IL所述的水中，含有0. Ig 5g的胍胶、0. 05g Ig的 KH2P04、0. 05g 2g 的 K2HP04、0. Olg 0. Ig 的 MgS04、0. Olg 0. 5g 的 CaCl2 和 0. Olg-.0. 2g的NaCl，还加入有保藏号为CGMCC No :5782和CGMCC No :5783的菌株，所述的CGMCCNo 5782菌株的接种体积为IL水的2. 50% 12. 5%，所述的CGMCC No :5783菌株的接种体积为IL水的0. 833% 7. 5%。
4.一种制备权利要求3所述的处理油田压裂返排液的微生物复合菌剂的方法，其特征在于将保藏号为CGMCC No :5782的枝孢霉菌菌株和保藏号为CGMCC No :5783的紫金牛叶杆菌菌株分别放入两个培养基中进行摇床培养，所述的培养基由水组成，每升水中含有.0. Ig 5g 的胍胶、0. 05g Ig 的 KH2P04、0. 05g 2g 的 K2HP04、0. Olg 0. Ig 的 MgSO4'.0. Olg 0. 5g的CaCl2和0. Olg 0. 2g的NaCl，培养时间为3 10天，培养温度为5 .30°C，然后再向装有上述培养基的两个反应器中按照体积百分比为5% 15%的接种量分别接种上述两个菌种，连续培养8 48h，得到液体菌液，然后将含有枝孢霉菌的液体菌液和含有紫金牛叶杆菌的液体菌液按照体积比为I 5:1的比例进行复配，得到微生物复合菌剂。
5.一种培养基，由水组成，其特征在于每升水中含有0. Ig 5g的胍胶、0. 05g Ig的 KH2P04、0. 05g 2g 的 K2HP04、0. Olg 0. Ig 的 MgS04、0. Olg 0. 5g 的 CaCl2 和 0. Olg-.0. 2g 的 NaCl。
全文摘要
本发明提供了一种枝孢霉菌，保藏号为CGMCC No5782。还提供了一种紫金牛叶杆菌，保藏号为CGMCC No5783。还提供了含有上述两种菌株的处理油田压裂返排液的微生物复合菌剂，还提供了上述复合菌剂的制备方法，将上述两种菌株分别放入两个特定的培养基中进行摇床培养，然后再向装有上述特定培养基的两个反应器中按体积百分比5%～15%的接种量分别接种上述两个菌种，连续培养8～48h，得到液体菌液，然后将培养好的液体菌液按照枝孢霉菌和紫金牛叶杆菌体积比为1～5:1的比例进行复配，得到微生物复合菌剂。本发明可有效的解决油田压裂返排液中大分子有机化合物难降解的缺点，减少了对环境的二次污染。
文档编号C02F103/10GK102776128SQ20121026464
公开日2012年11月14日 申请日期2012年7月27日 优先权日2012年7月27日
发明者单煜巽, 张方元, 李松棠, 王婷婷, 陈宏宇 申请人:安洁士石油技术(上海)有限公司