一种清除水体有机污染物的转基因复合型水蕹菜的培育方法
【专利摘要】本发明公开了一种清除水体有机污染物的转基因水蕹菜的培育方法；本发明首先将含有cyp2e1基因的质粒载体转入发根农杆菌，利用发根农杆菌转基因法在活体植株上获得转cyp2e1基因的毛状不定根，进而获得含有cyp2e1基因毛状根的复合型转基因水蕹菜，利用这种复合型转基因植株对水体有机污染物进行吸收。
【专利说明】一种清除水体有机污染物的转基因复合型水蕹菜的培育方 法 (一）
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种水体有机污染物的去除方法，特别涉及一种清除水体有机污染物 的转基因复合型水蕹菜的培育方法。 (二）
【背景技术】
[0002] 水蕹菜（Ipomoea aquatica Forsk)属旋花科草本植物，俗称竹叶菜，有水生和旱 生两种生态类型。水蕹菜可以一次栽种、多次收割，从而把营养物质直接从污染水体中去除 而不产生二次污染。
[0003] 有学者研究了水蕹菜在水体净化方面的功能。李欲如等在苏州重污染河道上种 植水蕹菜以控制水体水质污染。不仅进行了静态试验，而且在重污染河道苗家河上作了 示范应用。静态试验结果表明在气温35°C、水温30°C以上的条件下，水蕹菜对重污染水体 中利用高锰酸盐指数法测定的化学需养量浓度（COD sfa)、总氮浓度（TN)、NH4+-N、总磷浓度 (TP)的去除率分别为37. 0%、92. 9%、93. 9%、94. 3% ;苗家河示范工程水域中水质有明显 改善，透明度可达90-130cm，认为水蕹菜是对苏州重污染河道净化处理的优良生物材料之 一（李欲如，操家顺，徐峰，周金余.水蕹菜对苏州重污染水体净化功能的研究.环境 污染与防治，2006, 28(1) :69-71)。操家顺等报道了水蕹菜对重污染河道净化及克藻功能， 结果与李欲如等的报道相似（操家顺，李欲如，陈娟.水蕹菜对重污染河道净化及克藻 功能.水资源保护，2006, 22 (2): 36-41)。顾国平等采用浮床种植水蕹菜等6种陆生植物， 初步研究了浮床种植植物对景观水体中主要养分氮、磷的去除动态及效率，结果表明，以水 蕹菜去除效果最佳。水蕹菜能够大量吸收N、P营养提供自身生长所需，在试验进行的第6d 及第IOd可分别使试验水体的TN、TP去除率达到100%，对改善水质、修复水体具有重要 作用（顾国平，周丽燕，王森.空心菜对景观水中氮磷的去除效果研究初报.安徽农学 通报，2008, 14(19) : 111-112)。黄婧等研究了浮床水培水蕹菜的生物学特性及水质净化效 果，结果显示，水蕹菜以总氮计，Im2的水蕹菜可以把73. 06m3的水由V类净化到III类；以总 磷计，则可净化134. 73m3的水，因此，水蕹菜与其他水培植物相比具有较强的N、P吸收力， 是一种可用于富营养化水体水质净化的优良植物（黄婧，林惠凤，朱联东，李兆华.浮 床水培蕹菜的生物学特征及水质净化效果.环境科学与管理，2008, 33(12) :92-94)。宋超 等利用PVC管构建浮床，研究了浮床栽培水蕹菜对罗非鱼养殖池塘水体中N和P的控制效 果。数据表明，在试验后期，池塘水体中总氮水平降至淡水养殖池塘废水排放二级标准，而 总磷水平达到地表水环境质量二类标准，氨氮的水平控制在lmg/L以下，而亚硝酸盐氮水 平则控制在0. lmg/L以下。从各处理组对污染物的去除情况来看，水蕹菜种植时间与种植 面积均与N、P的去除效果呈现较好的正相关关系，种植时间越长（>60天），种植面积与去 除效果的正相关性越明显。结果表明，在集约化养殖池塘中采用浮床栽培水蕹菜能够对氮 和磷实现有效的控制，并且，水蕹菜浮床覆盖率为20%时比10%和15%处理组更具有经济 效益（宋超，陈家长，戈贤平，吴伟，范立民，孟顺龙，胡庚东.浮床栽培空心菜对罗非 鱼养殖池塘水体中氮和磷的控制.中国农学通报，2011，27 (23): 70-75)。唐莹莹等报道在 塑料水箱中水培水蕹菜，研究浮床水蕹菜对氮循环细菌数量、分布和氮素净化效果的影响。 研究结果表明，浮床水蕹菜氮循环细菌总数、氨化菌、亚硝化菌、硝化菌数量极显著高于空 白对照；而浮床水蕹菜反硝化菌数量与空白对照差异不显著；氨化菌在根内、根面、水体中 的分布差异不大，亚硝化菌主要分布在根内和根面，硝化菌主要分布在根面，反硝化菌主要 分布在水体中。试验结束时，浮床水蕹菜系统和空白对照对氨氮的去除率分别为91. 8%和 88. 5%。浮床水蕹菜系统中氮素的去除是植物吸收、根系表面的氨化作用、以及水体中硝化 和反硝化共同作用的结果，而空白对照系统中氮素的主要去除途径是微生物的硝化和反硝 化作用以及氨挥发（唐莹莹，李秀珍，周元清，贾悦，辛在军，孙永光.浮床空心菜对 氮循环细菌数量与分布和氮素净化效果的影响.生态学报，2012, 32(9) :2837-284)。杨文 婕和刘更另分析了磷和硫对水蕹菜吸收砷的影响，结果显示，微量的砷有利于水蕹菜生长， 而过量的磷和硫阻抑砷这种有益效应的发挥（杨文婕，刘更另.磷和硫对空心菜吸收砷 的影响.环境化学，1995, 15(4) :374-379)。此外，任朋娟等研究两性表面活性剂BS-12和 Cd2+共存对水蕹菜种子萌发、叶绿素含量及MDA含量等的影响。结果表明，BS-12为50mg/ L时，能降低Cd2+对水蕹菜种子萌发的毒害作用（任朋娟，孟昭福，马云飞，袁进，郭彩 虹，樊利，赵贤.BS-12与Cd 2+复合污染对空心菜种子萌发及生长的影响.西北农业学 报，2011，20(4) :129-133)。
[0004] 上述有关水蕹菜的修复作用仅限于对N、P和重金属的污染修复，未见其具有修复 有机污染物的研究报道。
[0005] 细胞色素 P450酶是一类与重金属结合的血红蛋白，在代谢异源有机物方 面起着重要作用；其中，P450酶家族成员之一 P4502E1(CYP2E1，其编码基因简称为 cyp2el)，主要分布在哺乳动物肝细胞中，对有机污染物具有非常重要的解毒功能（Lee SSj Buters JTj Pineau Tj Fernandez-Salguero Pj Gonzalez FJ. Role of CYP2Elin the hepatotoxicity of acetaminophen. J Biol Chem，1996,271 (20):12063-12067)。
[0006] 为此，本发明利用发根农杆菌转基因技术将cyp2el基因转入水蕹菜中，有效提高 水蕹菜对有机污染的修复能力，进一步提高水蕹菜对水体复合污染的综合修复能力。 (三）
【发明内容】
[0007] 本发明目的是提供一种清除水体有机污染物的转基因复合型水蕹菜的培育方法。
[0008] 本发明采用的技术方案是：
[0009] 本发明提供一种清除水体有机污染物的转基因复合型水蕹菜的培育方法，所述方 法包括：（1)无菌苗的培养：将水蕹菜种子消毒后接种在1/2MS(0)培养基上，22±2°C，光 照培养至萌发小苗，剪取靠顶端的带叶茎段作为外植体，然后将外植体转入含〇. 5-2. Omg/ L 6-BA+O. 25mg/L IAA的MS培养基上，22±2°C，光照培养，获得无菌苗；（2)侵染菌液：将 含有核苷酸序列为SEQ ID NO: 1所示cyp2el基因的质粒导入发根农杆菌，筛选得到抗性菌 落；将抗性菌落活化后接种至含Km 50mg/L+Str 50mg/L的LB液体培养基中，28°C，200r/ min培养至0D_为0. 4-0. 6,离心，沉淀用MS液体培养基悬浮清洗3次，离心去除清洗液， 沉淀用MS液体培养基悬浮，离心去除清洗液（重复清洗3次）后，沉淀再用MS液体培养基 悬浮，制成光密度OD值为0. 1-0. 2菌悬液，作为侵染菌液；(3)转基因植株的获取：将步骤 (1)培育的无菌苗转入1/2MS(0)培养基上，22±2°C，光照培养至株高5. 5-6cm时在植株的 茎上刺出伤口，然后将步骤（2)制备的侵染菌液滴加在植株的伤口处，22±2°C，光照培养， 获得转基因毛状不定根；(4)转基因植株：当步骤（3)获得的毛状不定根长达5-6cm时，将 着生有毛状不定根的茎与原植株分离剪断并保留完整的毛状不定根的茎（即将原始的野 生根系剪掉），将着生有毛状不定根的茎（即将毛状不定根作为根系进行栽培）直接插入含 琼脂0.6wt%的1/2MS(0)的培养基中，22±2°C，光照继续培养10-15天，然后打开瓶盖练 苗2-3天，取出洗去根部的琼脂，转移至1/2MS液体培养基中生长，即获得转基因复合型水 蕹菜（所述转基因复合型水蕹菜是指植株的毛状根含有cyp2el基因，茎叶为侵染前的原始 结构）。
[0010] 进一步，步骤（1)所述水蕹菜种子消毒方法为：将水蕹菜种子进入体积浓度〇. 1% 氯化汞水溶液中，消毒7. 5min。
[0011] 进一步，步骤（1)所述无菌苗培养所用培养基为含〇.5mg/L 6-BA+0.25mg/L IAA 的MS培养基。
[0012] 进一步，本发明所述含有核苷酸序列为SEQ ID N0:1所示cyp2el基因的质粒可自 行构建，本发明优选步骤（2)所述质粒为pSLD50-6。
[0013] 进一步，步骤（2)所述发根农杆菌为发根农杆菌K599。发根农杆菌是一种革兰氏 阴性菌，能侵染大多数的双子叶植物、少数单子叶植物及个别的裸子植物，诱发被感染植物 的受伤部位长出毛状根。
[0014] 进一步，步骤（2)抗性菌落按如下方法制备：在发根农杆菌K599感受态细胞中加 入含cyp2el基因的质粒，混勻后冰上放置IOmin,置于液氮速冻5min，28°C水浴热激5min， 加入LB液体培养基于28°C振荡培养2h后，取菌液涂布于含Km 50mg/L+Str 50mg/L的LB 液体培养基中，28°C，200r/min培养至0D_为0. 4-0. 6,离心，取湿菌体即获得重组发根农 杆菌 K599/pSLD50-6。
[0015] 进一步，步骤（3)所述带有伤口的植株按如下步骤获取：在无菌苗茎高l-3cm处用 无菌针尖刺入，形成伤口。
[0016] 进一步，所述水体有机污染物为苯或三氯乙烯。
[0017] 本发明所述水蕹菜为各种基因型的水蕹菜,优选农家水蕹菜、柳叶水蕹菜、宽叶水 蕹菜、泰国水蕹菜，更优选柳叶水蕹菜。
[0018] 本发明所用培养基的组成为：所述1/2MS(0)培养基组成为：即MS培养基不添加 任何植物激素、且营养成分减半。所述MS培养基组成为：参见文献：Murashige T，Skoog F A.revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue culture. Physiol Plant，1962，18:100-127。所述LB液体培养基组成为：5g/L酵母膏，lOg/L蛋白 胨，10g/L NaCl，溶剂为蒸馏水，pH值为7. 5。所述1/2MS液体培养基组成为：MS液体培养 基不添加任何植物激素、且营养成分减半的液体培养基。
[0019] 本发明首先将含有cyp2el基因的质粒转入发根农杆菌K599,利用农杆菌转基因 法获得转cyp2el基因毛状根的复合型转基因植株。当转基因毛状根长达5-6cm时，将着生 有毛状根的茎的下部剪去，将着生有毛状根的茎直接插入含琼脂〇.6wt%的1/2MS(0)的培 养基中，继续培养10-15天，然后打开瓶盖练苗2-3天，取出洗去根部的琼脂，转移至1/2MS 液体培养基中生长，即获得含转cyp2el基因毛状根的复合型水蕹菜植株。经PCI^PqRT-PCR 进行cyp2el基因表达分析，毛状根中cyp2el基因能够继续正常的表达。测定转基因再生 植株对水体有机污染物的吸收情况，将转基因再生植株置于含有苯或三氯乙酸的1/2MS培 养基中，水培7天后培养液中剩余的苯和三氯乙烯的含量均近0,而对照水培非转基因植株 的培养液中，苯和三氯乙烯的含量分别为6. 20 ±0. 015 μ g/mL和11. 31 ±0. 037 μ g/mL，表 明含cyp2el基因的水蕹菜提高了对水体有机污染物的抗性，并且能高效吸收水体中的有 机污染物。
[0020] 本发明的有益效果主要体现在：本发明方法获得的水蕹菜可有效清除水体中有机 污染物，尤其是苯和二氣乙稀，有效提1?水雍菜对有机污染的修复能力，进一步提1?水雍菜 对水体复合污染的综合修复能力。 (四）
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1为柳叶水蕹菜外植体组培苗发育情况。
[0022] 图2为组培苗转基因毛状根的诱导情况。
[0023] 图3为毛状根进行PCR扩增鉴定的凝胶电泳图，泳道1为DNA标准分子量 (DS2000)，泳道2为-泳道6为毛状根根系平行实验，泳道7为野生型水蕹菜根系，泳道8 为质粒PSLD50-6。
[0024] 图4为普通根（非转基因根）和转基因毛状根中cyp2el基因表达情况。
[0025] 图5为转基因水蕹菜吸收水体有机污染物的情况，A为在含苯的培养液中培养，B 为在含三氯乙烯的培养液中培养。 (五）
【具体实施方式】
[0026] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0027] 实施例1水蕹菜组织培养快速繁殖无菌苗
[0028] (1)选择农家水蕹菜、柳叶水蕹菜、宽叶水蕹菜、泰国水蕹菜等不同的基因型的种 子作为实验起始材料。
[0029] (2)选择不同的消毒方法对种子进行消毒，消毒后种子污染情况见表1，0. 1%氯 化汞是指质量浓度〇. 1 %氯化汞水溶液，75 %酒精为体积浓度75 %乙醇水溶液，20 %次氯 酸钠为质量浓度20%次氯酸钠水溶液，结果表明：利用0. 1 %氯化汞消毒7. 5min对种子的 消毒效果最佳，无污染，而且柳叶水蕹菜的发芽率最高。
[0030] 表1种子消毒
[0031]
【权利要求】
1. 一种清除水体有机污染物的转基因复合型水蕹菜的培育方法，其特征在于所述方法 包括：⑴无菌苗的培养:将水蕹菜种子消毒后接种在1/2MS(0)培养基上，22±2。。，光照 培养至萌发小苗，剪取靠顶端的带叶茎段作为外植体，然后将外植体转入含0. 5?2. Omg/L 6-BA+O. 25mg/L IAA的MS培养基上，22±2°C，光照培养，获得无菌苗；（2)侵染菌液：将含有 核苷酸序列为SEQ ID N0:1所示cyp2el基因的质粒导入发根农杆菌，筛选得到抗性菌落； 将抗性菌落活化后接种至含Km 50mg/L+Str 50mg/L的LB液体培养基中，28°C，200r/min 培养至0D_为0. 4-0. 6,离心，沉淀用MS液体培养基悬浮，离心去除清洗液后再用MS液体 培养基悬浮，制成光密度OD值为0. 1-0. 2菌悬液，作为侵染菌液；（3)转基因植株的获取： 将步骤（1)培育的无菌苗转入1/2MS(0)培养基上，22±2°C，光照培养至株高5. 5-6cm时在 植株的茎上刺出伤口，然后将步骤（2)制备的侵染菌液滴加在植株的伤口处，22±2°C，光 照培养，在伤口处获得转基因毛状不定根；(4)转基因复合型植株：当步骤（3)获得的毛状 不定根长达5-6cm时，将着生有毛状不定根的茎与原植株分离剪断并保留完整的毛状不定 根的茎，然后将着生有毛状不定根的茎直接插入含质量浓度0.6%琼脂的1/2MS(0)的培养 基中，22±2°C，光照培养10-15天，然后打开瓶盖练苗2-3天，取出洗去根部的琼脂，转移至 1/2MS液体培养基中生长，即获得转基因复合型水蕹菜植株。
2. 如权利要求1所述清除水体有机污染物的转基因水蕹菜的培育方法，其特征在于所 述步骤（1)所述水蕹菜种子消毒方法为：将水蕹菜种子进入体积浓度〇. 1%氯化汞水溶液 中，消毒7. 5min。
3. 如权利要求1所述清除水体有机污染物的转基因水蕹菜的培育方法，其特征在于所 述步骤（1)所述无菌苗培养所用培养基为含〇. 5mg/L 6-BA+O. 25mg/L IAA的MS培养基。
4. 如权利要求1所述清除水体有机污染物的转基因水蕹菜的培育方法，其特征在于所 述步骤（2)所述质粒为pSLD50-6。
5. 如权利要求1所述清除水体有机污染物的转基因水蕹菜的培育方法，其特征在于所 述步骤（2)所述发根农杆菌为发根农杆菌K599。
6. 如权利要求1所述清除水体有机污染物的转基因水蕹菜的培育方法，其特征在于步 骤（2)抗性菌落按如下方法制备：将含cyp2el基因的质粒导入感受态发根农杆菌K599细 胞，构建重组发根农杆菌K599/pSLD50-6。
7. 如权利要求1所述清除水体有机污染物的转基因水蕹菜的培育方法，其特征在于步 骤（3)所述带有伤口的植株按如下步骤获取：在无菌苗茎高l_5cm处用无菌针尖刺入，形成 伤口。
8. 如权利要求1所述清除水体有机污染物的转基因水蕹菜的培育方法，其特征在于所 述水体有机污染物为苯或三氯乙烯。
【文档编号】C02F3/32GK104313050SQ201410493727
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年9月24日 优先权日:2014年9月24日
【发明者】孙扬, 向太和, 韩依萱, 王嫚, 宋亚玲, 吴玲 申请人:杭州师范大学