一种基于土壤微生物群落基因丰度变化分析的厌氧石油烃降解的方法

本发明属于土壤优化的，具体涉及一种基于土壤微生物群落基因丰度变化分析的厌氧石油烃降解的方法。

背景技术：

1、土壤60厘米以下深度多采用无氧或者厌氧降解反应；原因在于这个深度以下的部位氧的供给有限，养分压明显降低。土壤深处的石油烃下渗，且接触氧气十分有限，所以石油烃类污染物的降解修复普遍采用无氧降解。

2、根据土壤理化性质分析发现，土壤中石油污染晕内的微生物为了对抗化学胁迫而将营养物质迅速消耗，按基因丰度变化需求添加营养物质有助于降解反应的进行。

3、土壤微生物群落本身就是一个巨大的反应物和基因多样性储存池。利用illuminahiseq平台的宏基因组测序方法分析污染土壤的微生物群落演替特征，能够更加有效地从巨大的储存池中识别参与的微生物类群、种类、基因表达情况等，分析主要污染物降解的规律。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供了一种基于土壤微生物群落基因丰度变化分析的厌氧石油烃降解的方法，结合当地土壤条件与披碱草生长特点，通过研究生物炭、膨润土和有机肥的不同施用量组合对披碱草各生育期生长指标和生理指标的影响，探讨施用生物炭、膨润土和有机肥对披碱草各生育期生长发育与生理特性影响的内在机制，确定生物炭、膨润土和有机肥的最佳施用量，为促进披碱草生长和生理特性，提高风沙地土壤改良效果，促进生态和经济效益，减少资源浪费提供科学合理的理论依据。

2、为了解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案来实现：一种基于土壤微生物群落基因丰度变化分析的厌氧石油烃降解的方法，包括以下步骤：

3、步骤一、分析土壤石油烃厌氧降解过程中微生物群落内基因丰度变化趋势；

4、步骤二、根据基因丰度变化趋势选择营养添加物与两种机制同时驱动策略；

5、步骤三、获得土著混合微生物；

6、步骤四、构建石油污染土壤的新降解体系。

7、作为优选，所述步骤一包括：

8、首先获得genbank中检索号为srr21614648、srr21614647、srr21614643、srr21614642、srr21614644、srr21614641、srr21614640、srr21614639、srr21614638、srr21614637、srr21614636、srr21614646、srr21614645的土壤宏基因组学测序数据；

9、其次，围绕苯以及石油烃类物质无氧代谢途径，代谢途径包括ko00625、ko00627、ko00361和ko00363；

10、再次，选择关键酶基因，主要基因是苯环无氧降解开环基因和烷烃活化基因；

11、最后，着重列表分析其在常温对照和常温降解组之间的基因丰度变化趋势，并计算丰度变化数值。

12、进一步的，所述步骤三中，采集原位土壤作为土著修复微生物的出发菌株，以苯酚作为降解性微生物的诱导剂获得目的性水解酶，苯酚浓度设置为200～400mg/l；培养基采用改良型starkey培养基以获得化能自养和化能异养型微生物；改良成份在于：抗坏血酸0.1～0.2g/l；乳酸钠2.0～4.0ml/l；酵母膏1.0～2.0g/l；0.5～2.0g/l、胰蛋白胨0.5～3.0g/l；其余成分为普通starkey培养基。

13、优选的，所述步骤四中，新降解体系有以下四项成分：100±20g石油烃污染土、含有降解酶的诱导型土著混合微生物、牛粪土15～20g以及氧化剂0.1％～0.3％w/w的kmno4；实验室自然条件下15～25℃进行28～35天降解，在此期间，每7天揉捏自封袋中的污染土样，使土著微生物与实验土样充分混合均匀。

14、与现有技术相比，本发明的基于土壤微生物群落基因丰度变化分析的厌氧石油烃降解的方法的有益效果如下：

15、1、利用苯酚从改良型的starkey培养基中诱导富集混合土著微生物，获得了具有无氧苯环切割(6-氧环己-1-烯-1-羰基coa或者酰基coa)水解酶、琥珀酸合成酶等厌氧混合微生物；利用这些含有目的酶的微生物对石油烃进行全面的厌氧降解，通过测定降解率确定其修复降解能力以完成频发的油库油罐滴漏和渗漏对土壤环境造成的污染，使土壤生态环境尽快恢复。

16、2、本发明创新性地提出继续采用基于土壤内在微生物群落组学分析的新降解的方法，完成石油烃的持续降解，依据基因丰度变化规律，按需添加营养物。

17、3、本发明以土壤修复系统内基因丰度变化趋势为依据同时驱动降解机制和响应机制快速运行，本降解修复方法以生物修复为基础，无二次污染，堆肥物质可以让残留的石油烃完成可持续性降解。

技术特征：

1.一种基于土壤微生物群落基因丰度变化分析的厌氧石油烃降解的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的基于土壤微生物群落基因丰度变化分析的厌氧石油烃降解的方法，其特征在于，所述步骤一包括：

3.如权利要求1所述的基于土壤微生物群落基因丰度变化分析的厌氧石油烃降解的方法，其特征在于，所述步骤三中，采集原位土壤作为土著修复微生物的出发菌株，以苯酚作为降解性微生物的诱导剂获得目的性水解酶，苯酚浓度设置为200～400mg/l；培养基采用改良型starkey培养基以获得化能自养和化能异养型微生物；改良成份在于：抗坏血酸0.1～0.2g/l；乳酸钠2.0～4.0ml/l；酵母膏1.0～2.0g/l；0.5～2.0g/l、胰蛋白胨0.5～3.0g/l；其余成分为普通starkey培养基。

4.如权利要求1所述的基于土壤微生物群落基因丰度变化分析的厌氧石油烃降解的方法，其特征在于，所述步骤四中，新降解体系有以下四项成分：100±20g石油烃污染土、含有降解酶的诱导型土著混合微生物、牛粪土15～20g以及氧化剂0.1％～0.3％w/w的kmno4；实验室自然条件下15～25℃进行28～35天降解，在此期间，每7天揉捏自封袋中的污染土样，使土著微生物与实验土样充分混合均匀。

技术总结
本发明公开了一种基于土壤微生物群落基因丰度变化分析的厌氧石油烃降解的方法，包括以下步骤：步骤一、分析土壤石油烃厌氧降解过程中微生物群落内基因丰度变化趋势；步骤二、根据基因丰度变化趋势选择营养添加物与两种机制同时驱动策略；步骤三、获得土著混合微生物；步骤四、构建石油污染土壤的新降解体系。本发明以土壤修复系统内基因丰度变化趋势为依据同时驱动降解机制和响应机制快速运行，本降解修复方法以生物修复为基础，无二次污染，堆肥物质可以让残留的石油烃完成可持续性降解。

技术研发人员：李宏伟,毛晓双,江晓旭
受保护的技术使用者：辽宁工程技术大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15