专利名称：用于可控操纵小体积的微流控装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种精密加工的流控装置，特别是涉及为成形和输送材料的一系列微小体积部分，以及为对其进行存贮、回取和分析而制造的装置，本发明还涉及形成、输送、存储和回取这一系列微小体积部分的方法。
背景技术：
在过去几年中已经论证了多种精密加工的初级流控装置。虽然这些流控装置中许多是非常简单的，但已经证明它们在所述的许多实际应用中是有效的，而且可能革新生化分离的方法。大多数的论证都包括将已知的化学测量技术，例如电泳或液体色谱转移到精密加工的平台上。这类论证表明，精密加工的分离装置，对于改进从这类实验中收集信息的时间和成本是十分重要的。然而，这些已知的装置还没有利用能使这类精密加工装置成为可能的实验方法。我们相信，通过在微流体控制方面的改进将会出现一些新的更有效的生物化学实验方法的范例。
最受瞩目的精密加工的流控技术领域是电动驱动方法。对于使试剂混合和反应、试样的注入和分配、以及化学分离过程，已经论证了电动流体控制。许多研究组织已经论证了如毛细管电泳(CE)、敞开式通道电色谱法(OCEC)、和细胞电动毛细管色谱法(MEKC)之类用电驱动的分离技术。采用微型芯片毛细管凝胶电泳与激光诱导荧光检测配合，能测量出dsDNA碎片和后继产物的大小。采用DC和脉冲电场的后置阵列研究了少数常规电泳分离。此外，已采用结合和未结合标记抗原的微型芯片电泳分离论证了基于荧光的有竞争性的免疫测定。在所有研究的情况下，这些微型装置都已经显示出与常规实验室装置有相当的或比其更好的操作性能，看来能同时提供“更好-更快-更便宜”的罕见结合。微型芯片分离装置的速度比常规方法快一至几个数量级的优点。在受扩散限制的条件下，电泳分离的效率与试样所受的电压降成正比。在分离距离短时，由于产生的注入柱塞轴向距离较窄，采用微型芯片可以达到这些扩散的极限条件。在施加恒定的电位时，分析的时间随分离距离呈二次方下降，这是基于微型芯片的电泳分离的主要优点。
基于微型芯片的化学分离的其它显著优点是可以分析的体积小、能整体积成试样的处理和分析，和使可能进行大量平行分析的反复试验的成本低。所有这些因素都与分析处理能力高以及产生生化信息的成本下降和时间缩短是一致的。论证试样处理集成的早期努力包括将氨基酸衍生物的后分离和预分离与电泳分离相结合。已将芯片上DNA限制消化和PCR放大与采用集成的整体微型芯片进行电泳碎片尺寸测定相结合。在单一装置中对含大肠杆菌的血浆进行细胞溶解、多路PCR、和CE分析。还论证了在包含多个反应池的芯片上平行进行多个试样的PCR/CE分析。此外，还采用微型芯片装置进行一些有竞争性的免疫测定实验，这种微型芯片装置包括试样与试剂混合、培育、和电泳分离的流控元件。与电驱动分离相结合的其它精密加工的流控元件包括用于质谱分析的电雾化电离、采用多孔膜元件的试样浓缩、和固相萃取。还论证了只采用电动输送进行化学和生物化学反应的装置。一些实例包括酶反应动力学、酶测定、有机合成、和细胞控制装置。实际上所有这四种应用最终对实验生物学都是相当重要的，但当时对这四种应用的研发还不够充分。
已经论证了采用液压力进行流体输送的多种精密加工的流控装置。虽然液压力的应用，比电动现象可适用于更宽范围，但实施起来一般不太方便。与用于液压驱动的流动的微型芯片的外部连接比施加电位更加麻烦。而且，电动的驱动力是伴随电流流动产生的，因此通过对这类支管的末端施加压力或真空，能对在微通道支管内的输送过程进行更大程度的控制。电动力还能比液压力产生高得多的有效压力。所论证的液压驱动装置的性能，看来低于电动驱动装置的性能。尽管如此，也还是报道了许多重要的性能。
进行PCR的微型流控装置已经受到相当大的关注。早期的装置只包括一些在硅上加工的室以起试样贮池的作用，而后来的装置则利用硅构件进行电阻加热，或利用集成过滤器离析白血球。最近报道了一种有利的连续流动的PCR装置，该装置利用弯弯曲曲穿过温度区域的单微通道进行热循环。已采用精密加工将处理细胞材料的过滤器引入硅基片。还采用精密加工将血细胞记数装置引入硅和玻璃基片，并采用液压驱动。
“芯片上”控制试剂和反应产物的能力，表明了采用精密加工的装置实际进行任何类型“湿化学”台架程序的最终能力。将实验室搬到微型芯片上的转变范例包括减少试剂体积、不采用任何移动部件的自动化或材料控制、降低投资费用、更多的平行处理、和较高的处理速度等优点。采用上述讨论的微型流控构件控制或配送的流体体积，为纳升或小于纳升规模，而实验室规模为几十μ1，相当于降低三个数量级或更多。在已经研究的这些装置上的流量，连续操作为约1ml/yr。通过在单一装置上实现多路处理(垂直集成)，可在计算机的控制下，有效和自动地控制各个过程的这些小流体参数。操作人员只需装入被分析的试样。显然，通过在同一个装置上重复配置精密加工的构件，例如一些平行的分离通道，可将多个分析步骤的这种顺次集成，与处理能力的平行扩大结合起来。
虽然所说的“芯片实验室”(Lab-on-a-Chip)看起来大有希望，而且相信它们能够满足其中的许多希望，但为了达到与在微电子学领域实现的微型化程度相应的影响水平，尚需进一步研究。为了在今后十年中，使“芯片实验室”装置在精致化或处理能力方面再上一个台阶，至少还必须阐明四个重要的问题。这些问题是先进的微流控制、“外界与芯片”(world-to-chip)的接口、检测、和可行的制造对策。目前，流体在微通道构件中的电动控制，代表着高精密受控小体积处理方面的技术状态。为使材料沿着所需的路径移动的对策就是控制在每个通道终端上与时间有关的电位。虽然在简单的设计中，这种对策对用阀门调节流量和进行混合是非常有效的，但当设计比较复杂时，这种对策在适用性和操作性能方面却受到限制。我们相信，对于这些比较复杂的构件，在微通道的设计方面，需要一些能在多点控制电位的新对策。在能被控制的溶液和材料的类型方面，电动输送也有一些限制。
外界与芯片的接口是指将多个试样或试剂输送到微型芯片上，以解决高分析处理能力的问题而规定的术语。虽然能在短至毫秒钟内分析一个给定的试样，但目前还不能以这样的速率向微型芯片装置提供多个试样。迄今为止，虽然针对这个问题所做的研究还非常少，但它却是实现超高处理能力实验的主要障碍。
发明概述按照本发明的第一个方面，提供一种在流控微型芯片上形成和输送材料的一系列微小体积部分(≤nl(纳升))的方法，其中的每部分体积都被分隔材料所分开。这种方法包括形成第一和第二个通道的一些步骤，第一通道具有一个与输送流体源连接的入口端，和一个与流体贮池连接的出口端，第二通道具有一个与分隔流体源连接的入口端，和一个与所述第一通道相连接的出口端。将一个微小体积的分隔流体吸入第一通道，并在第一通道中将其输送到流体贮池。重复向第一通道吸入和输送分隔流体微小体积的步骤，在分隔流体体积之间形成一系列的输送流体体积和/或分析体积。可将试剂、细胞、或反应珠体注入或插入输送流体体积，形成一系列的测定或分析体积。按顺序方式输送这些测定或分析体积，为存储和回取进行顺序登记，供以后在微型芯片上进行分析或进行其它操作。
按照本发明的另一个方面，提供一种形成和输送材料的一系列微小体积部分的装置。该装置是一种进行流控的微型芯片，其中具有在基片上形成的第一和第二个微通道。第一微通道具有一个与输送流体源连接的入口端，和一个与流体贮池连接的出口端。第二微通道具有一个与分隔流体源连接的入口端，和一个与第一微通道相连接的出口端。在第一微通道和第二微通道出口端之间的第一微通道内，设置多个电极。在所述第一微通道入口端和所述第二微通道之间的所述第一微通道内，设置第二组多个电极。该装置还包括下列装置(i)将一个体积的分隔流体从第二微通道插入第一微通道的装置，从而置换出包含在第一微通道内的输送流体，(ii)停止第一微通道内分隔流体体积的输送，和然后(iii)将在第一微通道内交替的输送和分隔的体积输送到流体贮池。
根据本发明的装置的另一些实施方案，包括辅助通道、试剂源、试剂稀释剂、细胞、和/或反应颗粒，将这些材料插入被顺序的各对分隔流体体积形成的各个输送体积中。在这些实施方案中，还包括输送试剂、细胞、和/或反应颗粒的装置。在一个优选的装置中，第一微通道包括一个或多个环路，对反应体积进行顺序的存储，供以后检索、分析、或操作。
附图简述在结合附图阅读本申请时，会更好地理解前面的概述和下面的详细说明。在附图中
图1A、1B和1C是按照本发明的一个方面，在将一个分隔流体体积插入包含输送流体的微通道中时，表示步骤顺序的微型芯片局部示意图；图2是按照本发明的另一个方面，表示在将试剂加入微通道中的分隔流体体积各交替对之间的各个输送体积的微型芯片的局部示意图；图3是按照本发明的另一个方面，表示在微通道内的分隔流体体积各交替对之间装入一些颗粒的微型芯片的局部示意图；图4是按照本发明的另一个方面，表示以顺序方式将分隔流体、酶、和基质插入微通道中的插入顺序的微型芯片局部示意图；图5是按照本发明的另一个方面，表示以顺序方式将分隔流体、反应颗粒、和试剂流体插入微通道中的插入顺序的微型芯片局部示意图；图6是表示准备一系列酶一珠体测定的装置的微型芯片的局部示意图；图7是表示对一系列细胞、反应颗粒、或试剂体积进行存储和检索的装置的微型芯片的示意图；和图8是研究和鉴定新药品的系统的简图，其中包括图7所示的微型芯片。
详细说明现在参见附图，图中相同的编号系指相同或相似的部件或零件，特别是图1A、1B和1C，图中示出主微通道10。主微通道10基本上是直线型的，具有与输送流体源(未示出)连接的入口12，和与废液贮池(未示出)连接的出口14。分支通道16具有入口18和与主微通道10相交的出口20，用于使分隔或隔离流体22进入主通道10。沿着出口20和出口14之间的主微通道10，在间隔一定距离的一些位置上，设置电极e1、e2、e3、和e4。沿着出口20和入口12之间的主微通道的这侧，在间隔一定距离的位置上，设置电极e5、e6、和e7。所有的电极都与包含在微通道内的流体接触。输送流体，或分隔流体，或二者，在暴露于轴向电场时，均可通过微通道输送。这种作用被称作电动流动，这种作用包括电泳、电渗析和电流体力学输送之类的现象。
对于图1A、1B和1C所示的装置，可以以一系列间隔的微小体积的形式，将分隔流体22插入主微通道10。完成插入分隔流体22的微小体积的步骤基本上如下。用输送流体充满主微通道10。在e1和e2之间施加电源24a的电位，在电极e5和e6之间施加第二个电源24b的电位。选择这些电位的幅度和极性，引导主微通道10中的输送流体按图1A中箭头所指的方向进行电动流动。如图1B所示，输送流体的这种流动，使分隔流体22被吸入主微通道10中。假定分隔流体比输送流体具有较低的电导率，在分隔流体22与桥膜e5发生接触时，电极e5和e6之间的电流下降，流体在该方向的流动停止。然而，分隔流体22却借助于电极e1和e2之间的电位，继续向出口14流动。当主微通道10中吸入所需体积的分隔流体时，通过在电极e6和e7之间施加电源24c的电位，将这个分隔流体体积输送到主微通道10中。选择电极e6和e7之间电位的幅度和极性，引导主微通道10中的输送流体以图1C中箭头所指的方向上进行电渗流动。当分隔流体的体积与桥膜e1发生接触时，电极e1和e2之间的电流下降，流体在该方向上的流动停止。然后在电极e2和e3之间施加电位，继续进行输送流体和分隔流体体积的输送。同样，当分隔流体体积与桥膜e2发生接触时，电极e2和e3之间的电流下降，流体在该方向上的流动停止。然后在电极e3和e4之间施加电位，再继续沿着主微通道10进行输送流体和分隔流体体积的输送。在我们共同未决的专利申请09/244,914中，更详细地叙述了在本发明中所用类型的直线型泵送装置的实际结构和操作，在此引入其说明书全文作为参考。
作为电动输送装置的另一种方案，输送流体的移动，以及在根据本发明的装置或方法中所采用的分隔流体和任何其它材料的注入，都可通过向相应的一个或一些通道施加压力或真空进行。还可以预料，在实现按照本发明的一种给定装置和方法时，如果需要，可以利用电动、压力、和/或真空输送装置的组合。
在分隔体积在主微通道10中通过一段足够的距离以后，重复该过程，以插入另一个分隔体积。如果分隔流体进入主微通道10中的泵送速率不够高，则可将一些类似的电极设置在分支通道16中。
分隔流体优选是一种在输送流体和(一些)反应流体中不溶混的流体。而且分隔流体应该与所使用的生物试剂是生物兼容的。对于反应/输送过程的操作控制而言，分隔流体优选是不导电的。例如，不导电的流体能为以微通道中输送的微小体积的顺序跟踪反应和泵送体积的位置提供方便的途径。此外，分隔流体应对所采用的各种试剂具有最小的化学分配系数。链烷烃和矿物油用作分隔流体是适宜的，因为已经使用它们分离小体积胞外液中的细胞，没有任何有害影响。全氟化碳也是适宜的，因为在要求生物兼容性的场合广泛使用它们。硅油也是另一类适合用作分隔流体的材料。丙烷之类的气体也适合用作分隔流体，但它能溶解在输送或反应流体中，或通过能渗透气体的盖板逸出，因而降低了它们分隔各部分流体的效果。
下面是采用流控微型芯片，对一些以顺序方式的微量材料进行各种操作的一些优选装置的说明。虽然没有结合不同的实施方案示出和说明不同的配置，但这些不同的配置可以包括图1所绘的电触点装置，以提供在各种精密制造的装置的通道中，输送流体材料所需的电位。另外，如上所述，也可以利用压力或真空装置。
根据本发明的方法的一个显著特征，是向主微通道内一系列微小的体积部分中，插入一系列微小反应流体体积的能力。现在参见图2，图中示出控制向主微通道10内一系列反应体积中加入试剂的装置。按上述的间隔距离，将多个分隔流体体积26a、26b、26d和26e插入主微通道10中。试剂通道28具有入口30和与主微通道10相交的出口32，使化学或生物化学试剂34进入主微通道10中。废液通道38在基本上对着出口32的位置上与主微通道10相连接。稀释剂通道40与试剂通道28相连接，使稀释剂能够混入反应流体34中。插入反应流体34的一些微小体积的步骤基本上如下。
通过主微通道10泵送输送流体和分隔流体体积26a、26b、26c、26d、和26e。当一对顺序的分隔流体体积26b和26c接近出口32时，泵送停止，将反应流体34泵入分隔流体体积26b和26c之间的体积。优选使包含在分隔流体体积26b和26c之间的输送流体进入废液通道38中。另外，可以加入或置换输送流体。然后采用电动方法沿主微通道10输送反应流体体积36a。虽然采用静态操作方式说明根据本发明这个方面的方法，但应当承认，将反应流体动力输送到一些反应体积中能提供较高的处理能力。可通过输送流体和反应流体的可控输送进行这种动力操作，以便随反应体积到达出口32而同步注入反应流体。
反应流体体积36a和36b优选包含在分隔流体体积的间隔的顺序对之间。因此，如图2所示，反应流体体积36a包含在分隔流体体积26b和26c之间。而反应流体体积36b包含在分隔流体体积26d和26e之间。这种间隔顺序，能在不使反应流体暴露在轴向电场中的情况下，通过主微通道泵送一些反应流体体积，或在反应流体不承托电动流动的情况下进行输送。换句话说，电位只施加在包含输送流体的各部分上。通过在将试剂注入分隔体积之间的体积之前，将稀释剂混入试剂中的方法，调节反应流体的浓度。以这种方式，可以产生一系列的试剂体积，每个体积都具有不同的浓度。
根据本发明方法的另一个显著特征，是将一系列珠体或细胞之类的反应颗粒，插入主微通道中一系列微小体积部分中的能力。现在参见图3，图中示出分选和装载多个反应颗粒44进入主微通道10内一系列反应体积中的装置。按照上述的间隔距离，将多个分隔流体体积26a、26b、26c、26d和26e吸入主微通道10中。颗粒贮池42，以悬浮液流体的形式包含多个反应颗粒44。将分选颗粒的通道46与贮池42的出口连接以用于接受颗粒44。将一对聚束通道48a和48b与分选颗粒的通道44相连接。聚束通道48a和48b提供聚束流体，使颗粒44向下流动局限在单颗粒宽度的液流中。在我们共同未决的专利申请09/098,178和我们已颁布的美国专利5,858,187中，说明了这种类型的电动聚束作用，在此引入其说明书的全文作为参考。
在聚束通道48a和48b下游的一个位置上，反应颗粒通道50与分选颗粒的通道46相交。在反应颗粒通道50与分选颗粒的通道46相交的位置上，所需的反应颗粒44′与不需要的颗粒44″分离。对通道50的入口50a施加电位或压力，引导颗粒44′沿着通道50进入主微通道10中。反应颗粒通道50，具有与主微通道10连接的出口56，用于使反应颗粒进入主微通道10中。使不需要的颗粒44″沿废颗粒通道52离开，废颗粒通道52是从分选颗粒的通道46延伸出来的。
将反应颗粒44′插入输送液流中的步骤基本上如下。采用电动方式，通过主微通道10泵送输送流体和分隔流体体积26a、26b、26c、26d和26e。当一对顺序的分隔流体体积26b和26c接近出口56时，采用电动方式将具有单颗粒的颗粒悬浮液流体泵入分隔流体体积26b和26c之间的体积中，使其中所含的输送流体进入废液通道38。在这个装置中，按一定尺寸制造废液通道或至少其入口的横截面有一定尺寸，以防颗粒通过废液通道。然后采用电动方式将反应颗粒及其悬浮流体体积沿主微通道10输送到检测/分析通道39。反应颗粒优选包含在分隔流体体积的间隔的顺序对之间。因此，如图3所示，第一个颗粒包含在分隔流体体积26b和26c之间。而第二个颗粒包含在分隔流体体积26d和26e之间。这种间隔顺序，能在不使反应颗粒暴露在轴向电场中的情况下，通过主微通道泵送一些反应流体体积。为此目的，只将电位施加在包含输送流体的各部分上。
采用流控微型芯片精确控制流体流动和试剂混合的能力的本身，导致对酶的活性和其抑制作用的研究。检测酶的微型芯片对药物回收和治疗诊断学具有重要的影响。参见图4，图中示出对检测酶具有高处理能力的装置。按照在本说明书前面所述的间隔距离，将多个分隔流体体积26a、26b、26c和26d插入主微通道10中。酶通道428具有入口430和与主微通道10相交的出口，用于使流体酶材料434进入主微通道10中。废液通道38在基本上对着酶通道428出口的位置上与主微通道10连接。稀释剂通道440与酶通道428连接，使稀释剂能够混入酶材料434中。基质通道68具有入口和在酶通道出口的下游与主微通道10相交的出口，用于使流体基质材料70进入主微通道10中。稀释剂通道72与基质通道68相连接，使稀释剂能够混入基质材料70中。
将一些微小体积的酶材料434插入主微通道的步骤基本上与图2所绘注入试剂流体的步骤相同。通过主微通道10泵送输送流体和分隔流体体积26a、26b、26c和26e。当包含在一对顺序的分隔流体体积26b和26c之间的酶体积部分434a接近基质通道68的出口时，停止泵送，将流体基质材料70泵入这个酶体积部分434a中。酶材料和基质在反应体积中混合。然后沿主微通道10将混合的流体体积输送到检测/分析通道39。酶和基质材料的浓度可以通过改变混入每一个的稀释剂量来改变，从而进行许多不同酶的检测，这些酶可以以顺序方式沿微通道10输送。
也可提供向反应体积中加入抑制剂的装置。在这种方法的一个实施方案中，为抑制剂的输送，采用珠体移位寄存器。在此装置中，使酶、基质、和抑制剂发生反应，记录珠体产生正抑制作用的位置供将来分析。另一种装置是使珠体库组合入贮池，从贮池中无规则地配送珠体。把各个珠体输送到将化合物供给包含检测靶的反应体积的位置。采用图4所示和所述的移位寄存器装置，对珠体进行检索，但只需要足以给出检测结果的时间。如果结果是负的，就将珠体输送到普通的贮池中，但如果观测到抑制作用，就将珠体贮存在移位寄存器中，供立即或以后鉴定化合物使用，例如采用电雾化质谱仪鉴定。
在分析通道39中，采用适宜的仪器分析反应体积中酶的活性，分析通道39位于微通道10的下游，离微通道10有一段适当的距离。实际距离取决于酶、基质、和抑制剂所需的培育时间，以及被检测反应体积的平均线性速度。
在按照本发明的这个实施方案，在流控微型芯片上采用电动混合和电动输送试剂的酶检测实施例中，使发荧光的基质(9-羟基-3-异吩噁唑酮-β-D-吡喃半乳糖苷)与酶β-半乳糖苷酶混合。通过监测水解产物试卤灵的荧光获得反应动力学。推导在存在和不存在抑制剂的情况下水解反应的Michaelis-Menten常数。可采用根据本发明的方法进行的检测酶的第二个实例是确定乙酰胆碱酯酶(AchE)活性的检测。这是一个分二阶段的检测，在检测过程中，AchE使乙酰硫胆碱水解成硫代胆碱，硫代胆碱又与香豆素基苯基顺丁烯二酰亚胺(CPM)反应，生成发强荧光的硫醚、和CPM-硫代胆碱。监测后一种产物的荧光，确定酶的活性。与不存在抑制剂相比，抑制剂的存在，会降低荧光信号。
图5所示的是用于进行细胞鉴定，其中包括进行细胞寿命鉴定在内的高处理能力的筛选装置。按照在上述与分支通道16的间隔距离，将多个分隔流体体积26a-26g插入主微通道10中。细胞通道50在分支通道16下游的一个位置上与主微通道10相交，使细胞44′进入主微通道10中。这些细胞悬浮在具有生物相容性的缓冲剂中。废液通道38在基本上相对细胞通道50出口的位置上与主微通道10相连接。使废液通道38横截面的尺寸比细胞44′的最小主横截面尺寸小。试剂通道28在细胞通道50下游的位置上与主微通道10相交。第二个废液通道38′在基本上相对试剂通道28出口的位置上与主微通道10连接。
通过主微通道10泵送输送流体和分隔流体体积26a-26g。当一对顺序的分隔流体体积26b和26c接近细胞通道50的出口时，将细胞悬浮液流体泵入分隔流体体积26b和26c之间的反应体积，使单个细胞插入这个反应体积中。另外，可将一群细胞加入反应体积中。同时使其中所含的输送流体进入废液通道38。然后将该反应体积中的细胞及其悬浮流体体积沿主微通道10输送到试剂通道28的出口。将试剂34泵入包含该细胞的反应体积中，置换细胞悬浮液流体。使细胞悬浮液流体通过废液通道38′离开。然后将该反应体积中的细胞和试剂输送到检测/分析通道39。对每个细胞重复这种方法。优选细胞44′包含在按本申请前述间隔的分隔流体体积的顺序对之间的反应体积中。作为时间、泵送条件、和介质组成的函数来检测细胞试样。
采用微型流体芯片的试剂材料的极低消耗对于昂贵的筛选剂和抑制剂材料以及它们的基质材料而言具有显著的优点。对于这类实验的肽库按惯例可用正交可释放的连接体合成在直径≥10-100μm的珠体上，图6所示的是在按照本发明的流控微型芯片上进行珠体筛选过程的基本装置。以平行相关的间隔配置一对微通道10和610。缓冲剂贮池80通过缓冲剂通道82与微通道610连接。废液贮池84，通过废液通道86与微通道10连接。输送通道88在基本上与缓冲剂通道82和废液通道86成直线的位置上，将微通道610与微通道10相连接。
在微通道10内的分隔流体体积26a-26d之间，形成一系列的反应体积，在微通道610内的分隔流体体积626a-626d之间，形成一系列相应的反应体积。沿着相应的微通道输送每个微通道内的反应体积，使微通道610内的反应体积bi-1、bi、和bi+1与微通道10内的反应体积cj-1、cj和cj+1保持同步。参见图3，采用与上述相似的方法，分别将珠体44a、44b、和44c插入反应体积bi-1、bi、和bi+1中。参见图2，采用与上述相似的方法，分别将酶体积36a、36b、和36c插入反应体积cj-1、cj、和cj+1中。
当每个珠体达到输送通道88时，从珠体中释放出其中的化合物，并将其输送到相应的反应体积中。然后使珠体及其相伴的反应体积按以重合移到下游的一个测定点，在测定点将发荧光的基质加入反应体积(cj-1、cj、和cj+1)，以进行荧光测定。相应于具有抑制作用的反应体积的珠体，将被分选出并输送到测定点，在测定点上采用正交解理方法，第二次释放化合物。可采用电雾化电离质谱仪分析这种化合物，测定其化学结构。
采用任一种流体微芯片实现上述的方法，对在微通道内输送的隔离试样、细胞、和珠体等都会产生一个扩大的系列。所涉及的反应体积优选纳升或小于纳升，因此提供许多不同的化合物、试样、细胞珠体等。也可以考虑采用较大的体积。由于每个反应体积都是隔开的，所以当它通过微通道移动时，与一系列电子单位通过数字移位寄存器移动相似，可以识别和跟踪其位置。图7所示的是将包含试剂、细胞、组合库珠体等的多个反应体积，存档和检索的装置。微通道10通过输送流体通道60与输送流体源连接。如前所述，通过分支通道16将分隔流体加入微通道10。通过试剂通道28将试剂、细胞、或珠体插入微通道10内的反应体积中。废液通道38与微通道10相连接，使输送流体与反应体积分开。
微通道10在一个方向上延伸，形成多个环路64a、64b、和64c，在贮池62a终止。微通道10也在一个相反的方向上延伸，形成第二组多个环路66a、66b、和66c，在贮池62b终止。在第一种操作方式中，在分隔流体体积之间形成的反应体积在实线箭头所示的方向以步进方式输送它们向前移动，并通过环路64a、64b、和64c归档。在第二种操作方式中，在虚线箭头所示的方向以步进方式输送它们来检索这些反应体积。环路66a、66b、和66c的总长度与环路64a、64b、和64c的总长度相同，所以可对在环路64a、64b、和64c中归档的所有系列的反应体积进行检索，供以后分析。
虽然在图7中没有示出，但对实施方法1的存档/检索装置所需的电极布局应是能在二个方向上输送反应体积。优选这些电极或触点从每个环路的四周进入。选择电极的几何形状，以便按照适宜的空间周期与微通道环路形成足够的接触。采用这样的布局，可将材料顺序装入寄存器中，供立即或以后进行分析。当反应体积在微通道的环路之间向后和向前移动时，可将这些材料输送到试剂或试样测定点上。
在由环路64a、64b、和64c限定的存储区可保存的反应体积数，可采用下面的式1估算。 LS是最外边的环路一侧的长度，LR是反应体积的长度，LI是隔离段的长度，LC是环路中相邻通道之间中心与中心的距离，n是环路的数目。例如，如果LS为100mm，LR+LI＝1mm，LC为0.1mm，和n＝100，则可在移位寄存器储存环路中可存储约19010个反应体积(N)。这个装置只使用了约10％的100mm×100mm见方的微芯片基片的面积。虽然本申请所述的优选的装置包括一个或多个形成存储通道的环路，但本领域的技术人员很容易理解，也可以采用其它的结构。例如，螺旋形的装置也是同样有效的。
如图5和6所述，这类移位寄存器存储/检索装置对处理组合珠体库是非常有利的。可将裂解-合成的珠体集中装入贮池中，利用单片分选珠体的能力，将其送到存储寄存器中。当需要时，可通过部分光解从这些珠体中释放一些化合物，或预先释放到反应体积的含量中。可通过在对反应化合物进行质谱鉴定的微型芯片上，引入一个电雾化电离测定点来检定珠体库。如图6所绘，也可将这些珠体送到珠体向单独的反应体积供给化合物的位置，以进行生物学鉴定。
现在参见图8，图中示出鉴定新药物的系统800。将合成一系列可能有效的药物化合物的合成模块810通过多个插入通道与主微通道812连接。将每一种合成的化合物插入输送体积中，并以前面所述的方法，沿微通道812输送。设置鉴定模块814，分析和鉴定所合成的化合物的分子结构。鉴定模块通过第二组用于获得合成化合物试样的多个通道与微通道812连接。还设置鉴定模块818，用于对一系列合成的化合物的分子或细胞靶进行筛选鉴定。通过第三组用于获得合成药物化合物试样的多个通道将筛选模块818与微通道812连接。以顺序方式将靶分子或细胞存储在靶存储模块820、和821中。在靶存储模块之间设置第二个微通道822，用于将靶输送到筛选模块818。
将一系列的药物化合物沿着微通道812输送到存储模块816、和817，供以后检索。利用这一特性，基本上能在合成以后分析和/或筛选药物化合物。将用筛选模块818进行筛选的结果提供给决策模块824，决策模块能评价合成化合物的效果，并反馈到合成模块810，用于在这些早期结果的基础上合成新的不同的化合物。采用这种方式，能在微型芯片上迅速和自动地合成、鉴定、和筛选多种新的药物化合物。
鉴于前面的说明和附图，本领域的技术人员应当理解，根据本发明的这种方法和装置能够在顺序处理能力高的情况下，致力于解决范围广泛的生化分析问题，致力于解决这些问题，会从精确和自动的纳升或低于纳升规模的操作中获益。本申请所述的这种装置和方法本身，还会导致向多道平行扩展，向多道平行扩展，会对化学和生化信息的产生提供更大的处理能力。所述的这些微通道装置，能够以可控方法操作生化反应的体积，以迅速地获得结果，例如每个通道的速率至少约1-10Hz，并预料速率可高达100Hz或1000Hz。所利用的反应体积能在没有扩散损失的情况下包含分子或粒状物质。
能采用与数字移位寄存器相似的顺序方式，控制单个的反应体积。该装置包括一些环形微通道，为以后检索提供反应体积的顺序存储。根据本发明的方法和装置可应用于对采用由裂解-合成组合库中的单个珠体来筛选分子或细胞靶、筛选用于RNA的单细胞或蛋白质表达式、在单细胞水平上遗传诊断筛选、或进行单细胞信号转换研究之类的问题。
采用在前面说明中已经采用的术语和表达方式，作为说明书的术语，而不是用于限制术语。不试图使用拒绝所示或所述特性的任何等价物或其中一些部分的术语和表示方法。然而却应承认，在要求专利保护的本发明的范围内，可以进行通道尺寸、位置、和配置之类的各种改进。
权利要求
1.一种用于在微通道内形成和输送材料的一系列微小体积部分的方法，其中包括下列步骤a.形成第一通道，该通道具有与输送流体源连接的入口端，和与流体贮池连接的出口端；b.形成第二通道，该通道具有与分隔流体源连接的入口端，和与所述第一通道相连接的出口端；c.将一个体积的分隔流体吸入所述的第一通道；d.将在所述第一通道中的该分隔流体体积输送到所述的流体贮池；和然后e.重复步骤c和d，形成一系列间隔的分隔流体体积。
2.权利要求1所述的方法，其中将分隔流体体积吸入第一通道的步骤，包括下列步骤a.在所述的第一通道内于所述第一通道和所述第二通道出口端之间的位置处设置第一、第二、和第三个电触点；b.在所述的第一通道内于所述第一通道的入口端和所述第二通道的出口端之间的位置处设置第四、第五、和第六个电触点；和c.在所述的第一和第二个电触点之间施加第一个电位，在所述的第四和第五个电触点之间施加第二个电位，所述第一和第二个电位的幅度和极性，对引导在所述第一个通道内的所述输送流体的流动是有效的，以便将分隔流体吸入所述的第一通道。
3.权利要求2所述的方法，其中包括下列步骤a.降低在所述第四和第五个电触点之间的第二个电位的幅度；和b.保持在所述第一和第二个电触点之间的第一个电位的幅度和极性，直到将所需体积的分隔流体吸入第一通道为止。
4.权利要求3所述的方法，其中在所述第一通道内输送分隔流体体积的步骤，包括下列步骤a.在所述的第五和第六个电触点之间施加第三个电位，同时保持在所述第一和第二个电触点之间的第一个电位，直到这个分隔流体体积达到所述的第一个电触点为止；和然后b.在第二和第三个电触点之间施加第四个电位，借此将该分隔流体体积输送到第二个电触点。
5.权利要求1所述的方法，其中包括将一个体积的试剂注入在分隔流体体积的顺序对之间的所述第一通道的步骤，。
6.权利要求5所述的方法，其中注入试剂的步骤包括以下步骤a.形成第四通道，该通道具有与试剂源连接的入口端，和与第一通道相连接的出口端；b.形成第五通道，该通道具有与第一通道相连接的入口端；和c.在第四通道和第五通道之间施加电位，使这个试剂体积流入所述的第一通道，使输送流体流入所述的第五通道。
7.权利要求5所述的方法，其中包括在试剂注入第一通道之前稀释试剂浓度的步骤。
8.权利要求5所述的方法，其中包括重复将试剂注入第一通道的步骤，以便将多个试剂体积注入不邻接的分隔流体体积的顺序对之间。
9.权利要求8所述的方法，其中包括沿着所述的第一通道，将多个注入的试剂体积输送到所述流体贮池的步骤。
10.权利要求9所述的方法，其中包括顺序贮存多个注入的试剂体积的步骤，以便能检索所选的一个所述试剂体积以进行分析。
11.权利要求10所述的方法，其中包括从存储中检索所选试剂体积的步骤。
12.权利要求1所述的方法，其中包括将反应颗粒插入在一分隔流体体积的顺序对之间的所述第一通道的步骤。
13.权利要求12所述的方法，其中包括重复将反应颗粒插入第一通道的步骤，以便将多个反应颗粒，插入不邻接的分隔流体体积的顺序对之间。
14.权利要求12所述的方法，其中包括沿着所述的第一通道将多个反应颗粒输送到所述流体贮池的步骤。
15.权利要求14所述的方法，其中包括顺序贮存多个插入的反应颗粒的步骤，以便能够检索所选的一个所述的反应颗粒，以进行分析。
16.权利要求10所述的方法，其中包括从存储中检索所选反应颗粒的步骤。
17.一种用于形成和输送材料的一系列微小体积部分的装置，其中包括基片，该基片具有在其中形成的第一和第二个微通道，所述的第一微通道具有与输送流体源连接的入口端，和与流体贮池连接的出口端，所述的第二微通道，具有与分隔流体源连接的入口端，和与所述第一微通道相连接的出口端；设置在所述第一微通道内的第一、第二、和第三个电触点，处于所述第一微通道和第二微通道出口端之间的位置上；在所述第一微通道内的第四、第五、和第六个电触点，设置在所述第一微通道和所述第二微通道入口端之间位置上；和在邻接的各对所述电触点之间顺序施加电位的装置，(i)将一个体积的分隔流体吸入所述的第一微通道内，(ii)停止抽吸在第一微通道内的这个分隔流体体积，和然后(iii)将在所述第一微通道内的该分隔流体体积输送到所述的流体贮池中。
18.权利要求17所述的装置，其中包括第四通道，该通道具有与试剂源连接的入口端，和与第一通道相连接的出口端；第五通道，该通道具有与第一通道相连接的入口端；和将一个体积试剂注入第一通道内的一对顺序的分隔流体体积之间的装置，使处在所述的这对顺序的分隔流体体积之间的输送流体流入所述的第五通道中。
19.权利要求18所述的装置，其中包括在第四通道和第五通道之间施加电位的装置，以便注入这个试剂体积。
20.权利要求18所述的装置，其中包括在试剂注入第一通道后，稀释试剂的装置。
21.权利要求19所述的装置，其中包括改变试剂稀释作用的装置，以形成一系列具有不同浓度的稀释的试剂的体积，和将每个体积注入所述第一通道内分隔流体体积的各交替对中的装置。
22.权利要求18所述的装置，其中包括沿第四通道和流体贮池之间的第一通道设置的一些附加电触点；和在相应的各对附加电触点之间，施加电位将反应体积沿所述的第一通道输送到所述的流体贮池的装置。
23.权利要求18所述的装置，其中所述的第一通道包括一个环路，存储处在分隔流体体积各交替对之间的多个所述稀释的试剂体积。
24.权利要求17所述的装置，其中包括第四通道，该通道具有与悬浮在流体介质中的反应颗粒源连接的入口端，和与第一通道相连接的出口端；第五通道，该通道具有与第一通道相连接的入口端；和在所述的第一通道内一对顺序的分隔流体体积之间注入悬浮在流体介质中的反应颗粒的装置，使处在所述的这对顺序的分隔流体体积之间的输送流体流入所述的第五通道中。
25.权利要求20所述的装置，其中包括在第四通道和第五通道之间施加电位的装置，使包含反应颗粒的流体介质体积流入所述的第一通道中，使输送流体流入所述的第五通道中。
26.权利要求20所述的装置，其中包括根据反应颗粒的质量和特性，分选反应颗粒的装置，和将一些单个的反应颗粒注入所述第一通道内的一对顺序的分隔流体体积之间的装置。
27.权利要求22所述的装置，其中包括控制注入每个反应颗粒的装置，以便将一些反应颗粒插入所述第一通道内分隔流体体积各交替对之间。
28.权利要求23所述的装置，其中包括沿第四通道和流体贮池之间的第一通道设置的一些附加电触点；和在相应的各队附加电触点之间施加电位的装置，将分隔流体体积沿所述的第一通道输送到所述的流体贮池。
29.权利要求18所述的装置，其中所述的第一通道包括一个环路，存储多个处在分隔流体体积各交替对之间的所述反应颗粒。
全文摘要
本发明公开一种对一系列钠升－低于纳升的反应体积进行范围广泛的生化分析或控制的方法,和一种进行这种生化分析或控制的装置。这种方法和装置是使用能连续提供高处理能力的流控微型芯片实现的。本发明的方法和装置的本身,还能导致多道平行分析和控制,对产生的生化信息提供更大的处理能力。特别是,所公开的装置是一种精密加工的通道装置,它能以控制方式操纵纳升或低于纳升的生化反应体积,每个通道能以1－10Hz的速率产生结果。与数字移位寄存器相似,以顺序方式控制单个反应体积。根据本发明的方法和装置,可用于采用裂解－合成组合库中单个珠体筛选分子和细胞靶、筛选RNA单细胞或蛋白质表达式、在单细胞水平上筛选遗传特性、或进行单细胞信号转换研究之类的问题。
文档编号B01D57/02GK1378485SQ00814061
公开日2002年11月6日 申请日期2000年8月10日 优先权日1999年8月12日
发明者J·M·拉姆齐, S·C·雅各布森 申请人:Ut-巴特勒有限公司