从血液中去除代谢组分的制作方法

专利名称：从血液中去除代谢组分的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用基于膜的电泳从血液或血浆中去除一种或多种有害组分，特别是代谢产物。
背景技术：
在肾衰竭中，肾功能的丧失导致尿毒症，其特征在于血液中盐、水和蛋白质代谢的有毒分解产物的累积。全世界大约有一百万人患有肾衰竭，年增长率为约9％。目前的治疗方法是基于传导(扩散-溶质从血液通过透析膜被动传输至透析液)、对流(超滤-将溶剂和溶质从血液隔室通过透析膜同时传输至透析液)和吸附(取决于膜的疏水性的蛋白质吸附)策略。为了测量具体疗法的适当性，对标记分子如尿素、肌酸酐和维生素B12的减少进行测定。标记分子，特别是尿素，被用作是治疗适当性的量度。尿素没有病理生理效果，在透析病人中的尿素浓度说明它不是主要毒素。然而，尿素的生成反映了蛋白质代谢的有毒产物的生成。由于肾或其它器官衰竭产生的所有毒素仍需加以鉴定。因此，65％尿素清除率被认为是适当的肾透析期。大部分(85％)晚期肾病(ESRD)病人使用一种所谓的血液透析技术进行治疗，该技术使用了被动扩散策略。但是，经血液透析的病人远比正常人活得长。由于血液透析程序不能完全取代正常活肾脏的功能，他们遭受副作用或死亡。
血液透析涉及将血液通过人造肾脏，其中尿毒症毒素如盐和尿素(低分子量分子)通过半透膜扩散进入等渗透析液中，导致血液中毒素浓度减少。然而，因为有毒分子尺寸增大，它们通过扩散而被去除的能力降低了。典型地，仅有10％至40％的较大分子，称为中等分子量分子，在透析期间被去除。因此，这些毒素达到异常高的浓度，经一段时间后开始损害身体。不能充分去除尿毒症毒素如中等分子的毒素(例如β-2-微球蛋白)和磷酸盐表明了目前肾透析技术的严重局限性。目前，为了实现最低的适当去除尿毒症毒素，制造商和肾病学家试图增加人工肾脏的表面积，延长病人的治疗次数。然而，因为需要血液注入来进行透析，人工肾脏的表面积具有局限性。当血液初容量(bloodpriming volume)(其进入损耗)超过人血液再生时间时，这种局限性就会体现出来。同样，增加治疗次数会降低病人生活质量，并增加医疗和辅助人员的需要。应注意到，有几个公司和医院正在研究可在家里进行的夜间透析，以提高病人的生活质量，并减少对医务人员的需要。
在健康个体中，肾用于从血液循环中去除过量的水、盐和小蛋白质。被肾脏去除的含氮废物包括过量食物氮的最终代谢物尿素、在肌肉活动中产生的肌酸酐、和核苷酸代谢的终产物尿酸。目前的肾透析技术依赖于平衡/扩散原理和跨膜压力，以从患有慢性或急性肾衰竭的病人的血流中去除含氮废物、盐和过量的水。这要求每周进行三至四次透析治疗，每次为二至三小时。在现有透析技术中有明显缺陷，包括使用的透析膜亚最佳的生物相容性，现有技术不能适当去除某些溶质如磷酸盐，以及不能很好地去除低分子量蛋白质如β-2-微球蛋白。
电泳技术或其改进技术可用于进行血液透析，以进行肾替换治疗，使得这些在常规透析中的缺陷可得到解决。通过包括应用经血液透析室的电势以加速去除带电溶质，如磷酸根离子和蛋白质，以及带电含氮废物和其它盐离子如钠、钾、氯等，可解决这些缺陷。电泳技术可用于从血液或血浆循环中去除特定蛋白质，以治疗由这些蛋白质介导的疾病症状。这些疾病状态的实例包括类风湿性关节炎和许多其它自身抗体介导的自身免疫疾病，它们能通过从病人血液循环中选择性地去除自身抗体或其它与疾病相关的蛋白质而得到治疗。
国际上，有800,000人患有慢性肾衰竭，这说明他们的肾脏不再能正常工作。在医学上，透析是一种用于从身体中去除因肾衰竭而产生的有毒废物的疗法。主要有两类透析血液透析和腹膜透析。
血液透析通常在透析中心进行，其中治疗需要约4小时的透析，一周三次。这严重影响了病人的生活质量，以及从整体上影响了他们对社会的生产力。该技术需要血液从身体重新传送至由塑料毛细管制成的滤器。当废产物从血液扩散穿过这些微小毛细管膜时，血液被净化。然后血液通常通过臂中的血管流回身体。该体系的主要优点是病人不需要培训。主要缺点是透析移植失败很常见，部分病人会失去自由，因为要求他们向透析中心报告治疗情况。
在腹膜透析中，身体的自有膜用作滤器，排入和排出腹部的流体取代肾脏以去除毒素。这个体系有一些很大的优点，它们包括如下事实这可以在家里实施。然而，在家里使用这种方法需要精细技术，并有附加的缺点腹膜炎和膜失效。
β-2-微球蛋白(β2m)相关的淀粉样变性病是一种严重的衰弱性并发症，其影响长期透析病人。在正常生理学条件下，可在血浆中发现低浓度的(1-3mg/l)的游离循环β2m。但是，在长期透析病人中该浓度可高达50倍。在健康个体中，肾小球过滤和在近端肾小管中的分解代谢可有效去除β2m。肾功能的损害通常导致β2m的滞留，随后增加其循环浓度，因为其分解代谢替代有限。另外，目前的透析治疗不能以充分的速率有效地去除β2m，这导致其以部分淀粉样原纤维蓄积和沉积在不同的肌与骨骼的结构中。这些淀粉样沉积主要是骨关节(炎？)，它们与多种临床表现相关，如腕管综合征、关节疼痛和僵硬、骨囊肿、病理性骨折和软组织块。与β2m淀粉样变性病相关的临床问题是在长期透析病人中的发病率的主要因素。
β-2-微球蛋白是11.9KDa的非糖基化蛋白，其包括99个氨基酸残基的单多肽链。它由染色体15上的单个基因编码，并由18个残基信号肽合成。β2m在所有有核细胞的表面上遍在表达，其中它用作HLA1型分子的轻链，通过非共价键与重链相连，并被要求运输和表达在细胞表面的复合体。还已知，它与IgG(CH3)的恒定区和HLA1型重链的α-3结构域具有氨基酸序列同源性。已描述了几种β2M的同工型，在长期透析病人内发现的天然的β2m及其酸性更强的变异体的等电点分别为5.7和4.8至5.3。
磷酸盐滞留在透析病人的继发性甲状旁腺机能亢进的发病机理中具有重要作用，它可以减少1.25(OH)2维生素D3的肾合成。因此，血清磷酸盐水平的控制对于甲状旁腺机能亢进的治疗策略很重要。可用于控制磷酸盐水平的几种实施方法包括膳食磷酸盐的限制、磷酸盐结合药物的施用和磷酸盐透析去除(PDR)的增强。
现有的肾透析治疗设备使用扩散和/或对流方式以从血液中去除污染分子。血液流经一次性筒，其中血液以一个方向流动，而通过半透膜从血液流中分离的透析液则以相反的方向流动。
扩散去除是指当血液用生理透析溶液透析时，污染分子存在于血液中，但不存在于透析液中，沿它们的浓度梯度从血液流扩散至透析液流中。这是在“常规肾透析”中所使用的污染物去除模式。这类透析通常适合去除低分子量溶质，但完全不适合去除较大的血液组分或污染物如β2微球蛋白。
对流去除是指在足够的压力下使流体(而不是细胞)通过一个膜，以该膜来处理血液。这被称为血液滤过，可去除血液污染物，所述污染物经过流体总体流动而从血液中被去除。通过将替换溶液注入到病人体内以维持恰当的体液平衡，从而补充被去除的一些流体。
溶质去除的扩散和对流方式可组合在已知为血液透滤的透析模式中，其中被保持在相对高压下的血液对被保持在相对低压下的透析溶液透析。溶质能扩散通过半透膜，而跨膜压力导致同时从血液中去除大量流体，这增加了溶质去除的速率。在HDF中，替换溶液也可用于保持流体平衡，并可在用透析筒处理之前或之后加入到血液中。
GradflowTM是由Gradipore Limited(Australia)开发的基于膜的制备性电泳技术，其中使用分子电荷和大小的双重策略来达到分离。这种技术的区别特征在于一套水凝胶膜和在这些膜两端施加电势以驱使分离。这些特征的使用可选择性地从复合起始材料中去除污染物或产物，这已在许多蛋白纯化过程中得到验证。
本发明人现已开发了基于膜的电泳系统，所述电泳系统适于处理血液和血浆，以去除有害的代谢产物。

发明内容
在第一方面，本发明提供了从受试者的血液或血浆中去除或降低一种或多种代谢组分的浓度的电泳系统，所述系统包括(a)在阴极区域的阴极；(b)在阳极区域的阳极，该阳极相对于阴极设置，使得在阴极和阳极之间施加电势后，适于在两者之间的电场区域产生电场；(c)位于电场区域内的具有确定孔径和孔径分布的第一离子渗透屏障；(d)位于阴极区域和第一屏障之间的具有确定孔径和孔径分布的第二离子渗透屏障，以便在其中形成处理室；(e)适于冷却受试者的血液或血浆的装置；以及(f)适于将渗透液提供给阳极区域和阴极区域的装置；(g)适于将受试者的血液或血浆提供给处理室的装置，其中在施加电势后，使血液或血浆的代谢组分迁移通过至少一个屏障进入到阳极区域或阴极区域中的至少一个。
在优选的形式中，该系统还包括(h)适于将处理过的血液或血浆返回至受试者的装置。
代谢组分可以是在血液或血浆中任意有害的代谢组分，如小化合物和中等分子量的蛋白。优选地，代谢组分为溶质，其包括磷酸盐、含氮废物如尿素和尿酸，或大分子，包括β-2微球蛋白，和其它不希望的蛋白，包括自身抗体。
因为常规透析方法不能顺利地去除磷酸盐和β-2-微球蛋白，所以本发明系统特别适合作为标准透析治疗的附加。
受试者可以是患有肾异常而需要肾透析的病人，或例如是患有肝异常的病人。
阴极区域和阳极区域通过任意合适的泵送装置供有合适的透析液或缓冲溶液。血液或血浆通过任意合适的泵送装置提供给处理室。
第一和第二屏障可具有相同的确定孔径和孔径分布，或不同的确定孔径和孔径分布。优选地，屏障为聚丙烯酰胺(polyaccrylamide)或任意其它合适的聚合物形成的水凝胶膜。对于在处理血液或血浆方面的应用，膜优选具有不容许血清白蛋白迁移的确定孔径和孔径分布。典型地，屏障或膜具有小于约60kDa的名义截留分子量。
屏障或膜的截留分子量的选择取决于待处理的样品和待去除的代谢组分。但是，可以理解其它膜化学性质或组件可用于本发明。
也可能有需要两个或多个处理室的情况。如果这样，那么本发明系统可另外包括具有确定孔径和孔径分布的第三离子渗透屏障，其位于电场区形成第二处理室。类似地，可能需要多个处理室。如果这样，那么本发明系统可另外包括多个具有确定孔径和孔径分布的离子渗透屏障，其位于电场区形成多个处理室。
在一个优选形式中，形成处理室的屏障或膜以位于系统的电极区域之间的筒或盒的形式提供。优选地，筒或盒可从适合包含或容纳筒的电泳装置上卸下。电极可装在电泳装置内或位于筒内。筒为一次性的或适合重新使用。因为不同的处理需要不同的膜，如果需要可提供无菌形式的组合膜来进行单次使用。此外，筒可以拆除，并可插入新的屏障或膜。
优选地，电极区域和处理室的构造使得各个透析液和血液/血浆流动形成液流。以这种方式，可迅速有效地处理大量血液或血浆。优选地，透析液通过合适的泵送装置从储液槽迁移或者循环通过电极区域。在优选的实施方案中，蠕动泵可被用作输送透析液和血液/血浆的泵送装置。
优选地，冷却装置选自气体、液体或固体传热系统、冷却流体套换热器或珀耳帖(peltier)冷却器。更优选地，冷却装置为气体、液体或固体传热系统。
血液/血浆也可从受试者重新循环到系统，并经过一段时间后再返回到受试者，直至有害代谢产物的量得以降低。
系统典型地由组件按模块形式构建，所述组件为生物相容的，易于拆卸进行清洗、消毒或灭菌。
在使用时，从受试者体内取出血液或血浆，将其经过冷却装置以降低温度，然后进入处理室。将透析液提供给电极区域，对电场区施加电势，使得在血液或血浆中的至少一种代谢组分迁移通过至少一个屏障或膜，进入相应的阴极区域或阳极区域。在处理后，将血液或血浆返回至受试者体内。血液或血浆可以从病人经系统重新循环进行连续处理，或在处理室内通过保持血液或血浆进行分批处理。
本发明系统适合动物尤其是人的肾透析。
已发现，系统组件是生物相容的，当血液组分经透析后返回至病人时不会有不利影响。
在第二方面，本发明提供了从受试者的血液或血浆中去除或降低代谢组分的量或浓度的方法，所述方法包括(a)将受试者的血液或血浆放入根据本发明第一方面的电泳系统的处理室内；(b)在两个电极之间施加电势，使得血液或血浆的代谢组分迁移通过一个膜，进入至少一个电极区域；(c)继续步骤(b)，直至从血液或血浆中去除所需量的代谢组分；和(d)将处理室内的处理过的血液或血浆返回至受试者体内，其中该方法基本上不会使血液或血浆被加热至高于约37℃的生理温度。
优选地，将血液或血浆流经冷却装置，然后再进入处理室。本发明人已发现，优选先冷却血液或血浆，然后再到处理室内处理。血液或血浆优选通过一定量的加热冷却至低于生理温度(约37℃)，当血液或血浆在处理室内处理时，希望实施这一步骤。因为在电泳过程中会产生一些热量，这会导致不希望的溶血反应，或破坏或失活血液或血浆组分，所以处理不应使血液或血浆被实际加热到高于生理温度(约37℃)。在处理前冷却血液或血浆可克服在处理过程中与过度加热血液或血浆相关的任何问题。
在一个优选的形式中，将血液或血浆通过根据本发明的第一方面的冷却装置以降低血液或血浆的温度，然后再送至电泳系统的处理室。这一步骤有助于防止血液或血浆被加热至高于约37℃的生理温度。在处理室内电泳期间，在血液和血浆返回受试者前将其温热至所需温度。
在一个优选的实施方案中，受试者为肾透析病人或肝衰竭病人。
血液或血浆优选在受试者和处理室之间重新循环。
屏障可具有接近代谢组分的表观分子量的截留分子量。但是，可以理解，根据应用领域，屏障可具有任何所需的截留分子量。
优选地，在电泳期间，血液或血浆的细胞和生物分子组分基本上被保留在处理室内，或者如果它们进入屏障，那么也基本上会被阻止进入电极室。
优选地，代谢组分为溶质，其包括磷酸盐、含氮废物如尿素和尿酸，或是中等分子量蛋白包括β-2微球蛋白和其它不希望的蛋白包括自身抗体。
优选地，屏障为截留分子量在约3和约60kDa之间的膜，以保证较大蛋白如白蛋白不会从血液或血浆中损失。但是，可以理解，其它大小的膜也是可用的，这取决于所需的处理方法。许多不同的屏障或膜也可用于所需的或有用的构型中。
在该方法过程中所施加的电势应优选基本上不会不利地影响存在于血液或血浆中的细胞或蛋白。已发现高达约100伏特的电势是合适的。但是可以理解，也可以使用其它电压。
血液/血浆样品或透析液的流速会影响代谢组分的分离。已发现，流速20ml/min是合适的。然而，增加分离的规模也增加了流速。可以预计，在放大的电泳系统中可以达到200-800ml/min的流速。根据应用的电泳系统(附加或孤立单元)，可预计产生20-1000ml/min的流速。
施加电压和/或电流的选择或者实施根据应用领域的不同而不同。通常可应用高达约100伏的电压，但是电压的变化和选择将取决于装置的构造、透析液和待处理的样品。重要的是，所使用的电压不应导致“过度加热”血液或血浆，从而使血液或血浆组分溶解、失活或破坏。使用优化的冷却系统将有助于增加施加至系统的电势。电泳系统的放大也会导致施加至系统的电势增加。
任选地，电势可能周期性停止和/或反向，以使已进入屏障或膜的成分返回到室内的样品中，而基本上不引起已经完全通过屏障或膜的任何成分通过屏障或膜返回。
电势的反向是一种选择，但是另一个替代法是静态期。静态(没有施加电势的时期)是一种可选择的步骤，它可以代替可选择的电势反向，或者被包括在可选择的电势反向之前或之后。这种静态技术通常可被用于特定领域，作为反向电势的替代法或者附加。
在一个形式中，在步骤(a)之前、之后或与其同时，对至少一种血液组分进行处理，如扩散血液透析、对流血液透析、血液滤过、血液透滤或其组合。
在第三方面，本发明提供了对受试者进行肾透析的方法，所述方法包括对受试者的血液或血浆进行血液透析，然后按照本发明的第二方面的方法处理受试者的血液或血浆。
因为常规血液透析常常不能从肾病人的血液中去除某些代谢组分，这导致这些组分的蓄积，所以使用根据本发明的第二方面的方法的第二处理过程具有选择性地去除这些组分的潜力。
优选地，该方法包括
(a)对病人的血液或血浆进行血液透析；(b)将血液透析病人的血液或血浆放入根据本发明的第一方面的电泳系统的处理室内；(c)继续步骤(b)，直至从血液或血浆中去除所需量的代谢组分；和(d)将处理室内的处理过的血液或血浆返回至受试者体内，其中该方法基本上不会使血液或血浆被加热至高于约37℃的生理温度。
组分可以为磷酸盐或蛋白如β-2微球蛋白或自身抗体。但是可以理解，其它有害代谢组分也可在这一过程中去除。
在第四方面，本发明涉及根据本发明的第一方面的系统在透析肾病人中的应用。
在第五方面，本发明涉及适于帮助病人透析的电泳系统与人工肾、血浆分离装置或血浆分离(apheresis)装置的组合。
在整个说明书中，除非上下文另有需要，单词“包括”、或者其变体诸如“包含”或者“含有”，可被理解为暗指包括所述部件、整体或者步骤，或者部件、整体或者步骤的组，然而并非排除任一其它部件、整体或者步骤，或者部件、整体或者步骤的组。
包括在本说明书中任一讨论的文献、论文、材料、装置、物品等等只是为了提供本发明的上下文的目的。不能认为任一或者所有这些主题形成现有技术的部分基础部分或者是与本发明相关领域的普通常识，因为在本发明每个权利要求的优先权日之前它们已经在澳大利亚存在。
为了更清楚地理解本发明，将参照附图和实施例来描述优选形式。


图1显示了本发明基于膜的电泳系统的结构示意图。
图2显示了从血浆、掺加的(spiked)血液和掺加的血浆中去除尿素。
图3显示了从血浆、掺加的血液和掺加的血浆中去除肌酸酐。
图4显示了从血浆、 掺加的血液和掺加的血浆中去除尿酸。
图5显示了从掺加的血浆中去除磷酸盐。
图6显示了在Tris硼酸缓冲液(pH8.4)中，电势对于β-2-微球蛋白和磷酸盐迁移通过50kDa分离膜的作用。
图7显示了在200V电势下，pH对β-2-微球蛋白和磷酸盐迁移通过50kDa分离膜的作用。
图8显示了在200V电势下，膜孔径对于β-2-微球蛋白和磷酸盐的迁移的作用。
图9显示了在63V电势下，白蛋白、掺加的β-2-微球蛋白和磷酸盐从血液和血浆迁移通过100kDa和200kDa分离膜。
图10显示了β-2微球蛋白的去除并不是由于膜吸收产生的。下方的条块(负值)表示从S1中去除的β-2微球蛋白的百分比，而上方的条块(正值)表示处理后来自S1的在S2中收集的β-2微球蛋白的百分比。
图11显示了本发明电泳系统与现有的透析疗法在去除β-2微球蛋白方面的性能比较。在该图中描述的现有的透析疗法为血液透析(HD)膜，其由目前市售的材料(cuprophan、醋酸纤维素、聚丙烯腈(PAN)、聚砜和聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA))组成。
图12显示了基于膜的电泳处理对于溶血的影响。
图13显示了基于膜的电泳处理对于凝固(APTT凝结时间)的影响。
图14显示了基于膜的电泳处理对于凝固(TAT形成)的影响。
图15显示了基于膜的电泳处理对于补体活化(C3a)的影响。
图16显示了基于膜的电泳处理对于全血中血小板活化的影响。
图17显示了基于膜的电泳处理对于全血中淋巴细胞活化的影响。
图18显示了基于膜的电泳处理对于全血中的嗜中性粒细胞活化的影响。
图19显示了在不同结构的基于膜的电泳系统中S1和S2的温度变化。各个条形图的编号描述如下条形图1正常流动，用冰冷却的透析液，2股液流，RS电源；条形图2U/S反向电流，用冰冷却的透析液，2股液流，RS电源；条形图3正常流动，室温，2股液流，RS电源；条形图4正常流动，室温，1股液流(S1)，RS电源；条形图5反向电流，室温，1股液流(S1)，RS电源；条形图6血液，正常流动，室温，2股液流，RS电源；条形图7血液，S1反向电流，室温，2股液流，RS电源；条形图8血液，正常流动，室温，1股液流(S1)，RS电源；条形图9血液，反向电流，室温，1股液流(S1)，RS电源；条形图10血液，正常流动，室温，2股液流，单程，RS电源；条形图11血液，反向电流，室温，2股液流，单程，RS电源；条形图12血液，正常流动，室温，1股液流(S1)，单程，RS电源；条形图13血液，反向电流，室温，1股液流(S1)，单程，RS电源。
图20显示了使用本发明电泳系统的处理对于溶血的影响。
图21显示了使用本发明电泳系统的处理对于凝固、凝血酶/抗凝血酶III复合体(TAT)形成的影响。
图22显示了使用本发明电泳系统的处理对于补体(C3a)活化的影响。
图23显示了不同电压对溶血水平的影响。
图24显示了在实验绵羊模型中的血液循环。
图25显示了在实验绵羊模型中的血浆循环。
图26显示了在本发明的电泳系统中，在80V下，使用1x Fresenius缓冲液从肝素化的血液中去除盐离子。
图27显示了在本发明的电泳系统中，在80V下，使用1x Fresenius缓冲液从肝素化的血浆中去除盐离子。
图28显示了在本发明的电泳系统中，在80V下，使用稍微稀释的Fresenius缓冲液从肝素化的血液中去除盐离子。Fresenius缓冲液被稀释，使得Na+浓度从139.8mM降至130mM。
图29显示了在本发明的电泳系统中，在80V下，使用乳酸盐腹膜透析流体从肝素化的血液中去除盐离子。
图30显示了在本发明的电泳系统中，在80V下，使用1/2xFresenius缓冲液从肝素化的血液中去除盐离子。用葡萄糖使1xFresenius渗透摩尔浓度补足至296.1mM。
图31显示了使用本发明的电泳系统，不同缓冲液和缓冲液浓度对溶血的影响。
实施本发明的方式缩写和命名在本说明书中，用缩写来描述与基于膜的电泳相关的具体隔室或方法及其在血液处理中的用途，以及所测试的代谢参数。下面是缩写列表及简要说明。
A-G比率-白蛋白球蛋白比率AST-转氨酶BF200-由Gradipore Limited(Australia)制造的General GradiflowTM实验室电泳模型缓冲液流或透析液流-在膜外部循环的液流。通常为Fresenius形式的透析液置于该液流中。
C3a-补体因子C3a。一种参与补体级联的蛋白质，最后在免疫应答中产生膜攻击复合体。
筒结构1流体(透析)-使用一个限制膜和一个分离膜构建膜筒，其结构可形成一股液流(S1)。筒的典型结构为限制膜在顶部，而分离膜在底部，使得样品液流流入S1。描述筒结构的惯例是从上至下；顶部限制-分离例如100-100kDa截留分子量。
筒结构2液流-使用在两个限制膜之间的一个分离膜构建膜筒，其结构可形成两股液流(S1和S2)。描述筒结构的惯例是从上至下；顶部限制-分离-底部限制例如3-100-3kDa截留分子量。
C-胆红素-结合胆红素CK-肌酸激酶组合电源-在低电导率环境下能达到300V/2A/150W(在蛋白质分离中通常限于250V/1A/150W)的电源。
DF100-开发用于本发明的基于膜的电泳模型，被称为透析流(Dialysis Flow)100。
ESRD-末期肾病γGT-γ谷氨酰转移酶GLDH-谷氨酸脱氢酶Hb-血红蛋白
MCH-平均细胞血红蛋白MCHC-平均细胞血红蛋白浓度。
MCV-平均细胞体积PCV-包装的细胞体积RBC-红细胞RDW-红细胞分布宽度RS电源-在高电导率环境下能以63.3V/3A的最大值运行的电源。
S1-电泳系统的液流1S2-电泳系统的液流2T-胆红素-总胆红素WCC-白细胞计数电泳系统图1显示了利用分离单元20的电泳系统10的示意图，以说明适合本发明系统的总体功能。在这个纯说明性实施例中，将两个电极区域(阴极区域22、阳极区域24)与阳极电解液流路相连。流路40包括阳极电解液储存器42、阳极电解液管道44和阳极电解液泵46。
样品流路48包含冷却装置50、管道52和泵54。样品56从受试者50流至换热器形式的冷却装置60，通过管道52至泵54，然后通过入口进入处理室26。在一个实施方案中，在处理室26内阳极电解液36和样品56的流动方向是相反的。样品56从分离单元20的出口流出，并流经管道52，通过管道52返回至受试者50。在另一个实施方案中，在处理室内样品56和阳极电解液36的流动方向是相同的。
优选地，所有的管道44和52为耐高压加热的、抗化学物质的和生物学上惰性的蠕动管道。一个这样的管道是MasterflexC-FLEX50A管道。同样，泵46和54优选为不与阳极电解液36和样品56接触的蠕动泵。在这个优选的实施方案中，换热器68由不锈钢构成，但本领域已知的其它材料也是适用的。优选地，换热器68是耐高压加热的、抗化学物质的和生物学上惰性的，并能够促进血液或血浆样品的热交换。
此外，优选当病人与系统10相连时，样品流路48和阳极电解液流路40是完全封闭的，以防止污染或交叉污染。
分离单元20另外包括电极88a和88b。优选地，各个电极位于阴极区域和阳极区域，并通过离子渗透屏障与处理室分开。
电极88a和88b为适合的标准电极，或优选由涂铂的钛的多孔网制成，能提供良好的机械性质、电场的均匀分布、长使用寿命和高成本效益。电极88a和88b优选位于相对接近离子渗透屏障30和32的位置，以较好地利用所施加的电势，并散去产生的热量。已发现，约0.1至6mm的距离对系统是合适的。对于较大的系统，距离将取决于离子渗透屏障的数量和类型以及电极区域和处理室的大小和体积。优选的距离为约0.1mm至约10mm的量级。
分离单元20还优选包括电极连接器78，其用于将分离单元20与电源72相连。优选地，电源72在分离单元20的外面，但是分离单元20的结构可容纳内部电源72。电极连接器78优选是耐高压加热的。
当电势施加至分离单元20时，可实现从血液或血浆样品中迁移代谢组分。电场强度(电势)的选择取决于分离过程。典型地，电场强度的变化范围为1V/cm至约500V/cm，优选10V/cm至80V/cm，并产生高达约1A的电流。优选使单元的总功率消耗保持在最低值，与所需的分离和生产速率相当。
实验设计在目前的肾透析疗法中，磷酸盐和有问题的中等分子没有完全去除。在肾透析设置中，根据本发明的系统和方法结合蛋白去除和电解液透析的特征在治疗肾损害的病人方面具有重要的潜力。因为本发明的电泳系统和方法使用电势来驱动分离，具有大的电荷/质量比的分子如磷酸盐被迅速去除。中等分子毒素往往为分子量比白蛋白小的蛋白，其在特定pH具有特定电荷。通过使用蛋白质上的电荷和膜的截留分子量，可减少中等分子蛋白。
在肾透析设置中，基于膜的电泳的潜在益处的初始评估涉及确定尿毒症毒素是否能从起始材料中去除。使用BF200型号GradiflowTM，其使用小体积(12ml)起始样品，来进行去除含氮废物的研究。对于所有的试验，使用乙酸盐-碳酸氢盐血液透析透析液(Fresenius)或乳酸盐腹膜透析液(Baxter)作为缓冲溶液。当市售透析液已被确定在肾透析治疗中为生理学相容时，就可使用它们，这也提供了一种容易的方式，将本发明电泳系统用作目前透析疗法的附加。在BF200中，小体积的含氮废物去除实验在初始时使用15V电势，以产生分子迁移分布。当一些被测分子具有低的电荷/质量比及由此具有低运动性时，可使用63.3V电势来增加分子迁移速率。
小体积(12ml)含氮废物去除实验涉及评估电泳系统是否能从缓冲液中去除掺加的尿毒症毒素(尿素、尿酸、肌酸酐、磷酸盐和β-2-微球蛋白)。然后用正常的和掺加的血浆、血液和肾病人透析液来取代缓冲液。肾病人透析液被用作中等分子毒素β-2-微球蛋白减少实验的替代来源。
鉴定使用电泳系统时从血液/血浆中去除特定的尿毒症毒素，就可确定该方法是否为生物相容的。因为文献评论中没有清楚地说明聚丙烯酰胺水凝胶膜(关于使用含有聚丙烯酰胺的接触镜和皮肤贴片的信息已被确定，但是该信息与血液接触生物相容性无关)和电势是否是生物相容的，所以这两者都加以研究。为了使BF200的生物相容性数据与透析情形更相关，处理体积可在12ml至100ml之间变化。增加起始体积可有助于电泳系统处理类似于在普通人体内所发现的血液体积。选择用于提供血液/水凝胶/电势相互作用的初步观察的生物相容性参数为溶血、凝固、补体和白细胞途径。这项研究的结果可参见本文的“生物相容性方面”这一部分内容。
为了减少由BF200产生的溶血量，使电泳系统更适于在临床上应用，开发了透析电泳系统原型。该透析原型被称为Dialysis Flow 100(DF100-下面说明BF200与DF100的差别)。DF100降低了溶血，并在生物相容性方面与BF200保持相同。
为了确定按比例调节DF100所需要的参数以处理人体内的血液体积，研究了几个参数。所研究的参数为生物相容性、电势、缓冲液和电解液分析以及较大体积的尿毒症废物的去除。
为了确定体外过程能去除尿毒症废物和所测的生物相容性标记具有不太重要的副作用，进行了动物研究。动物研究的目的是为了研究在绵羊模型中电泳系统的体内生物相容性。来自第1阶段动物研究的结果描述如下。
动物研究所得的结果已确定电泳系统可被公认能用作医疗设备。
结果含氮废物/尿毒症废物的去除本实验目的是为了评估电泳系统从掺加的缓冲液、血浆和全血中去除尿毒症废物(尿素、肌酸酐和尿酸)和磷酸盐的能力。
方法从健康志愿者体内抽取血液和血浆。将1mg/ml尿素(60Da)、0.1mg/ml肌酸酐(113Da，pKb10.4)、0.25mg/ml尿酸(168Da，pKa5.75)和0.1mg/ml磷酸盐加入到12ml血液或血浆样品中。将掺加的血液或血浆放入电泳系统BF200的S1中。将碳酸氢盐血液透析液(FreseniusMedical Care South East Asia Pty Ltd，Smithfield NSW Australia)用于缓冲液流中。对于这些实验，组装没有中间分离膜的筒，得到一个样品液流。将15V电势施加至25kDa/25kDa膜筒。在1小时内每5分钟取样一次，使用标准临床试验试剂盒(Trace Scientific Ltd，MelbourneVic Australia)测定尿素、肌酸酐、尿酸和磷酸盐的去除率。选择15V电势是为了观测分子迁移的清晰分布。因为这些分子中的大多数具有很高的电荷与质量比，因而具有很高的运动性，所以较高的电压会使分子运动太快而难以建立比较性分布图。
从肾透析病人得到血浆，其具有高水平的β2微球蛋白(12kDa.pI5.8)。将该血浆放入电泳系统BF200的S1内。将碳酸氢盐血液透析液(Fresenius，Medical Care South East Asia Pty Ltd，Smithfield NSWAustralia)放入S2和缓冲液流。将63V(RS电源)电势施加至常规构型的3-200-3kDa膜装置。从S1和S2中取样，使用Behring nephelometer100比浊分析仪和Dade Behring浊度测定法试剂(Dade Behring，Germany)来分析β2-微球蛋白的去除率。采用63V电势是为了使蛋白能够运动。由于蛋白的电荷与质量比比上述所用的分子低，所以需要较高的电势。
结果尿素尿素是不带电的分子，通过被动扩散可将其从血浆、掺加的血液和掺加的血浆中去除，这个原理同样适用于血液透析。在1小时后，血浆显示有49％的清除率，而掺加的血液和掺加的血浆分别显示有21％和43％的清除率(图2)。
肌酸酐肌酸酐在生理条件下带有少量正电荷，导致电压依赖性去除。在1小时后，有41％肌酸酐从正常血浆样品中去除，而在掺加的血液和掺加的血浆中肌酸酐的去除率分别为14％和25％(图3)。
尿酸在生理环境下，尿酸带有负电荷，因此其去除率也依赖于电压。在1小时后，有89％的尿酸从正常血浆样品中去除。在掺加的血液中，尿酸去除率为66％，而在掺加的血浆中，尿酸去除率为96％(图4)。
磷酸盐在pH7.4时，磷酸盐也具有负电荷，同样导致电压依赖性去除率。对于掺加的血浆，在1小时后，有98％的起始磷酸盐被去除(图5)。
结论电泳系统能从小的血液和血浆体积中去除尿毒症毒素。这些结果说明电泳系统的电势可用于治疗肾损害的病人。通过被动扩散或电压依赖性装置可去除尿毒症毒素，这表明本发明电泳系统作为单独透析单元，或作为现有透析技术的附加的作用。在去除磷酸盐时观察到了最重要的益处，所述磷酸盐是在透析病人中需要稳定控制的有问题分子。
β-2-微球蛋白和磷酸盐的去除掺加的缓冲液实验本实验目的是为了研究从掺加的缓冲液中迁移β-2-微球蛋白和磷酸盐。
材料和方法将市售β-2-微球蛋白(Research Diagnostics，Inc)和磷酸盐掺加到20ml液流1缓冲液(缓冲液+20mg/ml葡聚糖-阻断剂)，使其最终浓度为0.1mg/ml(3.23mmol/l)。液流2具有10ml缓冲液+葡聚糖。在0、5、10、15、20、30、45、60和62分钟时，从液流1和2中取样。在60分钟时，切断电压，使液流在最后取样前重新循环2分钟。每个实验进行三重测定，对每个时间点的样品分析三次。
将20mg/mlβ-2-微球蛋白的储备溶液和30μl 200mg/ml磷酸盐的储备溶液的样品(300μl)掺加到60ml缓冲液，得到最终浓度为0.1mg/ml。
结果电泳系统同时使β-2-微球蛋白和磷酸盐发生迁移。磷酸盐的迁移取决于电势，但与pH、离子强度和膜孔径无关(图6、图7和图8)。但是，β-2-微球蛋白的迁移取决于膜孔径、pH、离子强度和施加的电势(图7)。
当施加电压时，在所有施加电势的情况下，1小时后，多于95％的磷酸盐被去除。对于β-2-微球蛋白，当电势增加时，β-2-微球蛋白的去除率增加了。在施加50V、100V和200V电压时，1小时后，β-2-微球蛋白的电压依赖性去除率分别为60±12％、88±1％和92±1％(图6)。
在碱性更强的环境下，β-2-微球蛋白的去除率增加，在pH8.4时，β-2-微球蛋白的去除率为90±1％，而相比之下，在pH7.6时，去除率为77±3％，在pH7.25时，去除率为41±16％。但是，在60分钟后，在所有pH情况下，大于75.6％的β-2-微球蛋白被去除(图7)。
但是，β-2-微球蛋白去除率取决于膜孔径。结果表明，当膜孔径从10kDa增加至100kDa时，β-2-微球蛋白从S1中的去除率分别为76±10％至93±1％(图8)。对于25kDa、50kDa和100kDa膜，β-2-微球蛋白的迁移速率没有明显的差别。
掺加的血液和血浆本实验目的是研究从掺加的血液和血浆中迁移β-2-微球蛋白和磷酸盐。
材料和方法液流1包含30ml新鲜肝素化的血浆或血液，其来自具有正常肾功能的志愿者。在S1中血液和血浆被掺以市售β-2-微球蛋白和磷酸盐，最终浓度为0.1mg/ml(3.23mmol/L)。将15ml缓冲液加上20mg/ml葡聚糖和12单位/毫升肝素置于S2。在0、5、10、15、20、30、45、60、90、120和122分钟时，从S1和S2中取样。在120分钟，切断63V电势，使液流在最后取样前重新循环2分钟。每个实验进行三重测定，对每个时间点的样品分析三次。
将20mg/mlβ-2-微球蛋白储备溶液和15μl 200mg/ml磷酸盐储备溶液的样品(150μl)掺加到30ml血液或血浆中，得到最终浓度为0.1mg/ml的β-2-微球蛋白和磷酸盐。
β-2-微球蛋白的替代来源为透析病人血浆。对于这些实验，使用包含30ml透析病人血浆的S1。将15ml缓冲液加上20mg/ml葡聚糖和12单位/毫升肝素置于S2中。在0、5、10、15、20、30、45、60分钟时，从液流S1和S2中取样。在60分钟时，切断63V电势，使液流在最后取样前重新循环2分钟。每个实验进行三重测定，对每个时间点的样品分析三次。
结果当市售β-2-微球蛋白和磷酸盐掺入肝素化的血液或血浆中时，与缓冲液相比，掺加的市售β-2-微球蛋白和磷酸盐的迁移被阻滞了。对于63.3V电势，在120分钟内，使用100kDa和200kDa膜，分别有5±14％和10±8％的β-2-微球蛋白被去除。相比之下，在相同条件下，血浆中有7％和10±12％的β-2-微球蛋白被去除(图9)。β-2-微球蛋白的去除率与白蛋白(其大小为β-2-微球蛋白的5倍)相当。观察到较大孔径的膜往往具有改善的β-2-微球蛋白去除率。应注意，白蛋白作为分离的第二蛋白标记被去除。当电泳系统用作医疗装置时，将使用具有适于该用途的孔径的膜。对于肾透析，推荐使用不会去除白蛋白的孔径。
相比之下，磷酸盐去除率较高，其从掺加的血液中的去除率为56-64％，而从掺加的血浆中的去除率为79-81％(图9)。高百分比的磷酸盐去除率说明了电泳系统在治疗尿毒症病人中的作用。
对透析病人血浆中的β-2-微球蛋白的迁移进行分析发现，利用电泳系统去除β-2-微球蛋白不是由于现有的透析治疗中发现的膜吸收而产生的(图10)。由此可推论，使用电泳系统将S1中70-100％的β-2-微球蛋白转移到了S2中。在图10中，下方的条表示在应用各种电压后，从S1中去除β-2微球蛋白的百分率，所述电压范围为0-200V。上方的条表示处理后，从S1迁移至S2中的β-2微球蛋白的累计百分率。图11说明了与现有的4小时透析处理相比，经1小时电泳系统处理所得到的β-2-微球蛋白的有效去除率。这些结果说明高达60％的β-2-微球蛋白被去除了，相比之下，利用现有的血液透析处理，约0-40％的β-2-微球蛋白被去除了。
生物相容性方面这部分工作的目的是回答水凝胶膜和电势对于人血浆和血液的细胞和生物化学组分的生物相容性问题。
方法为了研究生物相容性，通过电泳系统处理全血和血浆，并测量溶血、凝固、补体和细胞活化。
从健康志愿者体内抽取血液和血浆，使用0.38％柠檬酸钠或12单位/毫升肝素来抗凝结。在可能的情况下选择肝素作为抗凝剂，以尽可能近地表示透析设置。对于活化的部分促凝血酶原激酶时间(APTT)分析，需要柠檬酸盐作为抗凝剂，以进行测定工作。
将血液或血浆样品(100ml)重新循环在电泳系统设备中，所述设备结构适于用抗凝结的肾透析乙酸盐/碳酸氢盐透析液的缓冲液流(Fresenius Medical Care)进行透析。将63V电势施加至血液/血浆，在0、5、10、15、20、30、45和60分钟时取样。在规定的时间点，测量溶血、凝固(活化的部分促凝血酶原激酶时间[APTT]和凝血酶/抗凝血酶III复合体[TAT])和补体(C3a-des Arg)活化指数，以评估电泳系统的生物相容性。在各个图上的点表示平均值(n＝3，X±SD)。
溶血对于血红蛋白，使用540nm处的吸光度来测量溶血。计算溶解的量，表示为总的可能的溶解百分率，在开始和结束或不同时间点之间的差值作为溶解发生。
APTT(活化的部分促凝血酶原激酶时间)在MLA Electra 800全自动凝血计上使用0.2M氯化钙(得自Gradipore)和PTT试剂(得自Dade Behring，Germany)分析APTT。
TAT(凝血酶/抗凝血酶III复合体)使用Enzygnost TAT ELISA试剂盒(Dade Behring，Germany)来测定TAT的形成。
C3a(补体因子C3a)使用Quidel(California，USA)的C3a-des arg ELISA试剂盒(由Thermo Trace提供)来测定C3a。
血小板、淋巴细胞和嗜中性粒细胞的活性使用流式细胞仪来进行血小板和淋巴细胞活化分析。在电泳系统中，在施加和不施加电势的情况下，处理全血。对于血小板活化，取等分试样，用CD61 PerCP和C62P PE单克隆抗体(Becton Dickinson，New Jersey，USA)染色，并根据FSC/SSC-和CD61-染色性质进行门控。对于淋巴细胞，CD45 PerCP和CD62L PE单克隆抗体(BectonDickinson，New Jersey，USA)用作活化量度。使用FSC/SSC/CD45门控来鉴定淋巴细胞，并分析CD62L表达。对于嗜中性粒细胞，CD45PerCP和CD62L PE单克隆抗体(Becton Dickinson，New Jersey，USA)被用作活化量度。使用FSC/SSC/CD45门控来鉴定嗜中性粒细胞，并分析CD62L表达。
结果溶血测量溶血百分率以确定电势对抗凝结的全血的作用。根据国际标准，小于5％的溶血对医疗装置是可接受的。数据表明，在施加和不施加电势的情况下，所观察到的溶血百分率处于可接受的范围内(图12)。结果还说明电势增加了循环血的溶血作用。但是，在单程通过电场后，仅有0.05％的红细胞被溶解了。
APTT这些实验测量了电势对柠檬酸化的全血和血浆的可凝结性的作用。结果表明，当电势施加全血液或血浆时，尽管观察到APTT时间有小的减少，但这个变化对于健康成人来说处于参考范围25-39秒之内(图13)。APTT时间的变化小于5秒，与健康个体的参照值相比，处于10秒正常范围内。
TAT这些结果显示在肝素化的血液中没有TAT形成，说明没有发生凝固活化。在30分钟后，可观察到TAT复合体的浓度轻微减少或解离，这可归因于辅因子和小分子迁移远离TAT复合体(图14)。聚丙烯腈、丙烯腈共聚物(AN69)、cuprophan和聚砜的试验在27分钟后产生75-175ng/ml TAT，而在对照组中，施加电势的聚丙烯酰胺膜在60分钟后产生小于3ng/ml TAT。
C3a肝素化的血液的C3a-desArg的测量说明聚丙烯酰胺膜和电势没有激活补体途径。在聚丙烯腈、丙烯腈共聚物(AN69)、cuprophan和聚砜的比较试验中，基线对照在27分钟内产生了80ng/ml至过量的3000ng/ml C3a。利用电泳系统，在30分钟时基线对照的C3a水平的最大增量为44ng/ml，在电泳运行期间血液中的C3a被降解或被去除(图15)。
血小板在施加和不施加电势的情况下，用电泳系统处理全血。取等分试样，并用CD61 PerCP和C62P PE单克隆抗体染色。根据FSC/SSC和CD61染色性质门控血小板。测量CD62P表达，其作为血小板活化的指征。对全血施加电势没有使血小板显著活化(图16)。血小板活化的阳性对照为ADP处理。
淋巴细胞处理全血，如图12所示。将等分试样用CD45 PerCP和CD62L PE单克隆抗体染色。使用FSC/SSC/CD45门控来鉴定淋巴细胞，并分析其CD62L表达。阳性对照，即佛波醇(phorbol)肉豆蔻酸醋酸盐(PMA)的处理，使表面CD62L迅速丧失。在施加和不施加电势的情况下，全血的处理对淋巴细胞CD62L表达没有显著影响(图17)。
嗜中性粒细胞在施加和不施加电势的情况下，在电泳系统中处理全血。给全血施加电势对于嗜中性粒细胞的活化没有显著影响(图18)。
结论这些实验的结果说明，使用带有聚丙烯酰胺膜和施加电势的电泳系统技术对于血液和血浆的处理是生物相容的过程。这些结果说明电泳系统没有对补体和凝固体系以及细胞血液组分产生有害影响。组合生物相容性数据和先前的发现，即电泳系统能去除含氮废物，表明该技术在肾损害的病人的治疗中有巨大潜能。这种潜能还在于其可用于其它疾病状态的治疗性处理，所述疾病状态要求从体液中去除有毒物质。
电泳系统的设计在这一部分，使用了两个电泳装置BF200和DF100。BF200为早期型号，主要用于蛋白质纯化/分离。DF100设计用作本发明的小型临床透析装置。
在使用BF200单元时，确定了三个主要问题。它们是高水平的溶血、血液的温度控制和卫生处理。流体流动减少的区域(死区)的存在、尖表面和使用冰桶来控制BF200血液途径的温度，这些都被认为有助于观察溶血。温度也可能是有问题的，因为在血液通过分离单元后，其温度会升至高于可接受的生理限制。为了解决这些问题，做了几项改进，制得DF100，它们描述如下。
分离单元和外壳用于制造DF100的分离单元和外壳被设计成可容易地拆卸，并可通过多种方式来消毒，所述方式包括高压灭菌和化学方法。外壳单元能封闭在S1、S2和缓冲液罐的开式容器，并防止这些区域之间任何交叉污染。分离单元设计为可容易地拆卸以进行清洗，还包括一个用于筒渗漏去污染的区域。DF100具有比BF200较少的死区或尖锐内表面。DF100的所有组件都可通过加热或化学方法来进行消毒。
管道BF200包含管道混合体，其包括普通实验室等级PVC和硅酮，以及组件使用Pharmed(所有管道都来自Masterflex)。因为BF200包含许多不同的管道，这会引发血液的不同反应，所以在DF100中使用单管类型。选择用于DF100的初始管道类型为C-Flex(Masterflex)，因为制造商宣称C-Flex具有“优异的生物相容性”。在试验时，C-Flex没有产生任何生物不相容性反应，但是在长期使用后，它不能经久耐用。泵倾向于在实验过程中将小片段的管道释放到液流S1、S2或缓冲液中。为了消除碎裂问题、满足医学指导方针并减少将来需要测试的材料的量，所使用的最终管道为目前在医院血液管道中所发现的材料。大部分的现有血液管道都是由PVC制成，因此C-Flex可由医疗等级的蠕动PVC(Tygon LFL，得自Masterflex)来替代。
温度控制在BF200中，在血液和血浆实验过程中的温度测量说明，控制温度的冰桶方法在处理血液/血浆时不太理想。对BF200的不同构型(血液/血浆、并联电流/反向电流、正/负冷却、不同的电源组、单程/多程)分析表明，根据构型，温度可在5℃至22℃之间变化(图19)。BF200的研究结果确实说明了，在通过分离单元时会产生平均8℃的增加。生理血液样品从37℃增加8℃被视为不可接受的。为了减轻温度问题，DF100的结构可使得在进入分离单元前冷却血液/血浆，这与BF200和现有的透析疗法相反。一旦血液离开DF100分离单元，预计血液具有生理温度，适于返回至病人。DF100流体回路设计使得血液和缓冲液在进入分离单元前被外部换热器/冷却器单元冷却。可使用换热器/冷却器来取代冰桶，以给系统提供更好的温度控制。
DF100流体回路的温度分析表明，对于血液/血浆回路，经一小时后可得到-0.8℃±0.9℃(平均值±S.D.)的总温度变化。相比使用BF200的所观测到的增加8℃，DF100具有显著改善。
DF100的开发是为了改善溶血、血液温度控制和卫生处理，下面将通过试验来确定这些改进是否改变了电泳系统的生物相容性。
生物相容性本实验的目的是评估电泳系统DF100的生物相容性方面。
方法为了评估生物相容性，将全血和血浆用电泳系统处理，根据生物相容性方面的研究测量溶血、凝固、补体和细胞活化。
结果溶血测量溶血百分率，以确定在抗凝结的全血中电势对红细胞溶解的作用。根据国际标准，对医疗装置而言，小于5％的溶血是可接受的。数据表明，在施加和不施加电势的情况下，所观测到的溶血处于可接受的范围。结果还说明，电势增加了重新循环血液的溶血。当80V电势施加至重新循环的血液时，可观察到溶血增加。施加80V电势可导致小于1％的红细胞溶解，这小于可接受的国际标准(5％)，并被公认是由于温度增加引起的。然而，在63.3V电势下，血液重新循环后，观测到小于0.5％的溶血。使用63.3V的溶血在0V背景值的误差范围内(图20)。
凝固DF100的APTT时间的测量显示与BF200生物相容性研究的观察值没有区别。
TAT形成在肝素化的血液中TAT形成说明凝固活化没有发生。聚丙烯腈、丙烯腈共聚物(AN69)、cuprophan和聚砜的试验在27分钟后产生了75-175ng/ml TAT，而施加电势的聚丙烯酰胺膜在60分钟实验期间保持TAT浓度为6±2ng/ml TAT(图21)。
补体C3a肝素化的血液的C3a-desArg测量说明，聚丙烯酰胺膜和电势没有激活补体途径。在聚丙烯腈、丙烯腈共聚物(AN69)、cuprophan和聚砜的比较性试验中，在27分钟内，从基线对照产生80ng/ml至过量的3000ng/ml C3a。利用电泳系统，基线对照的C3a水平的最大增长值为平均46ng/ml，施加电势后没有观察到C3a活化的显著变化(图22)。
结论DF100生物相容性实验的数据说明溶血的改善。凝固和补体测量提示，虽然对该过程进行了改善，但对于这些因素没有显著的改善。根据60V和80V溶血数据的比较，可使用较大的电势来加快尿毒症减少步骤，因为在80V的溶血率小于5％。
电势实验的目的是研究在DF100中可以对血液施加的最大电势，使用溶血作为细胞损害的量度。
方法使用组合电源，其限于2A和150W，在1小时内将血液(100ml)通过DF100。所施加的电压为63V、80V、100V、125V、150V和200V。在0、5、10、15、30、45和60分钟时，使用本文先前描述的分光光度法测量溶血。
结果由这些实验得到的结果主要是初步的，因为在100V、125V、150V和200V的数据为n＝1，而在0V、63V和80V的数据为n≥4。数据显示了一个趋势，其中随着电压和瓦特数的增加，溶解以试验性的“S”曲线方式增加(图23)。溶血增加似乎更归因于分离单元中所生成的热(瓦特数)而非真正的电势。随着瓦特数增大以及通过分离单元的血液温度增加，可观察到相应的溶解增加。当进行两个150V实验比较时，可看到更有效地冷却血液的好处(图23)。一次电泳运行的血液途径通过换热器循环两次，而其它电泳运行使血液通过换热器一次。使血液通过换热器两次，从而使其在进入分离单元前被进一步冷却，这导致溶血的减少。然而，对于血液在进入分离单元前被冷却的程度有一个限制。血液冷却限制的原因是，随着血液/血浆温度的降低，蛋白质有可能开始沉淀，或生物系统在重新加热至生理条件后被激活。第1阶段动物试验-对于电泳系统的生物相容性的研究这项研究的目的是使用体内绵羊模型来确定电泳系统技术的生物相容性。使用电泳系统来处理6只绵羊，分析电泳系统对细胞和血浆的影响。在没有电泳系统组件的情况下，使用另外6只羊来确定体外回路的基线效果。使用体外回路和经颈动脉-颈静脉的分支通路来处理全血和血浆，从而评估生物相容性。通过测量实验方法和对照方法对于血液学和生物化学参数的影响来评估生物相容性。
实验程序使用绵羊作为模型来研究电泳系统在处理血液(图24)和血浆(图25)时的生物相容性。所使用的绵羊99为健康的杂交阉羊，体重约50至70kg，年龄为2岁。在所有的程序中，在全身麻醉下，对动物的颈动脉和外部颈静脉血管直接进行造口术，从而得到血管通路。在颈动脉和颈静脉之间插入支路100，该方法概述于An Ovine CarotidJugular Shunt Model for Haemocompatibility Testing of Biomaterial(Tatarinoff V，Poole-Warren LA，Tunstell A and Schindhelm K.TheCooperative Research Centre for Cardiac TechnologyGraduate School ofBiomedical Engineering，University of New South Wales，Sydney 2052.An Ovine Carotid Jugular Shunt Model for Haemocompatibility Testing ofBiomaterials)。
用普通盐水开始体外回路，并将10000IU肝素加至最后一个袋中。在使用时，准备好电泳系统筒，以进行直接抽取。初始推注(bolus)肝素(5000IU)，然后在处理期间每小时推注5000IU肝素，从而实现抗凝。在使用电泳系统的一些步骤中，抗凝结方式可连续注入肝素到电泳系统管道而加以补充。通过使用泵105将肝素溶液104通过市售无菌肝素管道106运送到动静脉回路101，从而实现肝素注入。
在血液通路实现后，从支路收集基线血液样品。然后将动脉101和静脉113分别与颈动脉和颈静脉血管相连，并通过血液回路使用Gambro血液泵103来建立血流。在收集动脉102和静脉112血液样品前，将血液循环10分钟。如果该方法使用了血浆分离器114，那么在收集另一套动脉102和静脉112血液样品前，使血浆另外流动5分钟。
电泳系统108方法的组成有筒，以及在管线内在筒前的换热器和用于维持血液或血浆温度的辅助设备，还有将血液输送至电泳系统108的泵。在有和没有对全血(图24)或血浆(图25)进行电活化的情况下，实施电泳系统方法，其中所述全血或血浆由细胞组分分离得到，并在处理后还原。当处理全血时，使用与电泳系统108相连的泵，从动静脉回路101通过管107将血液直接抽出。然后通过电泳系统108处理血液，并在血液收集容器110中通过管109重新整合。然后将血液通过管111、样品口112和管道113返回至绵羊99。当处理血浆时，使用膜血浆分离器114，其中血浆从血浆出口115流出，而血液的细胞物质从血液出口117流出。然后利用位于血浆出口115处的泵116将血浆从血浆分离器114输出，并与细胞物质还原，通过管道117进入血液收集容器110。在血液容器110内混合的全血通过管道111、样品口112和管道113被输送回绵羊99。当通过电泳系统108处理血浆时，使用与电泳系统108相连的泵从血浆分离器114直接采血。然后用电泳系统108处理血浆，通过管道109来输送，并在血液收集容器110中与血液的细胞组分重新整合。然后通过管道111、样品口112和管道113返回至绵羊99。
当使用电活化时，其在ABAB形式下实施。初始将电活化关闭1小时(A)，然后打开1小时(B)，再关闭1小时(A)，和再打开1小时(B)，以确定电场对绵羊血液化学性质的影响。
在这个研究中使用十二只绵羊。在有和没有电活化的情况下处理三只绵羊的全血(第1组)。在有和没有电活化的情况下，处理另外三只绵羊的血浆(第2组)。对于第1组和第2组，通过电泳系统以20ml/min的速度处理血液和血浆。在电泳系统ABAB程序的各个阶段，从时间0开始，在5、10、30和60分钟后，从动脉和静脉取样口同时采集血液和血浆样品(表1、表2)。对于第1组和第2组，在收集最终血液样品后，使绵羊安乐死，对膀胱的内容物取样。使用另外六只绵羊进行基线研究，以确定在该程序中外科手术和体外血液回路的作用。在回路中没有电泳系统的情况下实施这些程序。将三只绵羊采用全血程序，不分离血浆(第3组)，另三只绵羊采用血浆分离程序(第4组)。对于第3组和第4组，在建立血液或血浆回路后，记录时间0。从时间0开始，在t＝5、10、30、60、90、120、180和240分钟时，收集动脉和静脉血液样品(表3、表4)。在采集最终血液样品后，使绵羊安乐死，对膀胱的内容物取样。
在全程序过程中，以10分钟间隔记录脉搏、呼吸速率、氧气分压(SpO2)和温度。将在该程序之前、期间和之后所采集的血液和尿素样品进行测试，以确定程序对血液的细胞组分以及肝功能和电解液的任何影响。通过外面的实验室来测试血液样品，分析结果如表5所示
表1.程序图第1组-利用电泳系统的全血

表2.程序图第2组-利用电泳系统的血浆

表3.程序图第3组-没有电泳系统的全血

表4.程序图第4组-没有电泳系统的血浆

表5.在外面测试的血液分析物生物化学血液学葡萄糖RBC尿素 Hb肌酸酐PCV蛋白质MCV白蛋白MCH球蛋白MCHCA-G比 WCCT-胆红素 差别的C-胆红素 带GLDH 嗜中性粒细胞碱性磷酸酶淋巴细胞AST 单核细胞γGT 嗜酸性细胞B-OH BUT 嗜碱细胞CK其它镁血小板钙总溶血磷酸盐RDW钠钾氯化物碳酸氢盐统计方法对于每一小时段，计算加权平均值，其相当于“在曲线下的面积”。使用梯形方法来计算。注意，当这样计算平均值时，在30和60分钟时的观测值的权重比在0、5和10分钟时的观测值的权重要大。还要注意，在步骤前的(基线)样品未被包括在计算中。
可能影响所测变量的因素有实验组，G＝{BG，PG，B，[P]，时间段P＝{A1，B1，A2，B2}，取样部位SI＝{A，V}，以及绵羊S＝{1 ，2，...，12}。实验组可处理为一个因素，其具有4个水平，或作为两个交叉因素，血浆PL＝{0，1}，电泳系统GR＝{0，1}。
绵羊因素为全捕捉因素(catch-all)，其包括该步骤选择的具体绵羊所产生的随机变量，以及所有其它每日变量，否则其不能考虑在内。在方法中的溶质浓度可能反映基线、方法前水平。理想地，分析时将此考虑在内。
实验设计为“重复测量类型”，其具有两个绵羊间的因素，PL和GR，两个绵羊内的因素，P和SI。绵羊间因素PL和GR的测试，通过对每只绵羊的八个观察值(4个时间段×2个取样部位)进行计算，以基线水平(初始动脉样品)作为共变量(covariate)，从而对平均值使用共变分析。Frison和Pocock(Frison L和Pocock SJRepeatedmeasures in clinical trialsAnalysis using mean summary statistics and itsimplications for design.Statistics in Medicine 111685-1704(1992))推荐使用该方法，作为调节在基线水平内变化影响的最佳方法。例如，该方法确定了，在回路内，有电泳系统时实验的平均水平X是否不同于没有电泳系统时实验的平均水平。
绵羊内因素P和SI，以及它们与PL和GR的交互作用的总测试使用重复测量方差分析与Huynh-Feldt校正因子(Stata Corp.1999.StataStatistical SoftwareRelease 6.0.College Station TXStata Corporation)来进行。这些试验确定了Y水平是否在步骤中发生变化，和差别形式是否受电泳系统影响。
按Harris(Harris RJ.″AnovaAn Analysis of Variance Primer″，F.E.Peacock，Itasca IL，1994)所述，进行具体对照实验。这些试验研究差别模式，表明当电泳系统在回路中或当电源打开时，模式是否不同。
对于每只绵羊计算P和SI水平中的许多对照值，并测试每个对照值作为在普通单变量方差分析中相对于PL和GR的因变量，这包括附加试验，其中变量的总平均值不为零。例如，在将对照P1相对于PL和GR的变异数分析(anova)中，GR的F比率就是P1×GR交互作用的检验。
测试了在时间段中的四个对照值。系数和比较动脉和静脉的对照值S1一起列于下表。P1是B和A阶段的对照值(相应于在使用电泳系统时，电源打开和电源关闭)。P2将第二AB循环与第一AB循环进行比较，而P3将第二循环中的B-A差异与第一循环的B-A差异进行比较。这三个对照为正交的(它们系数向量的标量积为零)，并且它们一起说明了在4个时间段内的所有变化。对照值P4仅比较了在第一循环中的B和A。
如果溶质Y的水平有稳定增加或降低的倾向，那么P2值就是P1值的两倍，以及P3为零。如果电泳系统电源打开会引起Y水平升高，那么在电泳系统组中仅有一个正P1，因此GR×P1交互作用为正。
主要和先验关系的具体试验P*GR交互作用。当电泳系统在回路中时，随时间的模型(如果有的话)是否不同？这在重复测量anova中进行测试。
P1*GR交互作用。B-A差异是否取决于电泳系统？这通过对对照值P1进行anova来测试。
P4*GR.B1-A1差异是否取决于电泳系统？在第二循环中，由于凝结，电源实际上没有同样打开，因此这个比较可能更能说明电泳系统活化的任何效果。
结果和讨论术语“生物相容性”不具有单一、全面的和统一接受的定义。Jonathan Black(Black J.Biological performance of materialsfundamentals of biocompatibility，2nd edition，Dekker，New York，1992)将它描述为“在特定应用中的生物学性能，以判断其是否适合该情形”。它是评估步骤、装置或材料对于生命系统的生理学的影响的概念。
本研究的目的是评估电泳系统的生物相容性。电泳系统具有几个涉及生物相容性的问题。首先，筒、膜、换热器和管道的设计和材料都会影响方法的生物相容性。其次，电场对血液或血浆的作用仍是以离体设置所得到的。
在试验中，在体外方法中所有的动物都存活了，总体上，动物对电泳系统方法有很好的耐受性。在研究过程中，采集并分析了多于16000个数据点。在对照组和处理组之间没有发现任何关于生物化学或血液学值在统计上的显著性不利效果。
通过协方差分析，将绵羊间试验的结果总结于表6-Ancova汇总表。通过重复测量方差分析，所有绵羊内试验有关取样点和时间段的影响的结果总结于表7-重复测量汇总表-SI和P。具体的绵羊内对照的统计分析的总结参见表8-绵羊内对照。
生物化学和血液学数据的统计分析说明，球蛋白、白蛋白和总蛋白水平受到回路中电泳系统存在的影响。这种影响可分为两个部分当电泳系统处于回路时由于较大的血稀释而产生的初始降低，和在电泳系统过程中由于较多采样产生的下降趋势。还可能的是，通过电泳系统特别是在激活电场时，去除比膜小的蛋白质。
开始时，由于体外回路的血稀释影响，在所有动物中，球蛋白、白蛋白和总蛋白水平下降了，然而在方法过程中它们保持稳定或继续缓慢下降。协方差分析说明，血浆滤器和电泳系统都降低了平均蛋白水平，它们的作用是叠加的。因为将各种组分加入到体外体积中，这将是预料之中的。在时间段之间和显著P*GR交互作用之间的水平也有显著的差别。绵羊内对照P1和P2对于球蛋白、白蛋白和总蛋白是非常重要的，P2*GR交互作用对于所有三者是显著性的(p＜0.05)。这种作用来自于在电泳系统过程中发生的血液采样增加。这种作用对于球蛋白和总蛋白比白蛋白更显著，这是由于如下事实在电泳系统过程中，较低分子量的白蛋白比较大分子量的蛋白更快地从体外储库中得到补充。因此，白蛋白∶球蛋白的比率随着时间而增加。
在几乎所有动物中，在四小时的过程中，葡萄糖水平保持稳定，或缓慢增加。结果说明在所有组中葡萄糖水平总体上有增加趋势，这与电泳系统的存在无关。
在大多数动物中，总胆红素和结合胆红素水平是相对稳定的，在过程进行中这两者明显有缓慢的增加。但是，似乎能可靠地推论出，这些趋势与过程中电泳系统的存在无关。
在对照和处理动物中，随着过程的进行，GLDH水平是稳定的，而碱性磷酸酶水平趋向于增加。统计分析说明，血浆过滤或电泳系统对GLDH或碱性磷酸酶水平没有显著影响。
对于所有动物，在整个过程中，AST和γGT水平是相对稳定的，在大多数动物中，随着过程的进行，AST水平有较缓慢的降低。统计分析说明，在γGT的动脉和静脉水平之间有显著的差异，这与电泳系统的存在无关。
对于所有动物，在整个过程中，B-OHBUT和CK水平是相对稳定的，在大多数动物中，随着过程的进行，其水平有较缓慢的增加。当电场第一次失去作用时，一个血液经电泳系统处理的动物在CK水平上显示急剧的降低。然后在过程剩余时间内，该动物内的水平保持低值。在所有组和试验期间，CK的静脉水平一直比其动脉水平平均高出2.5U/I。
在体外过程中，如预计的那样，生物化学值如尿素、肌酸酐和大多数电解质是相对稳定的。
对于所有动物，钾的水平是相对稳定的，统计分析表明其在所有组中有增加趋势，这与方法中电泳系统的存在无关。
在几乎所有动物中，碳酸氢盐水平显示少量增加，该模式对于四组动物都是一致的。在所有组中和整个过程期间，静脉水平一直比动脉平均低0.6mM。
统计分析表明，在整个过程中，镁和钙水平下降了，这与回路中电泳系统的存在无关。
由于体外回路的血稀释作用，RBC、PCV和血红蛋白水平初始下降了，然后对于大多数动物，由于剩余过程中的样品采集，它们保持相对稳定或缓慢降低。统计分析表明，各组之间RBC、PCV或血红蛋白水平的差异不显著。没有其它显著性影响。
对于所有动物，在整个过程中，MCV、MCH和MCHC是相对稳定的。统计分析表明，各组之间MCV、MCH或MCHC的差异不显著。
在过程开始时，对于所有情况，白细胞数量(WCC)降低了。血浆组效果最显著，如不是全部也基本上是由于嗜中性粒细胞数量降低而产生的。在血浆组中，开始30至60分钟内，嗜中性粒细胞实际上不处于循环中。因此，在所有组中，在整个过程中细胞计数稳定增加。在血浆组中，由于早期嗜中性粒细胞减少，平均WCC显著较低(p＝0.02)。平均嗜中性粒细胞也显著较低，但差值不满足统计显著性(p＝0.06)。根据重复测量方差分析，细胞计数的增加趋势对于WCC和嗜中性粒细胞都是高度显著的，该趋势不受血浆滤器或电泳系统的影响。
在大多数动物中，淋巴细胞、嗜酸性细胞和单核细胞水平是相对稳定的。
在方法实施后，膀胱尿体积通常很低。动物的流体平衡受几个因素的影响。首先，体外回路的连接导致过程开始时100ml(对照血液)和250ml(血浆)的净损失。这可用等体积的来自连接回路的肝素化的盐水来补充。其次，样品总体积范围为150ml(对照血液)至275ml(血浆)。第三，在4小时过程中，由于呼吸的流体损失总计高达300ml。在过程中，后者的流体损失可由静脉滴注的Hartman′s溶液来替换。但是，平均起来，对于一些动物，在每个过程中施用3升Hartman氏溶液会导致可能的流体过载。
表6绵羊间的因素试验Ancova模型

表7重复测量ANOVA-SI和P，对SI的测量


表8重复测量ANOVA-SI和P，对P的测量


缓冲液和电解质实验这些实验的目的是研究在对全血的电泳系统处理过程中电解质的浓度。另外，还研究了不同缓冲液(乳酸盐和乙酸盐-碳酸氢盐缓冲液)及缓冲浓度变化对经电泳系统处理的全血的影响。
方法在血液和血浆电泳系统运行中使用乳酸盐缓冲液和各种浓度的Fresenius缓冲液。电泳系统运行在0、5、10、15、30、45和60分钟时取样。离心分离血液，对血浆分析其游离血红蛋白。通过NATA认可的病理学实验室对血液和血浆样品测定电解质和葡萄糖浓度。
结果电解质在较大体积的尿毒症废物去除实验中，测量电解质(钙、氯、镁、磷、钾和钠)以及尿素、肌酸酐和磷酸盐浓度。电解质分析发现一个趋势，其表明在血液用电泳系统处理后，钠和氯浓度增加，高于正常水平(图26)。但是，由于血液用电泳系统处理，其它电解质(钙、镁、磷和钾)浓度下降。当处理血浆时，所有的电解质浓度降低了(图27)。在电泳系统处理后将血浆与全血的电解质浓度进行比较，结果表明血液的细胞组分可影响钠和氯浓度。为了确定钠和氯浓度的增加是否与缓冲液相关，用乳酸盐缓冲液(Baxter PD透析液)替换乙酸盐-碳酸氢盐透析液。改变缓冲液后，同样观察到钠和氯水平的增加(图28)。
为了在电泳系统处理后减少钠和氯浓度的累积，减少乙酸盐-碳酸氢盐缓冲液的浓度。预计，通过减少透析液中氯化钠的浓度，结果其累积将减少。通过将透析液的钠浓度从139.8mM减少至130mM，在电泳系统处理后，仅观察到钠和氯浓度的微小变化(图29)。然后测试Fresenius透析液与水1∶1的稀释液对血液中钠和氯累积的影响。为了保持1∶1稀释的透析液的等渗性，加入葡萄糖，使渗透摩尔浓度恢复至初值。使用1∶1透析液可导致在电泳系统处理后血液中钠和氯累积量的降低(图30)。然而，这还可导致血液中葡萄糖的急剧增加(图30)。
初步结果说明，降低透析液的盐浓度和调节溶液的等渗性会改善最终的钠和氯水平。通过用其它电解质替代过量的钠和氯来制备透析液，所述其它电解质在处理过程中发现减少了。或者，电解质可用其它能保持透析液等渗性的非离子分子来替代。另一种可替换的方法是将目前的重新循环透析系统改变为单程系统。
溶血因为在透析液中存在的盐浓度通过稀释降低了，所以有必要研究这对于溶血的影响。这些实验表明，Fresenius的轻微稀释使钠浓度从139.8mM降低到130mM(“稀释Fresenius′)，从而引起溶解量的轻微但不希望的增加。用水按1∶1稀释Fresenius缓冲液，补充葡萄糖来校正由于稀释产生的总渗透摩尔浓度变化，与在80伏电势下的Fresenius原液相比，这对溶血具有有益效果。这可能是因为以下事实，即稀释Fresenius透析液导致较低的电导率，从而在施加电压时，产生较低的温度增加。使用乳酸盐腹膜透析流体(Baxter)被公认能增加溶血，从而可能不是适当的缓冲液，而不能用于电泳系统中进行透析(图31)。
结论该数据表明，较低电导率缓冲液不仅对溶解具有有益效果，而且能减少在血液流中钠和氯的盐累积。
电泳系统的其它用途本发明的电泳系统可用于在要求从体液中去除有毒物质的其它疾病状态的治疗中。下文简述几种任选用途。
肝透析肝衰竭的死亡率为80-90％，且为快速死亡(一周或两周)，还没有有效的肝移植。在肝衰竭中，体内有毒含氮产物(即，氨、trytophan、苯并二氮杂(benzodiazepines)、GABA、醋氨酚)、外源生物组分、电解质和水失调的形成可引起严重损害。现有技术为发展中技术，作为时间上的过渡，直至能确定合适的移植。这些技术使用各种滤器类型来去除形成的过量分子和毒素，其已在血液中累积。在肾透析领域中，已显示电泳系统能去除代谢产物、过量盐、选择性去除蛋白和控制流体失调，且是生物相容的系统。因此，本发明系统可以作为附加包括在肝透析治疗中，以帮助增加找到合适的肝移植的过渡时间。
细胞因子炎性细胞因子，如IL-6、TNFα和IL-1β在败血病、休克和器官衰竭的发病机理中具有作用。不希望去除所有的细胞因子，但已开展工作来减少在病人中存在的过量的细胞因子。一项研究对细胞因子、可溶解的受体和/或受体拮抗剂使用了治疗性单克隆抗体，但其没有产生任何临床显著性结果。另一项研究涉及使用血液滤过/血液透滤来减少存在的细胞因子的量，但是他们认为其结果的临床相关性有待进一步研究。初步数据表明，本发明系统可以减少/去除细胞因子。这些实验的结果说明，细胞因子如IL-6可通过本发明系统来去除。
总体讨论和结论本研究的目的是确定基于膜的电泳在用作临床医疗装置方面的可行性。体外和体内生物相容性参数如凝固、补体、溶血和初步细胞活化表明，对于所测的生物相容性参数，通过本发明系统和方法进行的血液和血浆治疗是生物相容的方法。在动物研究过程中，动物对本发明的程序有很好的耐受性。对于任意的生物化学或血液血值，在对照组和处理组之间没有发现统计上显著不利的影响。分子清除的体外分析表明高电荷与质量比的尿毒症毒素如磷酸盐可被本发明系统有效去除。而在生理条件下具有低电荷与质量比的尿毒症毒素如尿素(中性)不能被本发明系统和方法有效地去除。因此，使用电泳系统作为现有技术的附加，可增强对于有问题的尿毒症毒素如磷酸盐和带电中等分子毒素的去除效果。本发明系统可结合任意现有的医疗技术，其包括血液透析、血液滤过、血液透滤、REDY吸着剂血液透析和/或甚至是血浆去除。
为了准确调整本发明的电泳系统在临床装置上的用途，并协助确定放大系统的要求，着手进行了几项初步研究。确定可施用于血液的最大电压的研究表明，增加电势参数可导致相应的溶血增加。溶血增加看起来与电势产生的热量增加有关，而不是与电势本身相关。
对于缓冲液组成的研究表明，减少透析液的盐浓度同时保持等渗环境可能是使用生理性盐溶液的一个可行的替代。较低电导率和较低盐浓度的好处包括减少血液流中钠和氯的形成，这在使用生理性盐缓冲液时观察到。
可以增加迁移/去除率，同时具有低电导率。能够增加电势会给被确定有问题的尿毒症毒素提供改善的迁移速率。
减少热量。较少的热量生成会导致较少的细胞溶解，并使施加于系统的最大电势提高。
基于体内和体外研究，本发明系统的逻辑改善包括控制缓冲液电导率的自动化反馈机制；控制稳定的自动化反馈机制；换热器可修改成由不同的生物相容材料如金属(例如钛)和聚合物制成或涂布；整个换热器体系可被修改，通过引入不同的装置例如帕尔帖冷却系统来适合用于控制温度；分离单元的改变如入口和出口的改变以容纳粘性生物流体，如血液和血浆；将筒改变为较少湍动和有角度的；将格子结构改变为更稀疏或包括不同的图案以适合被处理的流体；包括措施以减少或控制静脉或动脉压力对筒的作用；引入装置以在换热器和/或分离单元前以自动化方式引入抗凝剂；使用泵或装置，所述泵或装置能引导或输送流体但不破坏或溶解细胞；适合的监视器以测量处理过程中的流体参数、清除率水平和安全方面的参数；使用缓冲液，其包括许多成分来适合单个测量；使用缓冲液，其能增强处理；使用单程的或重新循环的缓冲液系统，或部分重新循环系统；控制流体水平；使用不同膜的性质来增强处理。
本发明的电动透析使用基本上不同的原动力，即电场，以从病人血液中去除污染性溶质。在文献中还未描述过用电场来进行肾透析应用或从血液中去除尿毒症毒素。本发明从病人血液中去除溶质和小蛋白，这取决于溶质和小蛋白的电泳迁移率，它是污染性分子电荷与质量比的函数。溶质去除的基础不同于前述溶质去除模式，它们完全基于污染分子的大小或扩散迁移率。
在去除所选择的尿毒症毒素的同时，本发明还可去除已知为中等分子的蛋白。困扰长期肾透析病人的中等分子为β2-微球蛋白，其在血液中累积，然后在骨和关节内聚合，具有严重的临床后果。为了改善病人的生活质量，在实验中使用基于膜的电泳来减少β2-微球蛋白。
透析治疗不仅需要能去除废代谢物和其它有问题的分子，还要求这些治疗方案对病人是安全的。安全性的重要方面是膜材料和处理系统的生物相容性。本研究显示，与现有的临床使用的膜类型相比，基于膜的电泳处理提高了凝固和补体领域中的生物相容性。类似地，在任何这些标准生物相容性测量上，基于膜的电泳处理没有不良影响。
本领域技术人员会认识到，可对本发明的具体实施方案进行各种变化和/或修改，而不背离本发明所广泛描述的精神和范围。因此，本发明的实施方案应在所有方面认为是说明性的而非限制性的。
权利要求
1.一种从受试者的血液或血浆中去除代谢组分或降低其浓度的电泳系统，所述系统包括(a)在阴极区域的阴极；(b)在阳极区域的阳极，该阳极相对于阴极设置，使得在阴极和阳极之间施加电势后适于在两者之间的电场区域产生电场；(c)具有确定孔径和孔径分布的第一离子渗透屏障，其位于电场区域内；(d)具有确定孔径和孔径分布的第二离子渗透屏障，其位于阴极区域和第一屏障之间以便在其中形成处理室；(e)适于冷却受试者的血液或血浆的装置；(f)适于将透析液提供给阴极区和阳极区的装置；以及(g)适于将受试者的血液或血浆提供给处理室的装置，其中在施加电势后，所述装置使得血液或血浆的代谢组分迁移通过至少一个屏障进入到阴极区域或阳极区域中的至少一个。
2.如权利要求1所述的系统，所述系统还包括(h)适于将处理过的血液或血浆返回给受试者的装置。
3.如权利要求1所述的系统，其中第一屏障和第二屏障具有相同的确定孔径和孔径分布。
4.如权利要求1所述的系统，其中第一屏障和第二屏障具有不同的确定孔径和孔径分布。
5.如权利要求1所述的系统，其中屏障为由聚丙烯酰胺(polyaccrylamide)形成的水凝胶膜。
6.如权利要求1所述的系统，其中屏障具有确定孔径和孔径分布，使得血清白蛋白不能迁移通过。
7.如权利要求1所述的系统，其中屏障具有小于约60kDa的名义截留分子量。
8.如权利要求1所述的系统，所述系统还包括具有确定孔径和孔径分布的第三离子渗透屏障，其位于电场区内形成第二处理室。
9.如权利要求1所述的系统，所述系统还包括具有确定孔径和孔径分布的多个离子渗透屏障，其位于电场区内形成多个处理室。
10.如权利要求1所述的系统，其中形成处理室的屏障以位于系统的电极区域之间的筒或盒的形式提供。
11.如权利要求10所述的系统，其中筒或盒是从适于包含或容纳该筒的电泳装置中可拆除的。
12.如权利要求1所述的系统，其中冷却装置选自气体、液体或固体传热系统、冷却流体套换热器和珀耳帖冷却器。
13.如权利要求12所述的系统，其中冷却装置为气体、液体或固体传热系统。
14.如权利要求1所述的系统，其中阴极区域和阳极区域通过泵送装置供以透析液或缓冲溶液。
15.如权利要求1所述的系统，其中血液或血浆通过泵送装置提供给处理室。
16.如权利要求1所述的系统，其中电极区域和处理室的结构使得相应的透析液和血液/血浆流动通过其中而形成液流。
17.一种去除受试者血液或血浆中的代谢组分或降低其浓度或量的方法，所述方法包括(a)将受试者的血液或血浆放入电泳系统的处理室内，所述电泳系统包括在阴极区域的阴极；在阳极区域的阳极，该阳极相对于阴极设置，使得在阴极和阳极之间施加电势后，适于在两者之间的电场区域产生电场；具有确定孔径和孔径分布的第一离子渗透屏障，其位于电场区域内；具有确定孔径和孔径分布的第二离子渗透屏障，其位于阴极区域和第一屏障之间以便在其中形成处理室；适于冷却受试者的血液或血浆的装置；适于将透析液提供给阴极区域和阳极区域的装置；以及适于将受试者的血液或血浆提供给处理室的装置；(b)在阴极和阳极之间施加电势，使得血液或血浆的代谢组分迁移通过屏障进入至少一个电极区域；(c)继续步骤(b)，直至从血液或血浆中去除所需量的代谢组分；和(d)将处理室内处理过的血液或血浆返回至受试者，其中该方法基本上不会使血液或血浆被加热至高于约37℃的生理温度。
18.如权利要求17所述的方法，其中将血液或血浆通过电泳系统的冷却装置，以在血液或血浆被送至电泳系统的处理室前降低其温度。
19.如权利要求18所述的方法，其中血液和血浆在返回受试者之前在处理室内被温热至生理温度。
20.如权利要求17所述的方法，其中受试者为肾透析病人。
21.如权利要求17所述的方法，其中血液或血浆优选在受试者和处理室之间重新循环。
22.如权利要求17所述的方法，其中在电泳过程中，血液或血浆的细胞和生物分子组分基本上被保留在处理室内，或如果它们进入屏障，基本上被阻止进入阴极或阳极区域。
23.如权利要求17所述的方法，其中代谢组分选自溶质、含氮废物、中等分子量蛋白、有害蛋白及其混合物。
24.如权利要求23所述的方法，其中溶质为磷酸盐，含氮废物为尿素和尿酸，中等分子量蛋白为β-2微球蛋白，而有害蛋白为自身抗体。
25.如权利要求1 7所述的方法，其中在所述方法操作期间，施加的电势基本上不会不利地影响存在于血液或血浆中的细胞或蛋白。
26.如权利要求17所述的方法，其中血液或血浆进入处理室的流速为20-1000ml/min。
27.如权利要求17所述的方法，其中所施加的电势高达约100伏特。
28.如权利要求17所述的方法，其中在将血液或血浆应用至电泳装置之前、之后和/或之中，对受试者进行血液透析。
29.一种去除受试者血液或血浆中的代谢组分或降低其浓度或量的方法，所述方法包括(a)对病人的血液或血浆进行血液透析；以及(b)将血液透析病人的血液或血浆按照权利要求17所述的方法进行处理。
30.如权利要求1所述的系统在肾病人透析中的应用。
31.如权利要求1所述的电泳系统与人工肾、血浆分离装置或脱落装置一起在协助病人透析中的应用。
全文摘要
本发明提供一种从受试者的血液或血浆中去除代谢组分或降低其浓度的电泳系统，所述系统包括(a)在阴极区域的阴极；(b)在阳极区域的阳极，该阳极相对于阴极设置，使得在阴极和阳极之间施加电势后可在两者之间的电场区域产生电场；(c)具有确定孔径和孔径分布的第一离子渗透屏障，其位于电场区域内；(d)具有确定孔径和孔径分布的第二离子渗透屏障，其位于阴极区域和第一屏障之间以便在其中形成处理室；(e)适于冷却受试者的血液或血浆的装置；(f)适于将透析液提供给阴极和阳极的装置；(g)适于将受试者的血液或血浆提供给处理室的装置，其中在施加电势后，其使得血液或血浆的代谢组分迁移通过至少一个屏障进入到阳极区域或阴极区域中的至少一个。
文档编号B01D61/42GK1551795SQ02817361
公开日2004年12月1日 申请日期2002年9月4日 优先权日2001年9月4日
发明者史蒂文·安东尼·博托, 菲利普·约翰·勒特, 埃利·路易丝·法拉穆斯, 舍尼舍瑞·哈里哈瑞恩·奈尔, 约翰 勒特, 史蒂文 安东尼 博托, 瑞 哈里哈瑞恩 奈尔, 路易丝 法拉穆斯 申请人:格拉迪普有限公司