专利名称：：高密度核材表面包裹琼脂糖凝胶薄壳介质的制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种油水两相法制备高密度核材表面包裹琼脂糖凝胶薄壳介质的方法，属于惰性颗粒负载于凝胶载体中的微球制备技术。
背景技术：
：膨胀床技术是九十年代初逐渐兴起的一种新型集成生物分离操作技术，具有返混小、空隙率高、压降低、柱效高、处理量大等优点，已经在生物大分子的分离过程中得到广泛的应用。膨胀床吸附的操作性能取决于能否形成低返混、高柱效的稳定床层，而稳定的床层是依靠具有一定的密度和粒径分布的介质来实现的。因此，膨胀床吸附技术也存在与其它分离技术相似的现象——在一定的条件下，分离效果与所使用介质的性质紧密相关。制备适合膨胀床分离的介质是膨胀床吸附技术发展和应用的关键因素之一。目前广泛使用的膨胀床分离介质Streamline(瑞典AmershamBiosciences公司，见)的粒径分布在50到400μm之间。由于粒径较大，介质内传质路径较长，造成介质孔内传质阻力大，膨胀床柱效受到限制。解决上述问题行之有效的方法之一就是降低介质内的传质距离，其主要途径有两种(1)以高密度材料作为基质合成小粒径介质，如全氟聚合物、氧化锆等；(2)合成核壳结构的介质，即在高密度的惰性核外包裹一层具有良好吸附性能的亲水性聚合物薄层，根据其结构上的特点，核壳型介质亦称为表面薄层介质。Flickinger等人公布了利用油相乳化方法制备小粒径氧化锆介质的专利，获得了粒径分布为50～200μm，密度为2.5～3.5g/ml的膨胀床吸附介质(USPatent6,036,861)。这种粒径较小的介质缩短了物质在介质内的扩散距离，加速介质中蛋白质的扩散和吸附过程，提高了膨胀床的柱效。但是使用粒径较小的介质时膨胀床操作流速较低，使膨胀床分离速度下降。另外，现有的技术条件使那些适合于膨胀床吸附的小粒径介质的制备比较困难，因此核壳型介质成为更具竞争力的膨胀床分离介质。Upfront公司于1999年公布了以不锈钢和钛为惰性核制备核壳型介质的专利(WO00/57982)。通过在不锈钢或钛表面包裹琼脂糖等亲水聚合物，获得了密度大于2.5g/ml，粒径分布在5-75μm之间的薄层介质。在修饰适当的离子交换或亲和配基后，该介质被用于流化床分离质粒DNA、RNA和蛋白质等过程中。2000年，Plsson等人在《JournalofChromatographyA》第878卷中报道了采用不锈钢为核心包裹琼脂糖制备适用于高流速膨胀床吸附过程介质的方法(E.Plsson，P.E.GustavssonandP.O.Larsson.Pellicularexpandedbedmatrixsuitableforhighflowrates，JournalofChromatographyA，2000，878，17-25)。根据所采用不锈钢颗粒粒径的差异，该介质的密度可达到3.3g/ml以上，粒径分布在32到165μm之间。佟晓冬等人研究了6％琼脂糖包裹不锈钢珠(Upfront公司产品)在膨胀床中的流体力学和床层的膨胀行为(X.D.Tong，Y.Sun.Particlesizeanddensitydistributionsoftwodensematricesinexpandedbedsystem.J.Chromatogr.A977(2002)173-183.报道)，研究表明由于琼脂糖包裹不锈钢珠密度大，相对终端流化速度高；该介质在床层内无粒径分布，只是通过一定的密度分布来实现床层的稳定。虽然该介质的壳核结构能在一定程度上提高传质，但无序的粒径分布会削弱传质效率。另一方面，人们对这类介质使用过程中可能存在的合金与金属泄漏问题的担忧也限制了它们在实际过程中的应用。
发明内容针对现有的膨胀床分离介质中存在的不足之处，本发明的目的在于提供一种高密度核材表面包裹琼脂糖凝胶薄壳分离介质的制备方法。以该方法制备的分离介质具有一定机械强度、密度与粒径可控的膨胀床分离介质。本发明是通过下述技术方案加以实现的。采用高密度核材，以琼脂糖为水相，以色拉油为油相，制备核壳型的分离介质的方法。该方法主要包括悬浮液的制备、乳化包裹反应，固化和交联过程，其特征在于，在85-90℃下，将粒径为30-400μm、密度为2.2-2.8g/ml的玻璃珠分散于浓度为2-8％、体积量为玻璃珠体积4～10倍的琼脂糖水溶液中，充分搅拌制成分散均匀的悬浮液，然后将该悬浮液加入体积量为水相体积4-10倍的色拉油中，并按10-50g/l加入乳化剂Span80，搅拌乳化包裹反应，迅速降温至10～30℃形成微球，再加入体积比为1-5％的环氧氯丙烷，并在0.3-0.7mol/l氢氧化钠条件下进行交联，之后在0.8-1.4mol/l氢氧化钠条件下用4-6g/l硼氢化钠还原，制成粒径为40～500μm、琼脂糖含量为20～70％的分离介质。上述的优化条件琼脂糖溶液的浓度为4～6％，水相中琼脂糖溶液与玻璃珠颗粒体积之比为5-6，色拉油体积为水相体积的6-7倍，乳化剂Span80的加入量为25-35g/l；采用环氧氯丙烷为交联剂，在0.4-0.7mol/lNaOH条件下，环氧氯丙烷的浓度为2-4％(体积百分比)，以硼氢化钠为还原剂，其用量在0.8-1.4mol/lNaOH条件下为4.5～5.5g/l。本发明制备的高密度薄层微球同现有的膨胀床分离介质相比，其明显的优点是，原料便宜，制备过程简便经济，对设备要求不高；惰性材料玻璃珠避免了金属泄漏的隐患；介质具有适宜的密度和粒径分布，适用于膨胀床；在床层中能同时呈现分离介质的密度和粒径的有序分布，有助于提高柱效，实现快速分离；外层琼脂糖凝胶上活性基团多，通过修饰不同配基，例如色素配基、离子交换配基等，可以满足多种分离要求，并且洗脱条件温和；生物相容性好，亲水性好，在酶的固定化、细胞分离、DNA检测、蛋白质的纯化等方面具有广泛的应用前景。下面对本发明进行详细说明。本发明的关键技术有七点一是玻璃珠颗粒的选择。密度为2.4-2.5g/ml，外观规整，惰性无毒的玻璃珠可以用来制备高密度薄层的微球。关键技术之二是玻璃珠粒径的选择。玻璃珠的粒径及其分布是决定微球粒径分布和密度的先决条件，为制备不同粒径的微球，本发明选择了两种不同粒径分布的玻璃珠颗粒，分别为36-143μm和77-307μm。关键技术之三是采用油水两相法制备高密度薄层微球。在油水两相中对玻璃珠颗粒进行包裹反应，获得的微球包裹完全、薄层分布均匀。关键技术之四是核壳型介质薄层厚度和介质密度的控制。在一定条件下，通过改变玻璃珠的加入量等方式可实现对薄层微球密度的调控。关键技术之五是在制备过程中搅拌速度的控制。在反应过程中要维持转速的稳定；同时，调控转速也是获得不同粒径和密度微球的方法之一。关键技术之六是玻璃珠和琼脂糖水溶液混合体的加入方式。本发明的加入方法是先把混合体快速搅拌，使玻璃珠很好地分散，然后快速倒入转速稳定的反应釜(油相)中，它对提高产率有一定的帮助。关键技术之七是采用的适宜的交联和还原步骤处理，既有利于提高高密度薄层微球的稳定性和机械强度；同时又不影响琼脂糖凝胶内部的网络结构。图1为光学显微镜下本发明琼脂糖包裹玻璃珠微球的照片，其中暗色实心部分为玻璃珠，透明部分为玻璃珠外包裹的琼脂糖层。图2描述了采用不同粒径玻璃珠制备的薄层微球在0.01mol/lTris-HCl缓冲液(pH7.6)中对溶菌酶的静态吸附等温线，其中(□)对应于实施例1中的微球的吸附等温线，(△)对应于实施例2中的微球的吸附等温线。图3描述了流动相为0.01mol/lTris-HCl缓冲液(pH7.6)条件下膨胀床中薄层微球对溶菌酶的动态吸附曲线。(○)对应于沉降床高度5.0cm，流速220cm/h、膨胀比1.9条件下，按照实施例1制备的微球的动态吸附量；(口)对应于沉降床高度5.0cm，流速226cm/h、膨胀比1.3条件下，按照实施例2制备的微球的动态吸附量。具体实施例方式下面的实例将对本发明提供的方法予以进一步的说明。实施例1在90℃下，通过快速搅拌将25g粒径为36-143μm的玻璃珠颗粒均匀地分散在50ml40g/l琼脂糖溶液中。然后将该混合物快速倒入含30g/lSpan80的300ml有机相中，保持包裹温度90℃，控制搅拌速度1200rpm；搅拌15min后，迅速降温至15℃，在维持搅拌速度不变的条件下，继续搅拌30min；向上述反应体系中加入两倍于其体积的水，通过自然沉降获得高密度薄层微球。收集到的微球先后用丙酮和蒸馏水反复洗涤，直至有机相洗净。取50ml洗净的微球(沉积重量约为50g)与50ml的1mol/lNaOH混合后，加入500mg硼氢化钠，使悬浮液中硼氢化钠的浓度为5g/l。上述混合物于25℃，170rpm条件下，在水浴摇床中反应30min；然后加入2ml的环氧氯丙烷，在上述条件下，继续反应5h。反应完毕，用蒸馏水反复洗涤到中性。向清洗后微球(50ml)中加入2mol/l等体积的NaOH溶液，重新制成悬浮液；然后加入500mg硼氢化钠，使溶液中硼氢化钠的浓度为5g/l。于45℃，170rpm下，在水浴摇床中反应6h。反应完毕，加入蒸馏水反复洗涤到中性，即得到高密度薄层微球。通过筛分得到粒径分布为43-308μm，密度1.77g/ml，琼脂糖含量45％(体积比)的薄层高密度微球。该微球修饰密度为7.6μmol/lCibacronBlue3GA亲和配基，在0.01mol/lTris-HCl缓冲液(pH7.6)中的静态吸附量为49.0mg溶菌酶/ml湿微球；在沉降床高度5.0cm，线性流速220cm/h，膨胀比1.9条件下，动态吸附量为35.4mg溶菌酶/ml湿微球(在10％穿透点下)。实施例2在90℃下，通过快速搅拌将25g粒径为77-307μm的玻璃珠颗粒均匀地分散在50ml40g/l琼脂糖溶液中。然后将该混合物快速倒入含有30g/lSpan80的300ml有机相中，保持包裹温度90℃，控制搅拌速度1100rpm；搅拌15min后，迅速降温至15℃，在维持搅拌速度不变的条件下，继续搅拌30min。向上述反应体系中加入两倍于其体积的水，通过自然沉降获得高密度薄层微球。收集到的微球先后用丙酮和蒸馏水反复洗涤，直至有机相洗净。然后，取50ml洗净的微球(沉积重量约为50g)与50ml1mol/lNaOH混合；加入500mg硼氢化钠，使其在溶液中的浓度达到5g/l；在25℃，170rpm下，于水浴摇床中反应30min；然后加入2ml的环氧氯丙烷，25℃，170rpm下，在水浴摇床中反应5h。反应完毕，加入蒸馏水反复洗涤到中性。将清洗后的微球(50ml)与2mol/l等体积的NaOH溶液混合，加入500mg硼氢化钠，使溶液中硼氢化钠浓度达到5g/l。在45℃，170rpm下，于水浴摇床中反应6h。反应结束后，用蒸馏水反复洗涤到中性，即得到高密度薄层微球。通过筛分得到粒径分布为82-412μm，密度1.98g/ml，琼脂糖含量30％(体积比)薄层高密度微球。该微球修饰密度为6.2μmol/lCibacronBlue3GA亲和配基，在0.01mol/lTris-HCl缓冲液(pH7.6)中的静态吸附量为45.0mg溶菌酶/ml湿微球；在沉降床高度5.0cm，线性流速226cm/hr，膨胀比1.3条件下，该微球的动态吸附量为15mg/ml湿微球(在10％穿透点下)。权利要求1.一种高密度核材表面包裹琼脂糖凝胶薄壳介质的制备方法，该方法主要包括悬浮液的制备、乳化包裹反应，固化和交联过程，其特征在于在85-90℃下，将粒径为30-400μm、宽度为2.2-2.8g/ml的玻璃珠分散于浓度为2-8％、体积量为玻璃珠体积4～10倍的琼脂糖水溶液中，充分搅拌制成分散均匀的悬浮液，然后将该悬浮液加入体积量为水相体积4-10倍的色拉油中，并按10-50g/l加入乳化剂Span80，搅拌乳化包裹反应，迅速降温至10～30℃形成微球，再加入体积比为1-5％的环氧氯丙烷，并在0.3-0.7mol/l氢氧化钠条件下进行交联，之后在0.8-1.4mol/l氢氧化钠条件下用4-6g/l硼氢化钠还原，制成粒径为40～500μm、琼脂糖含量为20～70％的分离介质。2.根据权利要求1所述的高密度核材表面包裹琼脂糖凝胶薄壳介质的制备方法，其特征在于琼脂糖溶液的浓度为4～6％，水相中琼脂糖溶液与玻璃珠颗粒体积之比为5-6，色拉油体积为水相体积的6-7倍，乳化剂Span80的加入量为25-35g/l；采用环氧氯丙烷为交联剂，在0.4-0.7mol/lNaOH条件下，环氧氯丙烷的浓度为2-4％(体积百分比)，以硼氢化钠为还原剂，其用量在0.8-1.4mol/lNaOH条件下为4.5～5.5g/1。全文摘要本发明公开了一种油水两相法制备高密度核材表面包裹琼脂糖凝胶薄壳介质的方法，属于惰性颗粒负载于凝胶载体中的微球制备技术。该方法主要包括悬浮液的制备、乳化包裹反应，固化和交联过程，其特征在于，将玻璃珠分散于琼脂糖水溶液中，制成悬浮液；然后将该悬浮液加入色拉油中，并加入乳化剂Span80，搅拌乳化包裹反应，迅速降温形成微球，再加入环氧氯丙烷，并在碱性条件下进行交联，之后用硼氢化钠还原，制成粒径为40～500μm、琼脂糖含量为20～70％的分离介质。该介质在膨胀床中同时呈现密度和粒径分布，并具有较高的密度、柱效和吸附容量。因此，在膨胀床吸附过程中具有广阔的应用前景。文档编号B01J20/28GK1457919SQ0312975公开日2003年11月26日申请日期2003年5月16日优先权日2003年5月16日发明者孙彦,周鑫,史清洪,白姝,董晓燕申请人:天津大学