专利名称:液晶凝胶及其制造方法
技术领域:
本发明涉及具有主要含有以脱氧核糖核酸(DNA)为代表的核酸的水不溶液晶结构的凝胶(以下,称为“液晶凝胶”)和通过渗析制造这样一种凝胶的方法。更具体而言,本发明涉及具有吸附内分泌干扰剂(endocrine disruptors)、致癌物质等能力的凝胶和制造这样一种凝胶的方法。
背景技术:
众所周知,DNA具有双螺旋结构。将水溶液中的DNA分类为具有约500的持久长度并且每大约1.5具有一个负电荷的棒状聚合物。DNA的核碱基(nucleobase)对的层具有对芳族化合物的选择吸附性也是已知的。
通常,已经公开了在载体上固定水溶性DNA的水不溶交联聚合物的方法,其通过以250至270nm波长的紫外线照射水溶性DNA(例如,由鲑鱼精巢(salmon testes)获得的DNA)的水溶液或其在载体上的液膜,或者通过冷凝或干燥载体上水溶性DNA薄层或水溶性DNA溶液的液膜而获得的薄膜来实现(例如,见专利文献号1)。根据所述方法,紫外线的照射在由鲑鱼精巢获得的DNA中引起交联反应以使所述DNA成为水不溶的,并且这个不可溶性的工艺可以使所述DNA吸附由芳族化合物组成的内分泌干扰剂。
专利文献号1未审查的日本申请号2001-810098A(权利要求,段落号0019和0022)发明内容本发明要解决的问题 然而,不幸地,在专利文献号1中描述的方法已经不适于大规模生产,因为它要求在DNA上长时间的紫外线照射以引发DNA的交联反应。而且,这方法不生产本发明的液晶凝胶状的其中DNA分子本身同时具有胶凝性能和液晶性能的那种。
本发明的第一目的是提供主要包含同时具有胶凝性能和液晶性能的核酸的水不溶的结晶凝胶,并且提供制造这样一种结晶凝胶的方法。
本发明的第二目的是提供包含具有芳族化合物吸附性和光学性质的核酸的结晶凝胶并且提供制造这样一种结晶凝胶的方法。
本发明的第三目的是提供大量生产时廉价地制造包含核酸的液晶凝胶的方法。
解决问题的方法 在本申请的权利要求1中的本发明所要求的是具有柱、筒、锥体、棒、纤维、球、板或膜形状的晶体结构的凝胶,它由核酸,核酸和棒状聚合物,核酸和半-柔性的聚合物,或核酸、棒-状聚合物和半-柔性的聚合物的组合制成。
在这里使用的术语“液晶凝胶”指其中核酸不仅以液晶状态而且以凝胶状态附聚。
在本申请的权利要求13中本发明所要求的是用于制造凝胶的方法,所述方法包含下列步骤通过将核酸溶解在水、缓冲液、含盐的水溶液、极性溶剂的水溶液、或其混合物中制备核酸溶解液;和在含具有化合价为2或更多的多价的金属阳离子的水溶液中渗析所述核酸溶解液,因此获得具有主要含有所述核酸的液晶结构的凝胶。
本发明的效果 如权利要求1中所要求的主要含有核酸的液晶凝胶是以柱、筒、锥体(cone)、棒、纤维、球、板、或膜的形状形成的并且当在垂直于纵向的横截面、径向横截面或所述板表面或膜表面上进行观察时从其中心是放射状取向。因此,第一,当所述液晶凝胶接触到芳族化合物时这个取向引起所述芳族化合物的各向异性扩散,并且然后将所述芳族化合物嵌入(插入)到凝胶中,由此形成其上吸附芳族化合物的嵌入化合物。第二,所述液晶凝胶具有液晶结构和特定的光学性质,以致可以光学检测芳族化合物的吸附的存在或不存在。第三,当所述液晶凝胶与内分泌干扰剂接触时,以类似于上述芳族化合物的方式将内分泌干扰剂嵌入到所述凝胶。第四,当所述液晶与致癌物质接触时,以类似于所述芳族化合物的方式将致癌物质嵌入到所述凝胶,从而被吸附。第五,当所述液体凝胶与重金属离子接触时,在重金属离子和DNA之间发生络合物-形成反应,从而吸附所述重金属离子。第六,将应力施加在所述液晶凝胶上时,所述凝胶延长并改变它的取向度。而且,第七,它可以在人体环境中的酸性条件下分解,因为所述液晶凝胶含有酯键。第八,它可以在所述环境中由微生物分解,因为所述液晶凝胶是可生物降解的。
在本申请的权利要求13中所要求的方法中,核酸溶解液是通过将核酸溶解在水、缓冲液、含盐的水溶液、极性溶剂的水溶液、或其混合物中制备的;并且然后在含具有化合价为2或更多的多价的金属阳离子的水溶液中渗析所述核酸溶解液以获得柱、筒、锥体、棒、纤维、球、板、或膜形状的液晶凝胶。这种液晶凝胶在水中是不可溶的并且其特征在于核酸本身同时具有胶凝性质和液体结晶性质。
在生产中,可以通过改变缓冲液等的浓度、水溶性核酸的浓度、和具有2或更多化合价的多价金属阳离子的浓度控制吸附在所述液晶凝胶中的芳族化合物的量和所述液晶凝胶的光学性质。而且,可以通过简单操作获得水-不溶的液晶凝胶,在所述简单操作中,在含有化合价为2或更多的多价金属阳离子的水溶液中渗析核酸溶解液。这个程序具有适于大量生产的特征。
附图简述
图1是显示根据本发明实施方案的圆柱状液晶凝胶分子结构的示意性横断面视图。
图2是通过在交叉棱镜下观察图1的液晶凝胶获得的视图。
图3是通过在交叉棱镜下观察图1的八个液晶凝胶获得的视图。
图4是显示具有同心多层结构的球形液晶凝胶的照片。
图5是显示实施例9中形成的纤维状液晶凝胶的照片。
实施本发明的最佳方式 以下,将描述本发明的最佳方式。
本发明的液晶凝胶的主要成分是核酸。所述核酸可以是DNA或DNA和RNA的混合物。为了增加取向度,本发明的DNA或RNA的分子量优选在500,000至10,000,000的范围内。如果所述分子量小于500,000,则不发生取向。如果所述分子量高于10,000,000,则发生粘度增加,导致处理中的困难并且所述取向度不合需要地保持恒定。如果所述分子量在上述范围之内,则所述取向度随着分子量增加而增加。另一方面,如果所述分子量增加超过所述上限,则液晶凝胶变得太硬以致难以加工它。因此,具有适当的加工性能和高取向度的液晶凝胶可以通过将具有较大分子量的核酸与具有较小分子量的核酸混合而制备。本发明的DNA和RNA是水溶性的。所述DNA是单链或双链的DNA并且例举为从鱼的精巢、鸟或哺乳动物的胸腺获得的DNA。特别地,依据品质和成本,从鲑鱼精巢获得的DNA作为来自鱼的精巢的一种或从大肠杆菌获得的DNA是优选的用于DNA液晶凝胶的材料。而且用于DNA液晶凝胶的优选材料是来自哺乳动物和鸟类胸腺的从小鸡、母牛(caw)、和猪的胸腺获得的DNA的任何一种,或任何一种合成的寡核苷酸和多核苷酸。所述RNA也举例为从酵母获得的一种。
而且,所述液晶凝胶可以是核酸和棒状聚合物的组合,核酸和半-柔性的聚合物的组合,或核酸、棒状聚合物和半-柔性的聚合物的组合。任何这些组合中所述组分关于100重量%核酸的重量比是0.1至400重量%的棒状聚合物和0.1至150重量%的半-柔性的聚合物。所述液晶凝胶是以柱、筒、锥体、棒、纤维、球、板、或膜的形状。液晶凝胶是配置在二维或三维结构中。
如果所述液晶凝胶是以柱、筒、锥体、棒或纤维的形状形成的,则在垂直于纵向的横截面上进行观察时,所述液晶凝胶主要含有从其中心放射状取向的核酸。当在垂直于纵向的横截面上进行观察时,所述液体凝胶包括具有同心多层结构的凝胶。
而且,如果它是以球的形状形成的,则当在其径向横截面上进行观察时,所述液晶凝胶主要含有从其中心放射状取向的核酸。当在其径向横截面上进行观察时,这样一种液晶凝胶包括具有同心多层结构的凝胶。
而且,如果它是以板或膜形状形成的,则当在其板表面或膜表面上进行观察时,所述液晶凝胶主要含有从其中心放射状取向的核酸。当在其板平面或膜表面上进行观察时,这样一种液晶凝胶包括具有同心多层结构的凝胶。
包含在所述凝胶中的棒状聚合物或半-柔性的聚合物可以是多糖、多糖衍生物、或其组合。多糖的实例包括由微生物产生的发酵的多糖(凝胶多糖)和再生的凝胶多糖(裸藻淀粉(paramylum)),和由裂褶菌产生的西佐喃。多糖衍生物的实例包括纤维素衍生物,例如甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、和羧甲基纤维素。
所述凝胶中另一种棒状聚合物或半-柔性的聚合物可以是蛋白质、变性蛋白、聚氨基酸、或其组合。蛋白质的实例包括胶原和肌球蛋白,变性蛋白的实例包括明胶和变性的白蛋白,和聚氨基酸的实例包括聚谷氨酸和聚赖氨酸。
而且,在所述凝胶中另一种棒状聚合物或半-柔性的聚合物可以是合成聚合物。合成聚合物的实例包括聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚乙烯醇、聚乙烯甲醚、聚乙烯基吡咯烷酮、聚丙烯酸、和聚苯乙烯磺酸盐或酯。
例如,当DNA与聚丙烯酸的合成聚合物或凝胶多糖的多糖混合时,液晶度和致癌物质吸附能力减小。相反,在活体中不能分解的聚丙烯酸或凝胶多糖在那里吸附致癌物质以致它们可以用作从活体例如从肛门排出的凝胶珠,或者可以控制在活体和环境中的可生物降解性。为了从DNA和聚丙烯酸(PAA)的混合物形成液晶凝胶,用于在水溶液中混合DNA与聚丙烯酸的重量比(DNA/PAA)在1/4至1/0.001的范围内。为了形成具有高度取向液晶结构的凝胶,所述重量比(DNA/PAA)优选在1/1至1/0.001的范围内。为了从DNA和聚乙烯醇(PVA)的混合物形成液晶凝胶,用于在水溶液中混合DNA与聚丙烯酸的重量比(DNA/PVA)在2/3至1/0.001的范围内。为了形成具有高度取向液晶结构的凝胶,所述重量比(DNA/PVA)优选在3/2至1/0.001的范围内。
基本上,可以通过将核酸溶解在水、缓冲液、含有盐的水溶液、极性溶剂水溶液、或其混合物中制备核酸溶解液;在含有具有化合价为2或更多的多价金属阳离子的水溶液中渗析所述核酸溶解液而获得主要含有核酸的任何液晶凝胶。
所述核酸溶解液可以含有上述棒状聚合物或者上述半-柔性的聚合物或者可以除所述核酸之外还含有它们二者。关于溶解在核酸溶解液中的棒状或半柔性的聚合物的量,相对于100重量%的核酸,溶解的棒状聚合物在0.1至400重量%的范围内和溶解的半柔性聚合物在0.1至150重量%的范围内。通过除所述核酸之外还含有棒状聚合物和半-柔性的聚合物,可以预期酶稳定性和酸-碱稳定性的效果。
溶解核酸的溶液优选是缓冲液,因为可以调节其pH。例如,在含有三价阳离子例如铝的水溶液中浸没或渗析的情况下,可以使用具有广泛pH值的任何水溶液包括水。在含有二阶阳离子例如钴盐的水溶液中浸没或渗析的情况下,当使用具有碱性pH的溶解液时仅产生液晶凝胶。
所述缓冲液的实例包括氯化钾-盐酸缓冲液、对-甲苯磺酸-对-钠缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液、邻苯二甲酸钾-盐酸缓冲液、柠檬酸-磷酸钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、α,β,β′-二甲基戊二酸-氢氧化钠缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、琥珀酸-氢氧化钠缓冲液、邻苯二甲酸钾-氢氧化钠缓冲液、二甲胂酸钠-盐酸缓冲液、马来酸钠-氢氧化钠缓冲液、磷酸盐缓冲液·咪唑-盐酸缓冲液、2∶4∶6-三甲吡啶-盐酸缓冲液、三乙醇胺、盐酸-氢氧化钠缓冲液、佛罗那(5∶5-二乙基巴比妥酸钠)-盐酸、N-乙基吗啡-盐酸缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酰甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、2-氨基-2-甲基1∶3-丙二醇-盐酸缓冲液、二乙醇胺-盐酸缓冲液、硼酸缓冲液、硼酸钠-盐酸缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、碳酸钠-酸式碳酸钠缓冲液、硼酸钠-氢氧化钠缓冲液、碳酸钠-氢氧化钠缓冲液、酸式碳酸钠-氢氧化钠缓冲液、磷酸二氢钠-氢氧化钠缓冲液、氯化钾-氢氧化钠缓冲液、Britton Robinson缓冲液、GTA缓冲液、和HEPES缓冲液。
含有盐的水溶液的实例包括pH2至10的氯化钠水溶液、氯化钾水溶液、和氯化锂溶液。而且,所述极性溶剂水溶液的实例包括甲醇水溶液、乙醇水溶液、丙酮水溶液、甲酸水溶液、和乙酸水溶液。
(a)用于制造第一液晶凝胶的方法(用于制造筒状或柱状液晶凝胶的方法)在下列典型实例中,使用的核酸是水溶性的DNA并且使用的含盐水溶液是硼酸盐水溶液。
首先,将水溶性DNA溶解在硼酸盐水溶液中以制备核酸溶解液。在这里要使用的硼酸盐水溶液优选是四硼酸钠或氢化硼钠的水溶液,因为将所述溶液维持在pH值大约在pH9至10的范围内。所述硼酸盐水溶液发挥缓冲作用以维持pH值大约为9,以致所述水溶性DNA可以顺利地溶解在其中。为了制造本发明的液晶凝胶,加入到硼酸盐水溶液中的水溶性DNA的量在0.1至2重量%的范围内,优选在1至1.5重量%的范围内。如果加入的DNA的量小于所述下限,则不形成液晶凝胶。如果它超过所述上限,则由于粘度的增加而难以获得均匀溶液。而且,因为硼酸盐的含量应该与DNA的浓度相当,所以将硼酸盐的浓度选择在0.1M至饱和浓度的范围内,优选从0.02至0.04M。如果它小于0.01M,则pH-缓冲作用是不充分的。为了提高所述水溶液的离子强度和DNA的溶解度,优选再将碱金属盐加入到所述硼酸盐水溶液。所述碱金属盐举例为氯化钠、氯化锂、或氯化钾。所述碱金属盐的充分浓度是0.01M。
随后,将由此获得的核酸溶解液填充在渗析-膜筒中。在填充前,将所述筒的底端密封。渗析膜的实例包括,但不具体限于,醋酸纤维素和聚甲基丙烯酸甲酯。在它们之中,优选纤维素基的渗析膜。这里,要获得的胶凝作用的速率、和凝胶的液晶度和层状结构取决于所述渗析筒的膜厚度和直径而改变。最终获得的圆柱状液晶凝胶的外径取决于所述筒的直径。可以取决于所述液晶凝胶的应用确定所述筒的直径和长度。例如,获得一种圆柱状液晶凝胶,其中筒的直径在6mm至10cm外径和0mm至4cm内径范围内选择(1mm至10cm厚)。在填充核酸溶解液以后,将所述筒的上端密封,在筒内产生与外界隔绝密封的核酸溶解液。应当注意,可以主要通过利用贴在适当框架上的渗析膜代替渗析筒制备尽可能大的液晶凝胶。
接着,将筒内的填充和密封的核酸溶解液浸没在含有化合价为2或更多的金属阳离子的水溶液中,优选二价或三价金属阳离子。使用含有化合价为2或更多的多价金属阳离子的凝结溶液,因为在这样一种金属阳离子存在下核酸溶解液胶凝,并且在这个过程中引起结晶。根据与DNA的相互作用,在这里要使用的适合的二价金属阳离子是任何二价过渡金属阳离子,例如钴、镍、铁、和锰。根据获得具有更高透明度的液晶凝胶,适合的三价金属阳离子是三价的铝阳离子和镧系镝阳离子。这样一种化合物例举为容许上述金属离子从那里在水溶液中离解的盐并且其实例包括氯化钴、硫酸钴、氯化镍、硫酸镍、氯化铁、硫酸亚铁、氯化锰、硫酸锰、氯化铝、硫酸铝、和氯化镝。
含金属阳离子水溶液的浓度优选在0.1M至饱和浓度的范围内,更优选从0.1至0.2M。如果它小于所述下限,则没有凝胶可以形成。如果它超过所述上限,则不希望的结果例如由于凝胶的显著收缩发生扭曲的液晶。而且,所述水溶液的温度优选在0至40℃的范围内,更优选从30至40℃。如果所述温度小于所述下限,则所述溶液的扩散速率更低,导致不希望的凝固。如果它超过所述上限,则可能不发生液晶凝胶的形成或可能发生不希望的结果例如一度形成的液晶胶状构造的损坏。当所述渗析膜筒浸没在含化合价为2或更多的多价金属阳离子的水溶液中时,在所述渗析膜筒中的DNA的硼酸分散出所述筒,同时在外面的离解的化合价为2或更多的多价金属阳离子分散到所述筒内。
上述渗析在所述筒中形成圆柱体。形成的圆柱体具有与所述筒直径相当的直径。通常,所述圆柱体的中心被溶胶并且通过缩短渗析的持续时间、降低核酸的浓度、或者降低含有化合价为2或更多的多价金属阳离子的水溶液的浓度而在液晶凝胶中形成其圆周。相反,可以通过延长渗析的持续时间、增加核酸的浓度、或者增加含有化合价为2或更多的多价金属阳离子的水溶液的浓度形成实心圆柱状液晶凝胶。即,当所述圆柱体的中心是溶胶时,将它从所述筒取出然后用水漂洗以除去溶胶部分,从而获得筒状的液晶凝胶。另外,当圆柱体的全部部分被胶凝时,将圆柱体从所述筒取出然后用水漂洗,从而获得实心柱状的液晶凝胶。例如,在1重量份DNA、0.02M硼酸和0.1M氯化钴条件下,在渗析时间从0至30分钟的范围内形成筒状的液晶凝胶并且在从60分钟或更多的范围内渗析时间形成柱状的液晶凝胶。
当垂直于纵向切割筒状液晶凝胶并且在自然光下观察所述切削面时,它是同心的并且从所述中心放射取向,像图1的示意图中所示的松果果实(pine apple fruit)的横截面。相反,当在交叉棱镜下观察它时,如图2和3所示,出现交叉线,表明在所述凝胶中液晶结构的存在。所述交叉线表明DNA分子或DNA分子的团块从其中心规则取向。即使在现阶段还没有揭示获得这样一种结构的机理,认为这样结构的形成是由通过溶剂的替换引起DNA结构的改变和后来的金属阳离子/DNA络合物的形成引起的。
另外,进行下列程序以将所述筒状或柱状液晶凝胶制成当在其垂直于纵向的横截面上观察时显示同心多层结构的一种。首先,通过将所述筒放在硼酸盐水溶液中或在含有硼酸盐中的碱金属盐的水溶液中在筒中形成圆柱体。接着,将所述筒从所述水溶液取出到空气中并且保持放置5至30分钟。随后,然后将所述筒浸没在上述水溶液中以渗析所述核酸溶解液。从所述水溶液取出所述筒并将所述筒浸没在所述水溶液中的重复操作防止通过阳离子流入的结构形成以在筒中形成当在垂直于纵向的横截面上进行观察时具有同心多层结构筒状或柱状凝胶。
(b)用于制造第二液晶凝胶的方法(用于制造球形液晶凝胶的方法)在下列典型实例中,以类似于第一制造方法的方式,使用的核酸是水溶性DNA并且使用的含盐水溶液是硼酸盐水溶液。
首先,分别制备核酸溶解液和含有化合价为2或更多,优选二价或三价金属阳离子的金属阳离子水溶液。用于制备所述核酸溶解液的硼酸盐水溶液的浓度和DNA的含量与第一制造方法中采用的那些不同,因为需要在这样一种渗析膜形成期间通过界面张力提供具有足以维持其球形的粘度的核酸溶解液用于允许渗析膜的自形成。也就是说,硼酸盐水溶液的浓度在0.05M至饱和浓度的范围内,优选从0.01至0.08M。含化合价为2或更多的多价金属阳离子的盐水溶液的浓度应该是0.02M或更多,因为交联应该立即形成以允许渗析膜的自形成。也就是说水溶液中化合价为2或更多的多价金属阳离子的浓度在0.02M至饱和浓度的范围内,优选从0.1至2M。所述硼酸盐水溶液的温度和含有金属阳离子盐的水溶液的温度与第一个制造方法中采用的那些相同。
在第二制造方法中,将注射器、喷嘴、喷雾器、或微量吸移管用于取代所述渗析-膜筒。最终要获得的球形液晶凝胶的外径取决于注射器等的泄流口的孔径。注射器等的排放孔的孔径基于液晶凝胶的应用所限定。例如,排放孔的孔径可以在1μm至1mm的范围中选择。这样一种注射器等容许获得外径为100μm至4mm的球形液体凝胶。在将所述核酸溶解液填充入所述注射器等以后,将排放孔向下转动并且然后将注射器等固定在含有化合价为2或更多的多价金属阳离子的水溶液液面上方1至15cm的预定位置。
随后,通过在注射器等的内部施加压力,将填充在注射器等中的核酸溶解液滴到含有化合价为2或更多的多价金属阳离子的水溶液中。虽然以液滴形状的核酸溶解液移动到所述水溶液中,但是在液滴的整个圆周上形成渗析膜。由通过所述金属阳离子诱导的DNA凝胶组成渗析膜。通过维持这样一种状态,透析液滴形状的核酸溶解液并且然后在所述渗析膜的内部中形成球形液晶凝胶。因此,形成具有与注射器等的排放孔的孔径相当外径的球形液晶凝胶。
当将所述球形液晶凝胶以直径方向切割以获得半球并且然后观察其横截面时,所述球形液晶凝胶具有外壳并且是同心的并从所述中心放射状取向(未图解)。在所述液晶凝胶内部中心中,存在未成胶的溶胶部分。形成这样一种结构的机理与所述筒状液晶凝胶相同。
而且,为了获得当在球形液晶凝胶的径向横截面上进行观察时的同心多层结构,进行下列程序。首先,在硼酸盐水溶液中或在含有硼酸盐中碱金属盐的水溶液中的液滴整个圆周上形成渗析膜。接着,将在其整个圆周上形成渗析膜的球形凝胶从所述水溶液取出到空气中然后保持放置5至30分钟。随后,将所述球形凝胶浸没在上述水溶液中并且然后将所述核酸溶解液渗析。从所述水溶液取出球形凝胶并将所述球形凝胶浸没在所述水溶液中的重复操作防止通过阳离子流入的结构形成。结果,可以在渗析膜中形成在径向横截面上进行观察时的具有同心多层结构球形液晶凝胶。图4显示具有同心多层结构的球形液晶凝胶。当将药物放在凝胶中或放在其内部的溶胶层中并且然后将所述凝胶放入活体中时,所述药物可以在活体中逐渐释放。换言之,当所述凝胶中或所述凝胶溶胶层的外层中的药物在身体内释放时,由紧接于所述外层的内层围绕的药物移动至外层,然后从外层释放到身体内。随着所述药物从内层移动至外层,进入体内的药物可以是逐渐释放的。
(c)用于制造第三液晶凝胶的方法(用于制造棒状或纤维状液晶凝胶的方法)首先,将水溶性DNA溶解在水中以制备核酸溶解液。将所述核酸溶解液从注射器或喷嘴挤压到含有化合价为2或更多的金属阳离子优选二价或三价金属阳离子的水溶液中以在渗析所述核酸溶解液期间在水溶液中的棒状或纤维体的整个圆周上形成渗析膜。结果,在所述渗析膜中形成具有棒状或纤维状液晶结构的凝胶,当在其垂直于纵向的横截面上进行观察时,所述凝胶是同心的并且是从中心放射状取向的。将所述凝胶从所述水溶液取出到空气中然后用水漂洗以获得实心或空心棒状或纤维状凝胶。可以通过同时控制挤出速率和核酸溶解液的粘度来调节所述纤维的长度和厚度。
而且,为了获得在垂直于纵向的所述棒状或纤维状液晶凝胶的横截面上进行观察时的同心多层结构,进行下列程序。首先,在硼酸盐水溶液中或在含有硼酸盐中的碱金属盐的水溶液中在棒状或纤维状体的整个圆周上形成渗析膜。接着,从所述水溶液取出具有已经在整个圆周上形成渗析膜的棒状或纤维状凝胶,然后保持放置5至30分钟。随后,将所述棒状或纤维状凝胶浸没在上述水溶液中以渗析所述核酸溶解液。从所述水溶液取出棒状或纤维状凝胶并将所述棒状或纤维状凝胶浸没在所述水溶液中的重复操作防止通过阳离子流入的结构形成。结果,可以在渗析膜的内部中形成在垂直于纵向的横截面上进行观察时的具有同心多层结构的棒状或纤维状凝胶。
(d)用于制造第四液晶凝胶的方法(用于制造板-形状的或者膜-形状的液晶凝胶)在下列典型实例中,以类似于第一制造方法的方式,使用的核酸是水溶性DNA并且使用的含盐水溶液是硼酸盐水溶液。
首先,制备了与上述第二制造方法相同的核酸溶解液和含有化合价为2或更多的金属阳离子,优选二价或者三价金属阳离子的水溶液。将所述核酸溶解液滴到第一个板上,然后将另一个等于或者小于第一个板的第二板放在第一个板上以使滴到其上的核酸溶解液变平。不特别限制第一个板只要它是由具有光滑表面并允许在其上形成的膜容易剥落的材料制成的。第一个板的实例包括玻璃基底、塑料基底和陶瓷基底。不特别限定第二个板只要它是用于形成均匀厚度的核酸溶解液(液膜)的光滑板并且由以致容易从膜剥落的材料制成。第二个板优选是圆盘-形状的盖玻片、丙烯酰基板、或者聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)膜。第二个板的尺寸可以在0.12至17mm厚和15至22mm直径的范围内选择。另外,当丙烯酰基板等用作所述板代替商业生产的盖玻片时,所述板的尺寸可以是任意确定的。
变平的核酸溶解液的厚度,即,液膜的厚度,优选在0.5至2mm的范围内。如果它小于所述下限,难以制造凝胶。如果它超过所述上限,即使所述核酸溶解液的粘度增加也难以制造凝胶。第二,将处于夹在第一和第二板之间状态的变平的核酸溶解液浸没在含有化合价为2或更多的多价金属阳离子的水溶液中。即使将它浸没在所述水溶液中,因为与所述核酸溶解液的相互作用,第二板也不从所述液膜剥落。在这水溶液中,在不用第一和第二板的所述变平核酸溶解液(液膜)覆盖的情况下在一部分(液膜上的侧面圆周)上形成渗析膜。所述渗析膜是用由金属阳离子诱导的DNA凝胶制成的。通过维持这样一种状态,将构成所述液膜的核酸溶解液透析,导致在所述渗析膜内部形成板-形状或者膜-形状的液晶凝胶。所述板-形状或者膜-形状的液晶凝胶的厚度与所述液膜的厚度成比例并且在0.5至2mm的范围内。其尺寸与第二板的尺寸成比例并且以直径在15至22mm的圆盘形状。当所述板的尺寸是任意限定的,可以生产具有任何尺寸的液晶凝胶。
「0028]在板-形状或者膜-形状的液晶凝胶的表面上进行观察时,但是未显示在图中,所述板-形状或者膜形状液晶的凝胶是同心的并且从所述中心是放射状取向的(未图解)。在所述液晶凝胶内部中心中,存在未成胶的溶胶部分。形成这样一种结构的机理与所述筒状液晶凝胶的机理相同。将第二板从板-形状或者膜-形状的液晶凝胶剥落然后用水漂洗后者以获得除去中心部分的板-形状或者膜-形状的液晶凝胶。
而且,为了获得在板表面或者膜表面上进行观察时的同心多层结构,进行下列程序。首先,在不用硼酸盐水溶液或者含有硼酸盐中碱金属盐的水溶液中的第一和第二板覆盖的情况下,在一部分(液膜上的侧面圆周)上形成渗析膜。第二,将第一和第二板从所述水溶液取出到空气中然后将其保持放置5至30分钟。随后,将第一和第二板浸没在上述水溶液中以渗析所述核酸溶解液。从所述水溶液取出第一和第二板并且将第一和第二板浸没在所述水溶液中的重复操作防止通过阳离子流入的结构形成。结果,具有当在所述板-形状或膜-形状表面进行观察时的同心多层结构的板-形状或膜-形状的液晶凝胶可以形成在渗析膜的内部中。
实施例 以下,将和其比较例一起描述本发明的实施例。
实施例1通过在50℃将从鲑鱼精巢获得的1重量%的DNA粉末溶解在缓冲液中制备含有DNA的核酸溶解液,所述DNA粉末是水溶性DNA的一种,所述缓冲液是将40mM的四硼酸钠和20mM的氯化钠盐溶解在水中。将所述核酸溶解液分别注入到直径为6、16、20、和25mM的四个不同的纤维素渗析筒的每一个中并且然后将所述筒密封,接着在室温下浸没在100mM氯化钴水溶液中以进行渗析。在24-小时渗析以后,四个具有高凝胶强度的不同直径的圆柱状凝胶形成在每一个所述筒中。与各自的渗析筒的直径相比较,已经将全部圆柱状凝胶在直径上几乎收缩14至15%。当从各自筒取出这些凝胶并观察时,其中心部分是溶胶。当用水漂洗所述圆柱状凝胶时,将它们的各自溶胶部分容易地除去,从而获得由DNA构成的筒状液晶凝胶,具有四种不同尺寸为外径5.1mm和内径2.1mm;外径13.0mm和内径6.4mm;外径16.6mm和内径7.4mm;以及外径20.7mm和内径9.5mm。当在垂直于纵向的方向上将这些凝胶切成圆片然后在交叉棱镜下通过偏振透镜观察时,证实在所述纵向上分子是取向的液晶结构的存在。发现在不依赖渗析筒尺寸的情况下可以制备由这样一种DNA液晶凝胶构成的凝胶筒。
比较例1在与实施例1的那些相同条件下尝试了圆柱状凝胶的形成,不同之处在于将DNA的浓度改变到0.1重量%。然而,筒中的溶胶保持不变以致不能形成由DNA构成的任何液晶凝胶。
实施例2通过在50℃将从鲑鱼精巢获得的1.5重量%的DNA粉末溶解在缓冲液中制备含有DNA的核酸溶解液,所述DNA粉末是水溶性DNA的一种,所述缓冲液是将40mM的四硼酸钠和20mM的氯化钠盐溶解在水中。将所述核酸溶解液填充在具有黄色尖端(排放孔的孔径为0.5mm)的微量吸移筒中然后在25℃以表1列出的10种不同浓度(1mM至1M)的任何一种从所述溶液的液面上5cm的位置滴到氯化铝水溶液中,然后将所述液滴浸没在那里5分钟。在全部水溶液中,除铝离子浓度为0.001M的一种之外,以上核酸溶解液的圆周立即凝胶。所述凝胶部分充当渗析膜并且形成直径在约5至8mm范围内的球形凝胶。关于实施例2中获得的凝胶,检定了液晶形成的存在或不存在。所述结果表示在表1中。
比较例2在与实施例2的那些相同条件下尝试了球形凝胶的形成,不同之处在于将DNA的浓度改变到0.08重量%。然而,不管氯化铝离子的浓度,溶胶保持不变并且无胶凝作用发生。
表1
如从表1是显然的,在比较例2中,不发生胶凝作用也不结晶。在实施例2中,除铝浓度为0.001M的一种之外全部样品凝胶。在所述凝胶产物之中,当在交叉棱镜条件下利用偏转板观察通过滴到浓度为10mM或更大的氯化铝水溶液中制备的球形凝胶时,证实它们的每一个具有液晶结构。而且,作为相对比较各自的凝胶产物的体积收缩率的结果,发现铝离子的浓度增加地越高,所述体积收缩率越高。
实施例3在50℃通过将四硼酸钠和氯化钠溶解在水中制备五种不同的缓冲液,其中四硼酸钠盐的浓度是10mM、20mM、40mM、60mM、和80mM并且氯化钠的浓度是20mM。在这些缓冲液的每一个中,溶解1.0重量%的由鲑鱼精巢获得的DNA粉末,它是水溶性DNA的一种,由此制备含有DNA的五种不同的核酸溶解液。提供三十种玻璃基底并且然后排列成六个玻璃基底的组。将每一种核酸溶解液滴到所述六组之一中的每六个玻璃基底的上表面上并且然后用0.12至0.17mm厚和15至22mm直径的圆盘-形状的盖玻片覆盖所述液滴。结果,在玻璃基底和盖玻片之间形成厚度为大约1mm的液膜。
另一方面,提供氯化钴盐浓度为50mM、100mM、200mM、400mM、600mM、和800mM的六种不同的氯化钴水溶液作为凝固溶液。将每一个组中的六个玻璃基底各自浸没在所述六种不同的氯化钴水溶液中。
因而,进行了30种不同类型的浸没。在全部液膜侧面的每一种中,通过DNA水溶液(核酸溶解液)与钴离子的反应形成膜。所述膜充当渗析膜并且随后的经过所述渗析膜的钴离子分散体在所述玻璃基底和所述盖玻片之间允许水-不溶性膜的形成。当除去所述盖玻片时,在所述玻璃基底上获得厚度为0.12至0.17mm和直径为15至22mm范围内的圆盘-形状的膜。当在交叉棱镜条件下利用偏转板观察全部30种不同的膜时,证实全部膜具有液晶结构。
比较例3以类似于实施例3的方式进行渗析,不同之处在于减少液滴的尺寸并且液膜的厚度约为1μm。然而,在玻璃基底和盖玻片之间不发生胶凝作用并且溶胶保持不变。
比较例4相对于100重量%的将40mM的四硼酸钠和20mM的氯化钠溶解在水中的缓冲液(50℃),通过溶解0.1重量%的作为一种水溶性DNA的从鲑鱼精巢获得的DNA粉末制备含有DNA的核酸溶解液。将所述核酸溶解液以类似于实施例3的方式滴到玻璃基底上并且然后用与实施例3相同的盖玻片覆盖所述液滴。在这状态中,将它浸没在氯化钴水溶液(100mM)中而在室温下进行渗析。然而,在所述玻璃基底和所述盖玻片之间不发生胶凝作用并且溶胶保持不变。
实施例4将实施例2中获得的球形液晶凝胶浸没在一种致癌物质吖啶橙水溶液中。结果,证实由DNA制成的球形液晶凝胶具有吸附吖啶橙分子能力。可以认为吖啶橙吸附到DNA是由于嵌入并且因而预期也可以吸附内分泌干扰剂和典型的致癌物质,它们的特征在于具有平面的芳环。因此,可以将DNA液晶珠用作内分泌干扰剂的吸附剂。而且,也可以将空心的圆柱状液晶凝胶用在相同种类的应用中。
实施例5将实施例3中获得的膜-形状液晶凝胶用作芳族化合物如内分泌干扰剂的定量指示剂。换言之,将含有芳族化合物的样品进行接触以前的膜-形状液晶凝胶的着色度或者光透射度和与含有芳族化合物的样品进行接触之后的膜-形状液晶凝胶的着色度或者光透射度相比较,从而通过着色度或者光透射度允许芳族化合物如内分泌干扰剂的定量测量。
实施例6通过将水溶性DNA与凝胶多糖混合形成液晶凝胶。首先,在50℃将1重量%的作为一种水溶性DNA的由鲑鱼精巢获得的DNA粉末和5重量%的凝胶多糖溶解在通过将20mM的四硼酸钠和400mM的氢氧化钠溶解在水中制备的缓冲液中,从而制备含有DNA和凝胶多糖的核酸溶解液。随后,利用微量吸移管将所述核酸溶解液滴在100-mM氯化钴和氯化铝水溶液中。同时滴在两种金属阳离子水溶液中的核酸-凝胶多糖混合物溶解液立即凝胶而形成凝胶珠。经过五分钟以后,在交叉棱镜条件下利用偏振板观察这些凝胶珠。结果,在两种金属阳离子水溶液的每一个中,形成具有液晶结构的凝胶珠。
实施例7以类似于实施例6的方式获得由DNA和凝胶多糖制成的液晶凝胶珠,不同之处在于通过溶解1重量%的由鲑鱼精巢获得的DNA粉末和3重量%的凝胶多糖制备核酸溶解液。
实施例8以类似于实施例6的方式获得由DNA和凝胶多糖制成的液晶凝胶珠,不同之处在于通过溶解0.5重量%的由鲑鱼精巢获得的DNA粉末和5重量%的凝胶多糖制备核酸溶解液。
在实施例6至8中获得的液晶凝胶珠特征在于它们几乎不溶解在DNA降解酶(DNase)的水溶液中。
实施例9通过以表2中列出的任何浓度(0.2至1重量%)将水溶性DNA溶解在水中制备核酸溶解液。在25℃将所述核酸溶解液从排放孔的孔径为0.5mm的喷嘴挤出到表2中列出的两种不同浓度(50mM和1M)的每一种氯化铝水溶液中,以形成所述水溶液中纤维状体的整个圆周上的渗析膜,同时渗析所述核酸溶解液。因此,可以容易形成各向异性的纤维状液晶凝胶。当成捆提供实施例9中获得的纤维状液晶凝胶而形成圆柱时,所述圆柱可以具有可管理的构造和可管理的强度。在表2中,在1.0重量%的DNA和浓度为100mM的氯化铝水溶液的条件下形成的凝胶是高度-取向的具有均一厚度的纤维状液晶凝胶。这纤维状液晶凝胶显示在图5中。
表2
实施例10通过将水溶性DNA与聚丙烯酸混合形成液晶凝胶。首先,在50℃将1重量%的作为一种水溶性DNA的由鲑鱼精巢获得的DNA粉末和1重量%的聚丙烯酸(MW=250,000)溶解在通过将20mM的四硼酸钠和400mM的氢氧化钠溶解在水中制备的缓冲液中,由此制备含有DNA和聚丙烯酸的核酸溶解液。随后,利用微量吸移管将所述核酸溶解液滴在100mM氯化钴和氯化铝水溶液中。同时滴在两种金属阳离子水溶液中的核酸-聚丙烯酸混合物溶解液立即凝胶而形成凝胶珠。经过五分钟以后,在交叉棱镜条件下利用偏振板观察这些凝胶珠。因而,揭示在两种金属阳离子水溶液的每一种中形成具有液晶结构的那种凝胶珠。在实施例10中获得的液晶凝胶珠特征在于它们几乎不溶解在酸或者碱中。这个事实显示它可以在不碎裂的情况下用作能吸附来自活体的致癌物质的凝胶珠。
实施例11通过将水溶性DNA浸没在含有金属阳离子的极性溶剂的水溶液中形成液晶凝胶。首先,在25℃通过将0.7重量%的作为一种水溶性DNA的由鲑鱼精巢获得DNA粉末溶解在20mM的四硼酸钠和400mM的氢氧化钠溶解在水中的缓冲液中来制备含有DNA的核酸溶解液。随后,利用微量吸移管将所述核酸溶解液滴到含有100mM的氯化铝乙醇水溶液、甲醇水溶液、和丙酮水溶液的每一个中。极性溶剂的浓度分别是10体积%。滴在铝阳离子水溶液中的核酸溶解液立即凝胶而形成凝胶珠。经过五分钟以后,在交叉棱镜条件下利用偏振板观察这些凝胶珠。
结果,揭示形成了具有液晶结构的凝胶珠。
工业实用性 首先,本发明的液晶凝胶兼备芳族化合物的吸附性和光学性质,它可用于内分泌干扰剂的吸收剂。将空心圆柱状液晶凝胶或者球形液晶凝胶填充在柱中并且然后允许含有内分泌干扰剂的有害溶液通过所述柱以致可以在工业上吸附内分泌干扰剂。第二,因为大多数内分泌干扰剂具有生色性质,吸收内分泌干扰剂的膜-形状液晶凝胶或者上述柱显示其着色度或者光透射度的改变,以致它可以用于内分泌干扰剂的指示剂。当所述内分泌干扰剂不具有生色性质时,具有排列在其双边的交叉棱镜的液晶凝胶显示吸附前后之间的光透射的改变,以致它也可以用作指示剂。第三,因为预期用作有机EL的大多数颜色颜料是具有芳环结构低-分子量的化合物,所以可以通过嵌入这些颜色颜料来制造同时具有选择性光透射和晶体功能的装置。第四,因为它具有掺杂的金属铁,所以作为新的导电材料的本发明液晶凝胶的膨胀能力可以是期望的。
权利要求
1.一种凝胶,所述凝胶包含核酸、核酸和棒状聚合物、核酸和半-柔性的聚合物、或核酸、棒状聚合物和半-柔性的聚合物的组合,并且具有柱、筒、锥体、棒、纤维、球、板、或膜形状的液晶结构。
2.根据权利要求1的凝胶,其中所述核酸是DNA或DNA和RNA的组合。
3.根据权利要求1的凝胶,其中以柱、筒、锥体、棒、或纤维形状形成所述凝胶,并且其主要成分是在其垂直于纵向的横截面上进行观察时从所述中心放射状取向的核酸。
4.根据权利要求3的凝胶,其中所述凝胶具有在其垂直于纵向的横截面上进行观察时的同心多层结构。
5.根据权利要求1的凝胶,其中所述凝胶是球形的,并且主要成分是在径向横截面上进行观察时从其中心放射状取向的核酸。
6.根据权利要求5的凝胶,其中所述凝胶具有在径向横截面上进行观察时的同心多层结构。
7.根据权利要求1的凝胶,其中所述凝胶是以板或膜的形状形成的,并且主要成分是在板或膜表面上进行观察时从所述中心放射状取向的核酸。
8.根据权利要求7的凝胶,其中所述凝胶具有在板或膜表面上进行观察时的同心多层结构。
9.根据权利要求1的凝胶,其中所述棒状聚合物或所述半-柔性的聚合物是多糖、多糖衍生物、或其组合。
10.根据权利要求1的凝胶,其中所述棒状聚合物或所述半-柔性的聚合物是蛋白质、变性蛋白、聚氨基酸、或其组合。
11.根据权利要求1的凝胶,其中所述棒状聚合物或所述半-柔性的聚合物是合成聚合物。
12.根据权利要求11的凝胶,其中所述合成聚合物是聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚乙烯醇、聚乙烯甲醚、聚乙烯基吡咯烷酮、聚丙烯酸、或聚苯乙烯磺酸盐或酯。
13.用于制造凝胶的方法,所述方法包含下列步骤通过将水溶性核酸溶解在水、缓冲液、含盐的水溶液、极性溶剂的水溶液、或其混合物中制备核酸溶解液;和在含有化合价为2或更多的多价的金属阳离子的水溶液中渗析所述核酸溶解液以获得主要成分是核酸的具有液晶结构的凝胶。
14.根据权利要求13的方法,其中核酸溶解液是通过将水溶性DNA溶解在缓冲液、含盐的水溶液、极性溶剂的水溶液、或其混合物中制备的;并且获得具有液晶结构凝胶的步骤包括将所述核酸溶解液填充并密封在渗析-膜筒中,将填充并密封在所述筒中的核酸溶解液浸没在含有化合价为2或更多的多价金属阳离子的水溶液中,然后渗析所述核酸溶解液以在所述筒中形成同心的并且在垂直于所述筒的纵向的横截面上进行观察时从所述中心放射状取向的圆柱状液晶结构,并且将所述凝胶从所述筒取出然后用水漂洗所述凝胶以获得实心圆柱状凝胶或具有空心圆柱状中心部分的筒状凝胶的步骤。
15.根据权利要求14的方法,所述方法还包含在筒中形成具有圆柱状液晶结构的凝胶然后从含有化合价为2或更多的多价金属阳离子的水溶液取出所述筒到空气中接着将它保持放置的步骤;并且将所述筒浸没在所述水溶液中并渗析所述核酸溶解液以在所述筒中形成在垂直于所述筒的纵向的横截面上进行观察时具有同心多层结构筒状凝胶。
16.根据权利要求13的方法,其中通过将水溶性DNA溶解在缓冲液、含盐水溶液、极性溶剂水溶液、或其混合物中制备所述核酸溶解液;并且获得具有液晶结构凝胶的步骤包括下列步骤利用注射器、喷嘴、喷雾器、或微量吸移管将所述核酸溶解液滴到含有化合价为2或更多的多价金属阳离子的水溶液中以在所述水溶液中的液滴全部圆周上形成渗析膜,同时渗析所述核酸溶解液以形成球形凝胶,所述球形凝胶是当在径向横截面上进行观察时从所述渗析膜中的中心放射状取向的。
17.根据权利要求16的方法,还包含下列步骤在含有化合价为2或更多的多价金属阳离子的水溶液中的液滴的全部圆周上形成渗析膜然后将球形凝胶从所述水溶液取出到空气中,在所述球形凝胶上在全部圆周上形成所述渗析膜,接着将其保持放置;并且将保持放置的球形凝胶浸没在所述水溶液中并渗析所述核酸溶解液以在所述渗析膜中形成在其径向横截面上进行观察时的具有同心多层结构的球形凝胶。
18.根据权利要求13的方法,其中通过将水溶性DNA溶解在缓冲液、含盐水溶液、极性溶剂水溶液、或其混合物中制备所述核酸溶解液;并且获得具有液晶结构凝胶的步骤包括下列步骤使滴在第一板上然后用另一个第二板覆盖的核酸溶解液变平;并且将夹在第一板和第二板之间变平的核酸溶解液浸没在含有化合价为2或更多的多价金属阳离子水溶液中以在不用所述水溶液中的第一和第二板覆盖的情况下在一部分变平的核酸溶解液上形成渗析膜,同时通过用所述渗析膜渗析所述核酸溶解液使所述变平的核酸溶解液成为板或膜,以在所述渗析膜中形成板-形状或膜-形状的凝胶,它是同心的并且当在板表面或膜表面上进行观察时从所述中心是放射状取向的;并且将所述凝胶从所述第一和第二板取出并用水漂洗所述凝胶以获得板-形状或膜-形状的凝胶。
19.根据权利要求18的方法,还包含下列步骤在含有化合价为2或更多的多价金属阳离子水溶液中的第一和第二板之间形成具有板-形状或膜-形状液晶结构的凝胶,然后从含有化合价为2或更多的多价金属阳离子水溶液将第一和第二板取出到空气中接着将它们保持放置;并且将保持放置的所述第一板和第二板浸没在所述水溶液中并渗析所述核酸溶解液以在第一板和第二板之间形成在板表面或膜表面上进行观察时具有同心多层结构的板-形状或膜-形状的凝胶。
20.根据权利要求13的方法,其中通过将水溶性DNA溶解在缓冲液、含盐水溶液、极性溶剂水溶液、或其混合物中制备所述核酸溶解液;并且获得具有液晶结构的凝胶的步骤包括下列步骤将所述核酸溶解液从注射器或喷嘴挤出到含有化合价为2或更多的金属阳离子水溶液中,以在所述水溶液中的棒状或纤维状体的全部圆周上形成渗析膜,同时渗析所述核酸溶解液以在所述渗析膜中形成具有棒状或纤维状液晶结构的凝胶,它是同心的并且当在其垂直于所述纵向的横截面上进行观察时从所述中心是放射状取向的;和从所述水溶液取出凝胶然后用水漂洗所述凝胶以获得实心或空心的棒状或纤维状凝胶。
21.根据权利要求20的方法,还包含下列步骤在含有化合价为2或更多的多价金属阳离子的水溶液中的棒状或纤维状体的全部圆周上形成渗析膜,然后将具有形成在所述全部圆周上的渗析膜的棒状或纤维状凝胶从所述水溶液取出到空气中接着保持放置;和将所述棒状或纤维状凝胶浸没并渗析所述核酸溶解液以在所述渗析膜中形成当在垂直于纵向的横截面上进行观察时具有同心多层结构的棒状或纤维状凝胶。
全文摘要
本发明意欲廉价地大量生产水不可溶的结晶凝胶,所述结晶凝胶主要包括同时具有凝胶性质和液体-结晶性质也同时具有芳族化合物的吸附性和光学性质的核酸。通过将核酸溶解在水、缓冲液、含盐的水溶液、极性溶剂水溶液、或其混合物中制备核酸溶解液;并且然后将所述核酸溶解液在含有化合价为2或更多的多价金属阳离子的水溶液中渗析以获得以柱、筒、锥体、棒、纤维、球、板、或膜形状的主要包括核酸的液晶凝胶。这液晶凝胶具有同心的并且在所述板或膜表面上进行观察时从所述中心是放射状取向的结构。
文档编号B01J20/24GK101018800SQ20058002921
公开日2007年8月15日 申请日期2005年8月25日 优先权日2004年8月30日
发明者土桥敏明, 山本隆夫, 北惠里香, 古泽和也, 南泽善行 申请人:国立大学法人群马大学