专利名称：一种测定咪唑立宾血药浓度的方法
技术领域：
本发明属医学检验领域，涉及体内药物的分析测定方法。具体涉及一种测定咪唑立宾血药浓度的方法。
背景技术：
咪唑立宾(mizoribine，MZR)是一种嘌呤核苷合成抑制剂，能特异性地抑制快速增长的淋巴细胞，从而产生免疫抑制作用。近年来在临床上用于抑制肾移植时的排斥反应，同时也用于治疗狼疮性肾炎、类风湿性关节炎及肾病综合征等自身免疫性疾病。该药的个体间药动学差异大，临床上须进行血药浓度监测以调整个体化给药方案。
目前关于生物样本中MZR的测定方法，仅国外有相关报道。现有的技术方法存在灵敏度低(最低定量限为0.25mg·L-1)、操作繁琐费时、效率低、分析成本高等种种缺陷，不适合常规治疗药物浓度监测。
发明内容
本发明的目的是克服已有技术的缺陷，提供一种简便、快速、灵敏的测定体内咪唑立宾血药浓度的方法。
本方法无需昂贵的设备和试剂，具有操作简便、快速、血浆用量少、成本低等优点，适合常规血药浓度监测。
本方法的技术方案是待测样品预处理后，经酸性流动相在色谱柱分离，用紫外检测器检测。
包括下述步骤1)样品预处理取待测样品，加入定量的有机溶媒蛋白沉淀剂进行蛋白沉淀，所述的有机溶媒蛋白沉淀剂选自甲醇、乙腈或甲醇和乙腈的混合物；2)样品分离与分析采用通用型的液相色谱柱，其填料为Phenomenex Luna NH2，高效液相系统采用通用型的紫外检测器以及高压泵，采用甲醇、乙腈和酸性水溶液(pH＝2.1～2.5)的混合液作为流动相，等度洗脱；本方法流动相优选甲醇-乙腈-0.1％三氟乙酸(85±2∶5±1∶10±1)混合液；采用紫外检测器280±1nm检测MZR的峰面积，用标准曲线方程换算成浓度。
本方法具有以下优点1.预处理方法简便一步有机溶媒蛋白沉淀法，适用于常规检测。
2.专属性强采用填料为Phenomenex Luna NH2的色谱柱作为固定相，甲醇、乙腈和酸性水溶液的混合液作为流动相，等度洗脱，12分钟完成测定，内源性物质和常用合并用药不干扰上述药物的测定。
3.灵敏度高最低定量限为0.1mg·L-1，优于文献报道的0.25mg·L-1。本发明方法快速准确、灵敏度高、操作简便、成本低、适合于临床常规血药浓度监测。MZR的线性范围为0.1～10mg·L-1。平均方法回收率分别为98.7％，日内和日间精密度RSD均小于9％。
图1是典型色谱图，其中，A未服用咪唑立宾的肾移植患者血浆；B空白血浆+标准品咪唑立宾(浓度0.1mg·L-1)；1咪唑立宾。
图2是服用咪唑立宾的肾移植患者色谱图(浓度0.26mg·L-1)，其中，1咪唑立宾。
具体实施例方式
实施例1色谱条件色谱柱Phenomenex Luna NH2(4.6mm×250mm，5μm，美国Phenomenex公司)；流动相∶乙腈-甲醇-0.1％三氟乙酸(85∶5∶10)；流速1.5mL·min-1；柱温30℃；检测波长，280nm。
血浆样品预处理取血浆样品100μL，加入乙腈液100μL，涡旋混合20s，4℃条件下12000×g离心10min，取上清液20μL进样。外标法以峰面积定量。
专属性取不同来源的10名未服用MZR的肾移植患者血样，按照上述样品预处理和测定方法进行测定，结果显示，未发现内源性物质对上述测定组分有干扰。取常用合并用药和非处方药物对照品溶液进样，结果显示，环孢素、强的松、他莫克司、西罗莫斯、更昔洛韦、倍他洛克、对乙酰氨基酚、硝苯地平、布洛芬、阿昔洛韦等均不干扰样品测定。其典型保留时间为7.6min。整个色谱分析过程时间为12min。
线性试验精密称取标准物质适量，用蒸馏水溶解成系列工作液，再加入适量空白人血浆，制成含MZR 0.1、0.5、2.5、5、7.5、10mg·L-1标准血样。取血浆100μL，按”血浆样品预处理”方法操作。外标法以MZR峰面积(x)和MZR浓度(y)作加权(1/x)线性回归，得线性回归方程为y＝9171-3·x-21.6，(r＝0.9996)。MZR血浆浓度在0.1～10mg·L-1范围内线性关系良好。最低定量浓度为0.1mg·L-1。
准确度和精密度精密称取标准物质适量，用蒸馏水溶解，空白血浆稀释定容，制成含MZR 0.2，4，8mg·L-1的低、中、高质控血样。取血浆100μL，按“血浆样品预处理”方法操作，考察日内和日间精密度和准确度。根据线性回归方程计算其实测浓度，计算每种浓度的实测平均值及相对标准偏差(RSD)，(C实测/C理论)×100％即为回收率，实验结果表明内源性物质不干扰待测物的测定。且上述待测组分和内标物质峰形对称、分离良好。表1为咪唑立宾的日内、日间精密度和方法回收率。
同时，本方法已在实际患者血药浓度的测定中得到了验证。
表1
实施例2色谱条件色谱柱Phenomenex Luna NH2(4.6mm×250mm，5μm，美国Phenomenex公司)；流动相∶乙腈-甲醇-0.1％三氟乙酸(85∶5∶10)；流速1.5mL·min-1；柱温30℃；检测波长，280nm。
血浆样品预处理取血浆样品100μL，加入乙腈和甲醇的混合液(1∶1，V/V)100μL，涡旋混合20s，4℃条件下12000×g离心10min，取上清液20μL进样。外标法以峰面积定量。
专属性取10名未服用MZR的肾移植患者血样，按照上述样品预处理和测定方法进行测定。另取常用合并用药和非处方药物对照品溶液进样。结果显示内源性物质、环孢素、强的松、他莫克司、西罗莫斯、更昔洛韦、倍他洛克、对乙酰氨基酚、硝苯地平、布洛芬、阿昔洛韦等均不干扰样品测定。其典型保留时间为7.6min。整个色谱分析过程时间为12min。
线性试验精密称取标准物质适量，用蒸馏水溶解成系列工作液，再加入适量空白人血浆，制成含MZR 0.1、0.5、2.5、5、7.5、10mg·L-1标准血样。取血浆100μL，按”血浆样品预处理”方法操作。外标法以MZR峰面积(x)和MZR浓度(y)作加权(1/x)线性回归，得线性回归方程为y＝9082.4·x-19.1，(r＝0.9996)。MZR血浆浓度在0.1～10mg·L-1范围内线性关系良好。最低定量浓度为0.1mg·L-1。最低检测浓度为0.3mg·L-1。
准确度和精密度精密称取标准物质适量，用蒸馏水溶解，空白血浆稀释定容，制成含MZR 0.2，4，8mg·L-1的低、中、高质控血样。取血浆100μL，按”血浆样品预处理”方法操作，考察日内和日间精密度和准确度(n＝6)。根据线性回归方程计算其实测浓度，计算每种浓度的实测平均值及相对标准偏差(RSD)，(C实测/C理论)×100％即为回收率。实验结果表明方法的日内和日间精密度均小于10％，相对标准偏差小于8％。
实施例3色谱条件色谱柱Phenomenex Luna NH2(4.6mm×250mm，5μm，美国Phenomenex公司)；流动相∶乙腈-甲醇-0.1％三氟乙酸(85∶5∶10)；流速1.5mL·min-1；柱温30℃；检测波长，280nm。
血浆样品预处理取血浆样品100μL，加入甲醇液200μL，涡旋混合20s，4℃条件下12000×g离心10min，取上清液30μL进样。外标法以峰面积定量。
专属性取10名未服用MZR的肾移植患者血样，按照上述样品预处理和测定方法进行测定。另取常用合并用药和非处方药物对照品溶液进样。结果显示内源性物质、环孢素、强的松、他莫克司、西罗莫斯、更昔洛韦、倍他洛克、对乙酰氨基酚、硝苯地平、布洛芬、阿昔洛韦等均不干扰样品测定。其典型保留时间为7.6min。整个色谱分析过程时间为12min。
线性试验精密称取标准物质适量，用蒸馏水溶解成系列工作液，再加入适量空白人血浆，制成含MZR 0.1、0.5、2.5、5、7.5、10mg·L-1标准血样。取血浆100μL，按”血浆样品预处理”方法操作。外标法以MZR峰面积(x)和MZR浓度(y)作加权(1/x)线性回归，得线性回归方程为y＝9174.8·x-27.6，(r＝0.9994)。MZR血浆浓度在0.1～10mg·L-1范围内线性关系良好。最低定量浓度为0.1mg·L-1。最低检测浓度为0.3mg·L-1。
准确度和精密度精密称取标准物质适量，用蒸馏水溶解，空白血浆稀释定容，制成含MZR 0.2，4，8mg·L-1的低、中、高质控血样。取血浆100μL，按”血浆样品预处理”方法操作，考察日内和日间精密度和准确度(n＝6)。根据线性回归方程计算其实测浓度，计算每种浓度的实测平均值及相对标准偏差(RSD)，(C实测/C理论)×100％即为回收率。实验结果表明方法的日内和日间精密度均小于10％，相对标准偏差小于8％。
权利要求
1.一种测定咪唑立宾血药浓度的方法，其特征是待测样品预处理后，经酸性流动相在色谱柱上分离，用紫外检测器检测，包括下述步骤1)样品预处理取待测样品，加入定量的有机溶媒蛋白沉淀剂进行蛋白沉淀；2)样品分离与分析采用通用型液相色谱柱，其填料为Phenomenex Luna NH2，高效液相系统采用通用型的紫外检测器以及高压泵，流动相采用甲醇-乙腈-0.1％三氟乙酸水溶液的混合液，等度洗脱；3)紫外检测器检测测峰面积，用标准曲线方程换算浓度。
2.按权利要求1所述的测定咪唑立宾血药浓度的方法，其特征是所述步骤1)的有机溶媒蛋白沉淀剂选自甲醇、乙腈或甲醇和乙腈的混合物。
3.按权利要求1所述的测定咪唑立宾血药浓度的方法，其特征是所述的有机溶媒蛋白沉淀剂是乙腈。
4.按权利要求1所述的测定咪唑立宾血药浓度的方法，其特征是所述步骤2)的流动相混合液其中甲醇∶乙腈∶0.1％三氟乙酸水溶液为85±2∶5±1∶10±1。
5.按权利要求1所述的测定咪唑立宾血药浓度的方法，其特征是所述的步骤3)的紫外检测器检测，检测波长为280nm。
全文摘要
本发明属医学检验领域，涉及体内药物的分析测定方法，具体涉及一种测定人血浆中咪唑立宾浓度的方法。本发明方法对待测样品经蛋白沉淀预处理后，在酸性流动相条件下等度洗脱，经色谱柱分离后，用紫外检测器检测。本方法样品取样量少，预处理方法简单、快速、灵敏，无需昂贵的设备和试剂，适用面广，成本低，适合于临床常规血药浓度的监测。
文档编号B01J20/281GK1804615SQ20061002338
公开日2006年7月19日 申请日期2006年1月16日 优先权日2006年1月16日
发明者焦正, 张明, 钟明康, 陆福明 申请人:复旦大学附属华山医院