专利名称：高效液相色谱分析复方骨肽的方法
技术领域：
本发明涉及一种药物分析方法，具体涉及一种利用反相离子对高效液相色谱分析骨肽、复方骨肽和全蝎提取物原料及制剂的方法。
背景技术：
骨肽的主要成分为从健康动物四肢骨中提取的水溶性物质，如多肽、蛋白肽、氨基酸、有机钙、磷、无机钙、无机盐、微量元素等。全蝎提取物是从全蝎中提取的水溶性物质，其主要成分类型同骨肽类似。复方骨肽是在骨肽的基础上加入一定量的全蝎提取物得到的复方制剂。现在市场上常见的有骨肽注射液(旧称骨宁注射液)和复方骨肽注射液。骨肽注射液是由健康动物四肢骨经提取制成的灭菌水溶液。复方骨肽注射液由健康猪或胎牛四肢骨与全蝎经提取制成的灭菌水溶液，即复方骨肽注射液是在骨肽注射液的基础上加入一定量的全蝎提取物制备而成。临床上用于治疗风湿、类风湿性关节炎、骨质增生、骨折等疾病。经临床验证，复方骨肽的药效作用远优于骨肽。复方骨肽注射液现在所使用的检定方法为用福林酚测定法，从回归方程中求出多肽含量；按药典中氮测定法，测定其总氮量(2000年版中国药典)。由于骨提取物与全蝎提取物成分比较接近，以往的检定方法无法区别骨肽和复方骨肽。
因骨提取物与全蝎提取物的主要成分均为多肽或蛋白肽，且两种提取物的主要成分非常接近，一般的检验方法无法将两种提取物区分开来，故需要寻找一种灵敏度高、识别力强的分析方法对复方骨肽注射液中的骨肽成分和全蝎成分进行有效区别，即定性分析，并能检定出二者含量。高效液相色谱法具有灵敏度高、识别力强、操作简便的特点，对于物质的定性定量分析都有较好的效果。有文献报道利用高效液相色谱分析检定多肽、氨基酸类物质(郭晓奎等神经肽注射液氨基酸组成成分及含量测定方法的研究《生物技术》5[6]34-35，1995)。但是，由于多肽、蛋白肽、氨基酸类物质无紫外吸收，使用常用的高效液相色谱法分析方法常常难以基线分离且保留时间短，因而对复方骨肽的分析仍然没有理想的方法。
发明内容
本发明的目的是克服常用高效液相色谱法分析复方骨肽时遇到的保留时间短、难以分离，不易紫外检测的困难，采用反相离子对高效液相色谱法对骨肽、复方骨肽及复方骨肽中的全蝎成分进行定性及定量分析，对骨肽及复方骨肽原料及制剂质量进行有效监控。
本发明的技术方案是，反相离子对高效液相色谱分析复方骨肽药品的方法，色谱条件如下，色谱柱反相柱；柱温室温；流速1ml/min(可根据具体情况进行适当调整)；紫外检测波长220-310nm中的任一值，也可以根据具体实施情况选择其他合理波长；流动相采用加入具有强紫外吸收性质的离子对试剂的pH稳定体系；该pH稳定体系为醋酸-醋酸盐缓冲体系或磷酸-磷酸盐缓冲体系，也可以是其他适宜的缓冲溶液体系；所述的离子对试剂是具有带正电荷的阳离子基团和带负电荷的阴离子基团的化合物；在上述条件下，测定待测样品的液相色谱特征曲线；通过特征峰确定两种组成物的含量，有效区分骨肽与复方骨肽。
以上方案中所述的具有带正电荷的阳离子基团和带负电荷的阴离子基团的化合物，可以选自苄基三甲基氯化铵、苄基三乙基氯化铵、对羟基苯甲酸、邻苯二甲酸氢钾、苯甲酸钠、N，N-二甲基对苯二胺盐酸盐中的一种或几种。
所述的反相柱为C8柱、C18柱或苯基柱。
本发明采用反相离子对高效液相色谱以紫外吸收检测样品、延长了样品的保留时间，骨肽特征峰保留时间为4.6±0.2min；全蝎特征峰可以达到5.2±0.2min和TR＝38.5±1.0min，可以保证达到分析目的。经实验证明，采用此方法得到了骨肽、复方骨肽及全蝎提取物的指纹图谱。可以很好的检测出复方骨肽中的骨肽成分和全蝎成分，并通过特征峰确定两种组成物的含量，有效区分骨肽与复方骨肽。本发明操作简便，使用方便，注射剂样品可直接进样检测，其他剂型样品及原料样品经稀释、过滤等简单处理后即可进样检测，并能快速得到检测结果，适合用于对产品进行质量监控。
图1为全蝎提取液的高效液相色谱图，离子对试剂为苄基三甲基氯化铵；紫外检测波长240nm；色谱柱苯基柱。
图2为骨肽注射液的高效液相色谱图，色谱条件同图1。
图3为全蝎提取液C8柱高效液相色谱图。
图4为骨肽注射液C8柱高效液相色谱图。
图5为全蝎提取液C18高效液相色谱图。
图6为骨肽注射液C18高效液相色谱图。
图7为全蝎提取液的高效液相色谱图，离子对试剂为苄基三甲基氯化铵；紫外检测波长230nm；色谱柱苯基柱。
图8为全蝎提取液的高效液相色谱图，离子对试剂为苄基三甲基氯化铵；紫外检测波长252nm；色谱柱苯基柱。
图9为全蝎提取液的高效液相色谱图，离子对试剂为苄基三甲基氯化铵；紫外检测波长275nm；色谱柱苯基柱。
图10为骨肽注射液的高效液相色谱图，色谱体系中所使用的流动相为2％甲醇的醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH＝4.5)含苄基三甲基氯化铵10mmol/l；紫外检测波长262nm。
图11为全蝎提取液的高效液相色谱图，色谱条件同图10。
图12为骨肽注射液的高效液相色谱图，色谱体系中所使用的流动相为2％甲醇的醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH＝4.5)含苄基三甲基氯化铵5mmol/l；紫外检测波长262nm。
图13为全蝎提取液的高效液相色谱图，色谱条件同图12。
图14为骨肽注射液的高效液相色谱图，色谱体系中所使用的流动相为2％甲醇的醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH＝4.5)含苄基三甲基氯化铵3mmol/l；紫外检测波长262nm。
图15为全蝎提取液的高效液相色谱图，色谱条件同图14。
图16为全蝎提取物定量关系的标准曲线。
图17为复方骨肽注射液的高效液相色谱图。
具体实施例方式实施例1离子对试剂——苄基三甲基氯化铵的色谱考察色谱条件流动相pH＝4.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液(0.015mol/L)含苄基三甲基氯化铵5mmol/L；流速1ml/min；紫外检测波长240nm；柱温室温。
样品全蝎提取液、骨肽注射液(由南京健利达科技开发有限公司提供，批号050603)。
反相柱为C8柱。
取适量全蝎提取液和骨肽注射液，用流动相稀释后，分别取20μl注入色谱仪，所得色谱图参见图1、图2。
结论色谱条件下骨肽和全蝎得到了明显区分，经多次重复，确定骨肽特征峰保留时间TR＝4.6±0.2min；全蝎特征峰TR＝5.2±0.2min和TR＝38.5±1.0min。
实施例2几种色谱柱的比较色谱条件色谱柱分别使用Lichrospher C8、Lichrospher C18、LichrospherPhenyl色谱柱，规格均为4.6mm×300mm，5μm；流动相pH＝4.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液(0.015mol/L)含苄基三甲基氯化铵5mmol/L；流速1ml/min；紫外检测波长240nm；柱温室温。
样品全蝎提取液(批号050603)和骨肽注射液将两种样品分别用流动相稀释一定倍数后，各取20μl分别注入三种不同的色谱体系，所得色谱图见附图1，图2，图3，图4，图5，图6。对色谱图进行分析，见表1。
表1
结论各种反相柱均能够分辨全蝎特征峰，但是优选Phenyl柱。
实施例3考察不同比例有机溶剂的流动相色谱条件流动相C％(C＝10、5或0)甲醇的醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH＝4.5)含苄基三甲基氯化铵5mmol/L；流速1ml/min；色谱柱LichrospherPhenyl柱(4.6mm×300mm，5μm)，紫外检测波长262nm；柱温室温。
样品全蝎提取液(批号050603)和骨肽注射液将样品分别用流动相稀释后，取20μl注入到色谱仪中，比较所得色谱图中两种样品的区别。分析结果见表2。
表2
实施例4紫外检测波长的考察色谱条件色谱柱Lichrospher Phenyl柱(4.6mm×300mm，5μm)；流动相pH＝4.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液(0.015mol/L)含苄基三甲基氯化铵5mmol/L；紫外检测波长230nm、240nm、252nm、275nm；柱温室温；流速1ml/min。
样品全蝎提取液(批号050603)取适量样品用流动相稀释若干倍，注入20μl到色谱仪中，分别在上述波长下进行检测，所得色谱图参见图1，图7，图8，图9。由图中可以观察到，四个波长下均检测到保留时间约38min的全蝎特征峰，波长为240nm时特征峰较为明显。
实施例5离子对试剂浓度对检测的影响色谱条件流动相分别为2％甲醇的醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH＝4.5)含苄基三甲基氯化铵3mmol/l、5mmol/l和10mmol/l；紫外检测波长262nm；其余同实施例4样品全蝎提取液(批号050603)和骨肽注射液取样品适量，分别进样20μl于上述三种色谱体系中，所得色谱图参见附图10，图11，图12，图13，图14，图15，对色谱图进行比较，以考察合适的离子对试剂浓度(见表3)。
表3
结论苄基三甲基氯化铵浓度为5mmol/l时，检测灵敏度较好，较为合适。
实施例6流速的选择流动相为pH＝4.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液含苄基三甲基氯化铵5mmol/L，色谱柱分别为Lichrospher Phenyl柱(4.6mm×300mm，5μm)和Lichrospher C18柱(4.6mm×300mm，5μm)时，调整流速使其分别为0.5、0.8、1.0、1.2ml/min，观察压力变化情况。见表4。
表4
实施例7方法学考察色谱条件色谱柱Lichrospher Phenyl色谱柱(4.6mm×300mm，5μm)；流动相pH＝4.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液含苄基三甲基氯化铵5mmol/L；流速1ml/min；紫外检测波长240nm；柱温室温。
样品生药浓度为0.04g/ml的全蝎提取液(批号050603)1、标准曲线的制定精密量取全蝎提取物溶液0.625，0.85，1.0，1.25，2.5ml分别置于10ml容量瓶中，用流动相定容至刻度，即得到浓度为2.5、3.4、4.0、5.0、10mg/mL的全蝎提取物样品。依次进样，每次进样20μL，每两次进样间隔60min，测量特征峰保留时间和峰面积，各浓度样品分别测三次，取三次峰面积积分平均值。以峰面积为纵坐标，样品进样浓度为横坐标，绘制标准曲线(图16)，得回归方程y＝2E+06x-326.75，r＝0.9984，线性范围2.5-10mg/ml(生药浓度)。
2、最低检出限、定量限及精密度分别将样品用流动相稀释不同倍数。在色谱条件稳定的情况下分别进样20μL。分析所得色谱图，发现样品浓度为0.4mg/ml时，特征峰峰高为噪音的3倍左右，故认为全蝎提取液最低检测限是样品浓度为0.4mg/ml(生药浓度)；样品浓度为1.5mg/ml时，特征峰峰高为噪音的10倍左右，故认为全蝎提取液定量限是样品浓度为1.5mg/ml(生药浓度)；取12mg/ml、8mg/ml、3mg/ml(高、中、低)三种浓度的样品，于不同的时间进样，计算日间精密度和日内精密度日内RSD分别为1.76％、2.08％、1.97％；日间RSD分别为1.85％、1.66％、2.21％。
实施例8全蝎提取液的含量测定色谱条件同实施例7；1、已知浓度的全蝎提取液对标准曲线的验证浓度样品全蝎提取液，浓度为0.08g/ml(生药浓度)操作过程将样品用流动相稀释10倍，进样三次，对所得色谱图进行峰面积积分，三次平均峰面积x＝30874带入实施例7中的标准曲线回归方程，最后折算出该样品中全蝎提取物浓度为0.078g/ml。
2、未知浓度的全蝎提取液的含量测定样品浓度未知的全蝎提取液(批号050601)操作过程将样品用流动相稀释5倍，进样三次，对所得色谱图进行峰面积积分，特征峰平均保留时间为37.62min，将三次平均峰面积带入实施例7中的标准曲线回归方程，最后折算出该样品中全蝎提取物浓度为0.028g/ml(生药浓度)。
实施例9对复方骨肽注射液的质量验证色谱条件同实施例7；样品5批不同时间(2002-2005年)生产的复方骨肽注射液(由南京健利达科技开发有限公司提供)将样品用流动相稀释后，各进样20μl，从得到的色谱图中均可观察到全蝎特征峰。其中一样品所得色谱图参见图17。图17中全蝎特征峰保留时间约39min。将峰面积带入标准曲线回归方程，折算后，得到该样品中全蝎浓度为0.006g/ml(生药浓度)。
实施例10，与上述实施例基本相同，但具有带正电荷的阳离子基团和带负电荷的阴离子基团的化合物采用苄基三乙基氯化铵；反相柱为C18柱。
实施例11，与上述实施例基本相同，但具有带正电荷的阳离子基团和带负电荷的阴离子基团的化合物采用对羟基苯甲酸；反相柱为苯基柱。
实施例12，与上述实施例基本相同，但具有带正电荷的阳离子基团和带负电荷的阴离子基团的化合物采用邻苯二甲酸氢钾。
实施例13，与上述实施例基本相同，但具有带正电荷的阳离子基团和带负电荷的阴离子基团的化合物采用苯甲酸钠。
实施例14，与上述实施例基本相同，但具有带正电荷的阳离子基团和带负电荷的阴离子基团的化合物采用N，N-二甲基对苯二胺盐酸盐。
实施例15，与上述实施例基本相同，但具有带正电荷的阳离子基团和带负电荷的阴离子基团的化合物采用苄基三甲基氯化铵与对羟基苯甲酸、实施例16，与上述实施例基本相同，但具有带正电荷的阳离子基团和带负电荷的阴离子基团的化合物采用苄基三甲基氯化铵与邻苯二甲酸氢钾。
实施例17，与上述实施例基本相同，但具有带正电荷的阳离子基团和带负电荷的阴离子基团的化合物采用苄基三甲基氯化铵与苯甲酸钠。
实施例18，与上述实施例基本相同，但具有带正电荷的阳离子基团和带负电荷的阴离子基团的化合物采用苄基三甲基氯化铵与N，N-二甲基对苯二胺盐酸盐。
实施例19，与上述实施例基本相同，但具有带正电荷的阳离子基团和带负电荷的阴离子基团的化合物采用苄基三乙基氯化铵与对羟基苯甲酸。
实施例20，与上述实施例基本相同，但具有带正电荷的阳离子基团和带负电荷的阴离子基团的化合物采用苄基三甲基氯化铵、邻苯二甲酸氢钾与苯甲酸钠。
实施例21，与上述实施例基本相同，但具有带正电荷的阳离子基团和带负电荷的阴离子基团的化合物采用对羟基苯甲酸、邻苯二甲酸氢钾、苯甲酸钠与N，N-二甲基对苯二胺盐酸盐。
权利要求
1.一种高效液相色谱分析复方骨肽的方法，色谱条件如下，色谱柱反相柱；柱温室温；流速1ml/min；紫外检测波长220-310nm中的任一值；流动相采用加入具有强紫外吸收性质的离子对试剂的pH稳定体系；该pH稳定体系为醋酸-醋酸盐缓冲体系或磷酸-磷酸盐缓冲体系；所述的离子对试剂是具有带正电荷的阳离子基团和带负电荷的阴离子基团的化合物；在上述条件下，测定待测样品的液相色谱特征曲线；通过特征峰确定两种组成物的含量，有效区分骨肽与复方骨肽。
2.一种权利要求1中所述的高效液相色谱分析复方骨肽的方法，其特征在于，所述的具有带正电荷的阳离子基团和带负电荷的阴离子基团的化合物选自苄基三甲基氯化铵、苄基三乙基氯化铵、对羟基苯甲酸、邻苯二甲酸氢钾、苯甲酸钠、N，N-二甲基对苯二胺盐酸盐中的一种或几种。
3.一种权利要求1或2中所述的高效液相色谱分析复方骨肽的方法，其特征在于，所述的反相柱为C8柱、C18柱或苯基柱。
全文摘要
高效液相色谱分析复方骨肽的方法，色谱条件如下，色谱柱反相柱；柱温室温；流速1ml/min；紫外检测波长220－310nm中的任一值；流动相采用加入具有强紫外吸收性质的离子对试剂的pH稳定体系醋酸－醋酸盐或磷酸－磷酸盐缓冲体系；离子对试剂是具有带正电荷的阳离子基团和带负电荷的阴离子基团的化合物；在上述条件下测定待测样品的液相色谱特征曲线；通过特征峰确定两种组成物的含量，有效区分骨肽与复方骨肽。本发明延长了样品的保留时间，可保证达到分析目的，得到了骨肽、复方骨肽及全蝎提取物的指纹图谱。可检测出复方骨肽中的骨肽成分和全蝎成分，并通过特征峰确定两种组成物的含量，有效区分骨肽与复方骨肽。
文档编号B01J20/281GK1908653SQ20061003780
公开日2007年2月7日 申请日期2006年1月16日 优先权日2006年1月16日
发明者任勇, 王晓洁, 马学琴, 朱贯臣, 吉爱宁 申请人:南京师范大学, 南京健利达科技开发有限公司