专利名称：一种以树枝状大分子聚酰胺－胺为键合固定相的新型毛细管柱电色谱柱的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种新型的毛细管电色谱柱的制备方法，特别是以树枝状大分子作为键合固定相，以脱氧核糖核酸和核糖核酸作为键合配体的毛细管电色谱柱的制备方法。
背景技术：
毛细管电色谱技术是一种高效、快速的新型分离技术。它可以分离从离子到中性分子、从小分子到生物大分子的一系列化合物，尤其符合以生物工程为代表的生命科学领域内多肽、蛋白质、脱氧核糖核酸的分离分析及环境实际样品分析的要求。而毛细管电色谱柱的制备是毛细管电色谱分离分析很重要的环节，因为柱性能，如柱重复性、柱寿命、柱效等是实际应用时的最关键、最基础的指标。树枝状分子是具有最高支度化的三维大分子，具有非常规整及可控制的结构，并且当树枝状大分子达到一定的分子代数后表面将具有大量功能性端基，这样即可提供对内部空间的保护，也可对外部的物质起着重要的分子识别作用。
将树枝状大分子的独特结构引入毛细管柱内壁，可以大大增加开管电色谱柱的比表面积，增大柱容量和良好的选择性，从而提升柱的性能。因而我们考虑研究通过合适的硅烷化试剂将树枝状大分子引入到毛细管电色谱柱中，然后继续在端基上键合配体从而得到一种新型的开管毛细管电色谱柱，以实现对生物大分子的选择性分离。本发明制备工艺简单，制备过程无三废，属于环境友好过程。
发明内容
本发明的目的是制备一种新型的毛细管电色谱柱，以特殊的树枝状大分子作为键合固定相，可以大大增加电色谱柱的比表面积，增大柱容量和提供良好的选择性，从而提升柱的性能。通过进一步在树枝状大分子的端氨基上键合脱氧核糖核酸和核糖核酸，使其拥有特定的选择性分离能力，能够对许多复杂的生物大分子进行分离分析。
本发明的要点利用树枝状大分子的结构特点，将其作为固定相键合于毛细管柱内壁，并且继续在其端氨基上引入生物活性大分子配体。其具体制备过程包括(1)树枝状大分子在毛细管内壁的键合以3-氨丙基三乙氧基硅烷做硅烷化试剂，丙烯酸甲酯为马氏加成剂，通过多次重复的马氏加成反应、酰胺化反应，在毛细管内壁键合了聚酰胺-胺修饰的开管毛细管电色谱柱。
(2)在树枝状大分子聚酰胺-胺修饰的毛细管电色谱柱的端氨基上键合脱氧核糖核酸配体利用丁二酰化法将脱氧核糖核酸键合至树枝状大分子聚酰胺-胺修饰的毛细管电色谱柱的端氨基上，合成以聚酰胺-胺为间隔臂，脱氧核糖核酸为配体的新型亲和电色谱柱。
(3)在树枝状大分子聚酰胺-胺修饰的毛细管电色谱柱的端氨基上键合脱氧核糖核酸配体利用溴化法成功将核糖核酸作为配体键合到树枝状大分子聚酰胺-胺修饰的开管毛细管电色谱柱的内壁，得到了以聚酰胺-胺为间隔臂，核糖核酸为配体的新型亲和电色谱柱。
实施例实施例1在毛细管内壁键合树枝状大分子固定相截取一定长度的毛细管后，首先用1M的NaOH溶液冲洗，再用去离子水冲洗，然后用1M的HCl溶液冲洗，再用水冲洗，然后用N2冲洗。将预处理好的毛细管用甲苯冲洗，然后将10％的3-氨丙基三乙氧基硅烷甲苯溶液灌入毛细管柱，两端封口，在110℃恒温反应4小时，然后再用甲苯冲洗。重复两次。将上步的毛细管先用甲醇冲洗，然后将10％的丙烯酸甲酯甲醇溶液灌入柱中，两端封口，在40℃恒温反应25小时，然后用甲醇冲洗10分钟，合成0.5代大分子键合固定相。将上步的毛细管先用甲醇冲洗，然后将20％的乙二胺甲醇溶液灌入柱中，两端封口，在40℃恒温反应30小时，然后用甲醇冲洗1.5小时，合成1.0代大分子键合固定相。重复以上步骤合成2.0、3.0代树枝状大分子键合固定相。
实施例2在树枝状大分子固定相的端氨基上键合脱氧核糖核酸配体用自制的冲洗装柱装置将丁二酸的吡啶溶液压入三代树枝状大分子修饰的开管毛细管电色谱柱中，两端封口，于室温下反应30小时；依次用吡啶，水，丙酮冲洗毛细管十分钟，二十分钟和三十分钟，然后以氮气冲30分钟；称适量的NHS，EDAC溶于异丙醇后，压入毛细管中，反应5小时；用异丙醇冲洗毛细管后，用1M的磷酸钠溶液冲洗10分钟，将脱氧核糖核酸的磷酸钠溶液压入毛细管柱，反应120小时；依次用去离子水，磷酸钠冲洗毛细管，每次十分钟，共五次，然后以氮气冲0.5h。
实施例3在树枝状大分子固定相的端氨基上键合核糖核酸配体称取适量核糖核酸放于平底烧瓶中，加入搅拌子，分批加入10mL HAC-NaAC缓冲溶液使其溶解在其溶液中，滴加液溴少量，5分钟后再滴加入少量，10分钟后再滴加入部分，体系颜色为橙黄色，10分钟后再加入部分，体系颜色变为深黄色，再过10分钟后加入部分液溴，直至体系颜色为橙红色为止，接上冷凝管，室温下高速搅拌4小时。过量的液溴用四氯化碳萃取至无色为止。用0.01M的氢氧化钠调节pH值为11.5然后用自制的毛细管柱灌柱装置将萃取后的溶液压入三代树枝状大分子修饰的开管毛细管电色谱柱中，两端封口，在室温下反应55小时，然后用去离子水冲洗2小时，封口备用。
权利要求
1.一种新型的毛细管电色谱柱的制备方法，其特征在于以3-氨丙基三乙氧基硅烷作为硅烷化试剂，将树枝状大分子聚酰胺-胺键合至毛细管柱内壁，并且在聚酰胺-胺的端氨基上键合脱氧核糖核酸和核糖核酸配体。(1)树枝状大分子在毛细管内壁的键合树状大分子是一类新型的功能高分子化合物，它是由多官能基内核出发，向外重复生长，高度支化的三维大分子，其特点是可以在分子水平进行分子的大小、形状和功能基团的设计。以3-氨丙基三乙氧基硅烷做硅烷化试剂，丙烯酸甲酯为马氏加成剂，通过多次重复的马氏加成反应、酰胺化反应，在毛细管内壁键合了聚酰胺-胺修饰的开管毛细管电色谱柱。(2)在树枝状大分子聚酰胺-胺修饰的毛细管电色谱柱的端氨基上键合脱氧核糖核酸配体利用丁二酰化法将脱氧核糖核酸键合至树枝状大分子聚酰胺-胺修饰的毛细管电色谱柱的端氨基上，合成以聚酰胺-胺为间隔臂，脱氧核糖核酸为配体的新型亲和电色谱柱。(3)在树枝状大分子聚酰胺-胺修饰的毛细管电色谱柱的端氨基上键合脱氧核糖核酸配体利用溴化法成功将核糖核酸作为配体键合到树枝状大分子聚酰胺-胺修饰的开管毛细管电色谱柱的内壁，得到了以聚酰胺-胺为间隔臂，核糖核酸为配体的新型亲和电色谱柱。
2.根据权利要求1所述新型毛细管电色谱柱的制备，其特征是用于制备毛细管电色谱柱的固定相为树枝状大分子聚酰胺-胺，可以根据需要键合不同代数的大分子至毛细管内壁上。
3.根据权利要求1所述的可以在聚酰胺-胺修饰的毛细管电色谱柱上进一步键合脱氧核糖核酸和核糖核酸配体。
4.根据权利要求1、2、3所述所述新型毛细管电色谱柱的制备，其特征是以树枝状大分子聚酰胺-胺作为毛细管电色谱柱的固定相和将脱氧核糖核酸或核糖核酸等不同的反应配体键合至树枝状大分子聚酰胺-胺的端氨基的制备方法。
全文摘要
本发明涉及一种新型的毛细管电色谱柱的制备方法，特别是以树枝状大分子作为键合固定相，以脱氧核糖核酸和核糖核酸作为键合配体的毛细管电色谱柱的制备方法。树枝状分子是具有最高支度化的三维大分子，具有非常规整及可控制的结构，并且当树枝状大分子达到一定的分子代数后表面将具有大量功能性端基，这样即可提供对内部空间的保护，也可对外部的物质起着重要的分子识别作用。将树枝状大分子的独特结构引入毛细管柱内壁，可以大大增加开管电色谱柱的比表面积，增大柱容量和良好的选择性，从而提升柱的性能，通过进一步在树枝状大分子的端氨基上键合脱氧核糖核酸和核糖核酸，使其拥有特定的选择性分离能力，能够对许多复杂的生物大分子进行分离分析。制备过程包括以3－氨丙基三乙氧基硅烷作为硅烷化试剂，将树枝状大分子聚酰胺－胺键合至毛细管柱内壁，和在聚酰胺－胺修饰得毛细管电色谱柱的端氨基上键合脱氧核糖核酸和核糖核酸配体。
文档编号B01D15/10GK101081338SQ20061008127
公开日2007年12月5日 申请日期2006年5月29日 优先权日2006年5月29日
发明者杨屹, 陆珂 申请人:北京化工大学