专利名称：植物根内生防细菌的快速、高效筛选方法
技术领域：
本发明属于农业生产技术领域。是一种为拮抗植物病原真菌的植物根内生防 细菌快速、高效筛选方法。
背景技术：
全国各地每年都会因植物病害引起植株矮小、瘦弱、黄化等不同症状，严重 时全株死亡，造成巨大的经济损失，其中有80%病害属于真菌病害。在防治方面， 化学防治虽然见效快，但易造成农药残留、环境污染，对人们身体健康产生潜在 的威胁；同时化学农药的长期使用，病原菌也易对其产生抗药性因而导致防治效 果下降。细菌存在范围广，种类多，数量大，繁殖快，它们中有的能产生拮抗性 物质，抑制病原菌，并且促进植物的生长，所以利用细菌防治植物病害，尤其是 土传病害，具有很大的潜力。随着人们生活水平的提高，对食品安全性要求也在 不断地提高，筛选出可替代化学药剂防治植物病害的生防制剂成为迫切需要。国内外很多学者研究证明，有许多种拮抗性细菌具有防治植物病害尤其是土 传病害的能力，常见的有以下一些属芽孢杆菌属05^7'〃M)、肠杆菌属 (五她ra&"eter)、 欧文氏菌属(Erw'w'cr)、黄杆菌属(F/azoZwrcten'画)、哈夫尼菌属 (//a> 'a)、小单孢菌属(Mkrowow少ora)、假单胞菌属(Psew. tfomowas)、固氮菌属 (JzotoZwcfer)、根瘤菌属(7 /^oZv'w附)、沙雷氏菌属(& "//")、链霉菌属(S^e/ /cw^a 力 和黄单胞菌属(Xaw/Zwwow必)。有的生防细菌不仅具有防病作用，同时还可以提 高种子的发芽率，还有明显的增产效应。目前，生防细菌的筛选普遍采用的步骤是，首先将植物组织研磨采用稀 释涂布平板法分离组织内能培养的绝大多数细菌，取单个菌落在平板上不断 划线纯化后，与病原真菌平板对峙培养进行筛选。如果从土壤中分离，则先 稀释土壤悬浮液采用稀释涂布平板法或稀释混合平板法分离土壤中适合该 培养基的所有细菌，纯化后进行平板一一对峙培养或点接法培养进行筛选。 工作量较大，重复工作较多，试验过程中需要的培养基和培养皿量大，筛选
到有生防效果的细菌概率较小，即耗时耗材。 发明内容本发明的目的是高效筛选防治植物真菌病害尤其是土传病害的植物根内生 防细菌，以达到縮短生防细菌的筛选阶段，加快生防细菌的开发和应用，使农业 生产实践中植物病害得到很好的控制。本发明的关键技术是对已有的传统分离、 筛选方法，进行了改进，采用改进的TY培养基，稀释平板法分离细菌，在另一 Ch+TY平板上均匀地涂上病原真菌悬浮液，然后接种菌落形状、大小和颜色不 同的IO个细菌菌落进行培养，观察真菌周围是否有抑菌带出现，有抑菌带出现 的即为目标细菌。改目前的先稀释平板法分离然后多次重复一一对峙培养筛选为 病原真菌涂布平板十对一培养法筛选。使生防细菌对病原真菌的拮抗能力明显增 强，并且时间短，根内生防细菌的筛选较传统筛选法节省15d左右。该方法耗材 少，工作量小，仅用传统方法的四分之一的材料，五分之一的工作量，筛选到的 细菌田间应用防治效果明显提高。具体方法如下1.细菌分离TY培养基的配制(适合多数细菌生长)Lactalbumin hydrolysate 2gYeast Extract 0.2gCaCl2 0.04gBacto-Agar 2.4gDistilled H20 200ml高压灭菌 15min分离步骤1) 取约0.1g干植物根，至于表面用酒精消毒的研钵中；2) 加入lmlMgS04缓冲液，将根样研磨成匀浆；3) 三支试管分别装入0.9ml MgS04缓冲液；4) 准备三个TY平板，培养皿背面标好日期和稀释度10—2、 l(T3、 10、5) 取0.1ml研磨的匀浆，置于第一支试管中；换一另支枪头，混匀，从中取 0.02ml置于TY平板上，用此枪头再取0.1ml置于第二支试管中；再换一 另支枪头，混匀，从中取0.02ml置于另一TY平板上，依次作三个平板;6) 将三角玻璃棒浸入酒精中稍许，于酒精灯上燃烧，重复两次；7) 用酒精消毒的三角玻璃棒涂匀TY平板，先涂l(T4，再涂l(X3，最后涂 该过程三角玻璃棒不用反复消毒；8) 将所有的平板于28'C细菌培养箱中培养。2.生防细菌初筛Ch+TY培养基的配制(适合多数真菌和细菌生长)Nutrient agar 4gYeast Extract 0.2gBacto-Agar 2g Lactalbumin hydrol.ysate O.lgDistilled H20 200ml高压灭菌 15min 初筛步骤1) 用MgS04缓冲液将病原真菌配制成悬浮液，浓度为1(^个孢子/ml。2) 取0.02ml病原真菌悬浮液均匀地涂在Ch+TY平板上；3) l(T2的平板第二天就有菌落出现，用己灭菌的接菌棒挑出，接种形状、 大小和颜色不同的10个细菌菌落于另一 Ch+TY平板上，但个别生长特快 的细菌只能一个Ch+TY平板上接种一个细菌菌落；4) 于25。C真菌培养箱中培养。3. 纯化培养2-3天，发现有的细菌周围出现抑菌圈(不长真菌)或菌丝长得较短、 产生较少孢子或没有孢子产生，即为目标细菌。将其用己灭过菌的接菌棒挑出， 于另一 Ch+TY平板上划线纯化，并且划8-10条线，换另一个无菌棒，以上一条 线为起点继续划线，于2St:细菌培养箱中培养。 一天即可观察，如果发现仍有 形状、大小和颜色不同的细菌菌落，则需分别挑取继续纯化，直至每皿呈现形状、 大小和颜色均相同的菌落。4. 复筛 将已纯化的细菌与病原真菌于Ch+TY平板上划平行线对峙培养，或于 Ch+TY平板中心点接入病原真菌，真菌周围约等距离四点接入细菌。于25。C真 菌培养箱中培养，2-3.天可测定抑菌带宽，计算抑菌率。5.生防菌保存将生防细菌接入直径为4cm的Ch+TY培养皿中心，或试管斜面划蛇形线， 28。C培养一天后，用封口膜封好，4t保存，备用。所用仪器设备DHP-9162A恒温培养相(天津泰斯特)、DL-CJ-IN超级洁 净工作台(北京东联)、Y60368微量移液器(上海雷勃)。
具体实施方式
本发明是中国科学院重大创新工程项目"东北地区农业水土资源优化调控 机制与技术体系研究"专题作物病、虫、草害生物生态控制关键技术研究(编 号KZCX1-SW-19-4-03)和黑龙江省"十五"重点科技攻关项目"主要农作物病 虫害可持续控制技术研究"专题大豆根腐病生物防治(编号GB01B201)中的 主要内容。我们于2002年1月至2006年12月在中国科学院东北地理与农业生 态研究所按以上步骤进行了生防细菌的筛选和中式生产，田间防治大豆根腐病效 果非常好，解决了生产实践中大豆根腐病生物防治的难题。既获得了经济效益，又获得了生态效益。本发明的使用材料较普遍，价格便宜，成本低，所需时间短，筛选的细菌生 防效果好，达到了高效的目的。广泛应用防治由镰孢菌属/^犯rh^引起的多种 植物根部腐烂病害。本发明将縮短生防细菌的分离和筛选所需时间，进一步保证 细菌的生防效果，加快生防细菌的开发和应用，促进我国生物防治的发展。
权利要求
1.一种植物根内生防细菌的高效筛选方法，其特征在于采用改进的TY培养基，稀释平板法分离细菌，在另一Ch+TY平板上均匀地涂上病原真菌悬浮液，然后接种菌落形状、大小和颜色不同的10个细菌菌落进行培养，观察真菌周围是否有抑菌带出现，有抑菌带出现的即为目标细菌；其方法及具体步骤如下a.细菌分离取约0.1g植物干根，至于表面用酒精消毒的研钵中，加入MgSO4缓冲液，将根样研磨成匀浆，准备三支试管分别装入0.9ml MgSO4缓冲液并配制成10-2、10-3、10-4的稀释液和三个TY平板，培养皿背面标好日期和稀释度10-2、10-3、10-4，分别从三支试管中取稀释液置于一TY平板上，依次作三个平板，将三角玻璃棒浸入酒精中稍许，于酒精灯上燃烧，重复两次，用酒精消毒的三角玻璃棒涂匀TY平板，先涂10-4，再涂10-3，最后涂10-2，该过程三角玻璃棒不用反复消毒，将所有的平板于28℃细菌培养箱中培养；b.生防细菌初筛配制病原真菌悬浮液，取病原真菌悬浮液均匀地涂在Ch+TY平板上，用已灭菌的接菌棒挑出每个培养皿形状、大小和颜色不同的10个细菌菌落，接种于已涂真菌孢子悬浮液的Ch+TY平板上，但个别生长特快的细菌只能一个Ch+TY平板上接种一个细菌菌落，于25℃真菌培养箱中培养，培养2-3天，发现有的细菌周围出现抑菌带(不长真菌)或菌丝长得较短、产生较少孢子或没有孢子产生，即为目标细菌；c.纯化用已灭过菌的接菌棒挑出目标细菌，于另一Ch+TY平板上划线纯化，并且划8-10条线，换另一个无菌棒，以上一条线为起点继续划线，于28℃细菌培养箱中培养，一天即可观察，如果发现仍有形状、大小和颜色不同的细菌菌落，则需分别挑取继续纯化，直至每皿呈现形状、大小和颜色均相同的菌落；d.复筛将已纯化的细菌与病原真菌于Ch+TY平板上划平行线对峙培养，或于Ch+TY平板中心点接入病原真菌，真菌周围约等距离四点接入细菌，于25℃真菌培养箱中培养，2-3天可测定抑菌带宽，计算抑菌率；e.生防菌保存将生防细菌接入直径为4cm的Ch+TY培养皿中心，或试管斜面划蛇形线，28℃培养一天后，用封口膜封好，4℃保存，备用。
全文摘要
本发明属于农业生产技术领域，是一种快速筛选植物真菌病害尤其是土传病害生防细菌的方法。改目前的先稀释平板法分离然后多次重复一一对峙培养筛选为病原真菌涂布平板十对一培养法筛选，明显提高了生防细菌筛选的效率，并且生防效果增强。本发明的使用材料与传统方法基本相同，价格便宜，方法快捷。广泛应用于多种植物真菌病害生防细菌筛选，适用于从不同植物组织内部及其器官内分离筛选生防细菌。本发明将缩短生防细菌的分离和筛选所需时间，加快生防细菌的开发和应用，促进我国生物防治的发展。
文档编号C12N1/20GK101148647SQ20071005605
公开日2008年3月26日 申请日期2007年9月11日 优先权日2007年9月11日
发明者李春杰, 许艳丽, 马光波 申请人:中国科学院东北地理与农业生态研究所