专利名称：离子交换色谱固定相及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及离子交换色谱固定相及其制备方法和应用。
技术背景离子交换是高效液相色谱(HPLC)中必不可少的分离模式，它广泛地应用于生物医学领 域，如氨基酸分析，肽和蛋白质的分离。使用离子交换色谱分离蛋白质时，被分离的蛋白质 的电荷密度和等电点值与色谱柱上的离子交换剂的离子容量大小决定保留能力的强弱。离子交换色谱固定相按其基质的成分大致分成有机和无机基质两大类。有机基质填料具 有良好的化学稳定性，可以在广泛的pH值范围内使用，能耐碱洗，具有较好的再生能力。 但是它们机械强度不高，孔结构比较复杂，在洗脱过程中容易产生溶胀或者收縮现象，这些 因素限制了有机基质填料在离子交换色谱中进一步的应用。目前，包括硅胶、二氧化锆在内 的无机基质填料是研究和应用的主流。硅胶具有良好的机械强度、容易控制的孔结构和比表 面积，可是它在碱性介质(PH>8)中不稳定，而且表面的硅羟基去质子化后易与蛋白质的氨 基发生较强的相互作用，因而不适于蛋白质分离。二氧化锆化学稳定性好，表面存在着丰富 的路易斯酸位点，用路易斯碱对其改性后能实现碱性蛋白质的分离。其缺点就是比表面积小， 孔径难以控制。羟基磷灰石也是一种可用于液相色谱填料的基质材料，主要成分为羟基磷酸钙， Cal0(PO4)6(OH)2。羟基磷灰石属于六方晶体，晶体上有两种不同的晶面，形成了两种具有 不同吸附特性的吸附位点，即位于Ca2+离子上的吸附阴离子的位点和位于P043-离子上的吸 附阳离子的位点，因此具有弱阴离子和弱阳离子交换的特性。另外，羟基磷灰石是动物骨骼 的基本成分，具有很好的生物相容性，所以它可以用作蛋白质分离的离子交换色谱填料。这 一应用始于1956年Tiselius等人的报道。1983年，出现了商品化的羟基磷灰石填充的HPLC 色谱柱。这种羟基磷灰石由细小的片状晶体组成，形状大小差别大，且在流动相的压力下容 易破碎，因而，柱效、柱子的通透性以及稳定性都不是很好，限制了它的广泛使用。近二十年来，为了提高羟基磷灰石的机械强度，改善分离性能，扩展使用范围，人们提 出了各种途径弥补羟基磷灰石晶体易碎的缺点。 一方面是制备球形羟基磷灰石，如二次造粒 技术、喷雾热解法等。但是这些球形颗粒是羟基磷灰石微晶通过物理作用堆积而成，机械强度的改善收到限制。中国科学院华工冶金研究所提出的均相法制备的球形羟基磷灰石，具有 粒径可控、性能稳定的特点，适合填充出柱压低、流速快的HPLC色谱柱。另一方面是制备 羟基磷灰石的复合物。有研究将磷酸化的硅胶微球先后浸入氯化钙和磷酸溶液得到羟基磷灰 石的替代物用来分离小麦胚芽中的拓扑异构酶。Honda等人用干法制备了羟基磷灰石或者牛 骨灰包覆聚乙烯的复合物，在梯度洗脱的模式下成功分离了五种蛋白质。然而，由于疏水作 用，蛋白质与聚乙烯之间会发生不可逆吸附，从而导致蛋白质回收率不高。发明内容本发明提供一种制备简单、成本低廉的羟基磷灰石包覆的离子交换色谱固定相及其制备 方法和用途。本发明提供的技术方案是 一种离子交换色谱固定相，由表面包覆有羟基磷灰石的色谱 基质材料构成。上述色谱基质材料为硅胶或锆镁复合氧化物。本发明还提供了上述离子交换色谱固定相的制备方法将硅胶微球或锆镁复合氧化物微 球于36.5土0.5'C，浸泡于过饱和转磷溶液中20—30天，得到表面包覆有羟基磷灰石的色谱 基质材料即为离子交换色谱固定相。上述硅胶微球先经过酸的活化，再浸泡于过饱和钙磷溶液中。 上述锆镁复合氧化物先经过预钙化处理，再浸泡于过饱和钙磷溶液中。上述过饱和钙磷溶液可通过下法制备将氯化钠，氯化钾，磷酸氢二钠，盐酸，氯化钙依次溶于二次水中，其最终离子浓度分别为[Na+]-136.8mM、 [K+]=3.7mM、 [Cl—]=144.5 mM、 [Ca2+]=3.10mM、 [HP042-]=1.86 mM;最后用三羟甲基氨基甲垸调节pH值为7.4。上述离子交换色谱固定相可用于蛋白质的分离，不会与蛋白质等生物大分子发生非特异 性吸附，能获得很高的回收率。本发明以氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、氯化钙、盐酸、三羟甲基氨基甲烷，水为原料， 采用仿生技术，在无机基质色谱填料表面包覆羟基磷灰石涂层，得到一种新型的离子交换色 谱固定相。这种填料由于具有很好的生物相容性和生物亲和力以及较高的机械强度，可在 HPLC下实现蛋白质的分离。此外，该法亦可用于制备羟基磷灰石涂层毛细管，降低蛋白质 与毛细管内壁的非特异性吸附，提高分离选择性。本发明方法操作简单、成本低廉。
图1为蛋白质在本发明制得的羟基磷灰石包覆锆镁复合氧化物离子交换色谱固定相上的分离。图中l为牛血清白蛋白；2为胰蛋白酶；3为溶菌酶；4为核糖核酸酶A; 5为细胞色 素C。图2为蛋白质在本发明制得的羟基磷灰石包覆硅胶离子交换色谱固定相色谱固定相上的 分离。图中l为牛血清白蛋白；2为胰蛋白酶；3为核糖核酸酶A; 4为细胞色素C; 5为溶 菌酶。
具体实施方式
实施例h羟基磷灰石包覆锆镁复合氧化物离子交换色谱固定相的制备及蛋白质的分离(1) 过饱和钙磷溶液的配制将分析纯的氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、盐酸、氯化钙依次溶于水，其离子浓度分别为[Na+]-136.8mM， [K+]-3.71 mM， [Cl>144.5 mM， [Ca2+]-3.10 mM， [HP042-]=1.86mM。配制好的溶液用三羟甲基氨基甲烷调节pH值为7.4于5 。C保存。(2) 羟基磷灰石涂层的沉积生长锆镁复合氧化物用1M氢氧化钠处理后，洗至中性， 160 'C下千燥8小时。接着，依次浸入0.5M磷酸氢二钠溶液及饱和氢氧化钙溶液中，清洗 千净后120 'C千燥。再将其浸泡到500mL过饱和钙磷溶液中，保持温度为36.5±0.5 。C，浸 泡一段时间后取出，二次水冲洗干净，120 'C干燥备用。(3) 蛋白质的分离将上述材料600 。C处理后，装入150mmX4.6mmi.d.色谱柱中， 以磷酸盐缓冲溶液为流动相，梯度模式下分离了五种蛋白质(如图l)。实施例2:羟基磷灰石包覆硅胶微球离子交换色谱固定相的制备及蛋白质的分离 5 pm硅胶微球用1 M盐酸处理后，洗至中性，160 "C下干燥8小时。将其浸泡到500 mL 的过饱和钙磷溶液中，保持温度为36.5±0.5 r,浸泡一段时间后取出，二次水冲洗干净，120 。C干燥。将上述材料装入150mmX4.6mini.d.色谱柱中，以磷酸盐缓冲溶液为流动相，梯度 模式下分离了五种蛋白质(如图2)。实施例3:羟基磷灰石涂层毛细管的制备取毛细管，依次用1M氢氧化钠溶液，二次水，1M盐酸，二次水冲洗l小时，后在通 氮气下120 'C干燥4小时。重力作用下将过饱和钙磷溶液连续注入毛细管中，保持温度为36.5 土0.5 °C，沉积14天，制备得到羟基磷灰石涂层的毛细管。
权利要求
1.一种离子交换色谱固定相，其特征在于该固定相由表面包覆有羟基磷灰石的色谱基质材料构成。
2. 根据权利要求1所述的离子交换色谱固定相，其特征在于色谱基质材料为硅胶或锆镁复 合氧化物。
3. 权利要求1或2所述的离子交换色谱固定相的制备方法，其特征在于将硅胶微球或锆镁复合氧化物微球于36.5±0.5'C，浸泡于过饱和钙磷溶液中20—30天，得到表面包覆有羟 基磷灰石的色谱基质材料即为离子交换色谱固定相。
4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于硅胶微球先经过酸的活化，再浸泡于过饱 和钙磷溶液中。
5. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于锆镁复合氧化物先经过预钙化处理，再浸泡于过饱和钙磷溶液中。
6. 根据权利要求3或4或5所述的制备方法，其特征在于过饱和钙磷溶液由氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、氯化钙、盐酸和三羟甲基氨基甲烷配制而成将氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、盐酸和氯化钙依次溶于二次水中，其最终离子浓度分别为[Na+h136.8 mM、 [K+]=3.71mM、 [Cr]=144.5 mM、 [Ca2+]=3.10 mM、 [HP042-]=1.86 mM;最后用三羟甲基氨 基甲烷调节pH值为7.4。
7. 权利要求1或2所述的离子交换色谱固定相在蛋白质分离中的应用。
全文摘要
一种离子交换色谱固定相，该固定相由表面包覆有羟基磷灰石的色谱基质材料构成。该离子交换色谱固定相，具备良好的生物相容性和生物亲和力以及较高的机械强度。其制备方法如下将无机基质色谱填料(硅胶或锆镁复合氧化物)活化后浸入过饱和钙磷溶液中，36.5±0.5℃放置一段时间后沉积得到羟基磷灰石涂层，二次水清洗干燥后得到羟基磷灰石包覆的离子交换色谱固定相，可用于蛋白质的分离。此法亦可用于毛细管内壁的涂层，减小其对蛋白质的非特异性吸附，同时提供离子交换性能，改善分离选择性。
文档编号B01J20/281GK101254458SQ20071016873
公开日2008年9月3日 申请日期2007年12月11日 优先权日2007年12月11日
发明者冯钰锜, 烃 李 申请人:武汉大学