专利名称：一种尼龙亲和膜的制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属尼龙亲和膜领域，特别是涉及一种以Reactive Red 120为配基的尼龙亲和膜 的制备方法及其在分离纯化木瓜蛋白酶中的应用。
背景技术：
木瓜蛋白酶Papain(EC3.4.22.2)是一类巯基蛋白酶，广泛存在于番木瓜(Carica papaya) 的根、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。广泛地应用于食品行业，如 啤酒的澄清和肉质的嫩化以及皮革、纺织、日化和制药工业。木瓜蛋白酶的纯化大部分是 采用沉淀法，但是这种方法仍然混有其他的蛋白酶，不能达到制药工业的需求。
目前，分离纯化木瓜蛋白酶的方法包括粗分离和精制分离，其中粗分离包括盐析法、 等电点沉淀法、有机溶剂分级分离法等，精制分离包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层 析、疏水层析以及共价层析等。尽管这些方法都有一定的优点，但都存在操作繁琐、样品 活性回收率低、纯化效果不理想等缺点，尤其是从大体积的稀溶液中提取少量的生物活性 物质时。
亲和膜色谱技术的应用可使蛋白质纯化倍数提高，而且具有选择特异性好、压降小、 耗时短、生物大分子在分离过程中变性几率小、允许较快的加料速度、可以重复利用、有 效降低成本等特点，与柱亲和色谱相比，更易实现规模化纯化分离。
发明内容
本发明所要解决的技术问题之一是提供一种尼龙亲和膜的制备方法； 本发明所要解决的技术问题之二是提供一种尼龙亲和膜在分离纯化木瓜蛋白酶中的应 用，克服了现有技术中操作方法烦琐、纯化效果不理想的缺点，可适用于规模化纯化分离。 本发明的一种尼龙亲和膜的制备方法，包括下列步骤
(1) 活化后的尼龙膜，浸入壳聚糖溶液中，室温反应后，80-卯'C烘干，用lvol.。/。醋酸和 去离子水冲，进行尼龙膜的改性；
(2) 经壳聚糖改性后的尼龙膜浸入Reactive Red 120染料溶液中，保温30-50min后，加 入质量分数为15n/。 20。/。NaCl溶液，55'C 6(TC恒温振荡反应30-40min,然后升高水浴温 度，加入Na2C03溶液，65'C 8(TC继续恒温振荡反应4-5h，分别用热的去离子水，甲醇 溶液，2mol/LNaCl溶液，尿素溶液和去离子水充分洗涤，得以Reactive Red 120为配基 的尼龙亲和膜。
所述的尼龙膜活化是指尼龙膜在25-3(TC lmol/LHCl中水解后，用甲醛进行活化；
所述壳聚糖溶液是指质量分数为2%的壳聚糖溶液(以lvol /。醋酸溶解)；
所述的Reactive Red 120染料溶液浓度为5mg/mL 15mg/ mL，优选8mg/ mL 12mg/
mL;
所述的Na2C03溶液是指质量分数为15% 20%Na2CO3溶液； 所述的甲醇溶液是指体积分数为10%甲醇溶液； 所述的尿素溶液是指6 mol/L尿素溶液。
本发明的一种尼龙亲和膜在分离纯化木瓜蛋白酶中的应用，该方法包括 Tris—HC1缓冲液中的木瓜粉，上样于以Reactive Red 120为配基的尼龙亲和膜，Tris 一HC1缓冲液冲洗后，用NaSCN溶液洗脱，得到木瓜蛋白酶。 尼龙亲和膜分离纯化木瓜蛋白酶的方法，具体步骤包括-
10-20张尼龙亲和膜上叠成膜堆，放入膜桥，以蠕动泵送入缓冲液和洗脱液，首先以 Tris—HCl缓冲液平衡10-20 min，流速为0.1-1.0 mL/min，随后以蠕动泵送入木瓜粉溶液通 过膜桥，然后以Tris—HCl缓冲液洗去未吸附上的蛋白质；最后以NaSCN的洗脱液进行洗 脱，得到目标蛋白质木瓜蛋白酶。
所述的Tris—HCl缓冲液是0.05mol/L lmol/L pH 8.0 8.5的Tris—HCl缓冲液，优选 0.05 mol/LpH 8.5的Tris—HC1缓冲液；
所述的木瓜粉溶液是10.0 15.0mg/mL的木瓜粉溶液； 所述的NaSCN溶液是指1 mol/L pH 6.0的NaSCN溶液。
通过上述方法得到的木瓜蛋白酶，可以测试酶活性和蛋白质含量，计算纯化倍数。 本发明的有益效果
(1) 本发明的分离纯化方法操作简单，耗时较少，纯化倍数和酶活性较高；
(2) 样品来源方便，与柱亲和色谱方法相比便于实现规模化纯化分离。
图1是利用尼龙亲和膜从木瓜粉中分离纯化木瓜蛋白酶的吸附洗脱的蛋白质含量及酶 活曲线。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术 人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限 定的范围。
实施例1
尼龙膜的活化和键合壳聚糖进行改性，具体步骤如下
(1) 尼龙膜先在25'C lmol/LHCl中水解24h，然后用甲醛进行活化。10张水解的尼龙 膜浸入20mL甲醛溶液(〉36.5wt.%)，加入0.2mL磷酸(85wt.%)，于60'C反应7 h， 40-50'C热水水洗多次。
(2) 将上述甲醛活化的尼龙膜，浸入10 mL质量分数为2%的壳聚糖溶液(以lvol，o醋 酸溶解)，室温反应lh,然后转入8(TC烘箱，lh后取出，分别用lvol，。醋酸和去 离子水洗去未反应的壳聚糖。尼龙膜上的壳聚糖含量可按茚三酮的方法进行测试。
以Reactive Red 120为配基的尼龙亲和膜的制备，具体步骤如下
上述经壳聚糖改性后的尼龙膜浸入浓度为10mg/mL的Reactive Red 120染料溶液中， 6(TC保温40min后，加入质量分数为20% NaCl溶液，恒温振荡反应30min，然后升高水 浴温度至8(TC，加入质量分数为25。/oNa2C03溶液，继续恒温振荡反应4h，分别用热的去 离子水，体积分数为10%的甲醇溶液，2mol/LNaCl溶液，6 mol/L尿素溶液和去离子水 充分洗涤，直到洗涤液呈无色为止，得到以Reactive Red 120为配基的尼龙亲和膜，保存 于双蒸水中。
利用尼龙亲和膜从木瓜粉溶液中分离纯化木瓜蛋白酶，具体步骤如下
15张尼龙亲和膜上叠成膜堆，放入膜桥，以蠕动泵送入缓冲液和洗脱液，首先以0.05 mol/LpH为8.5的Tris—HCl缓冲液平衡15 min，流速为1.0 mL/min，随后以蠕动泵送入 35 mL的10 mg/mL的木瓜粉溶液通过膜桥，然后以0.05 mol/LpH 8.5的Tris—HC1缓冲液 洗去未吸附上的蛋白质；最后以l mol/L的NaSCN的洗脱液(pH6.0)进行洗脱，得到目 标蛋白质木瓜蛋白酶。
以干酪素为底物的紫外分光光度法酶活的表征，具体步骤如下
取O.lmL的酶液，加入0.7mL 0.05 mol/L Tris—HC1缓冲液(pH 8.0)，再加入0.2mL 的木瓜蛋白酶激活剂(上述缓冲液内含0.5 mol/L的L—cysteine和0.02 mol/L的EDTA， pH8.0) 35。C保温恒定，加入同样预热的1% (W/V)酪蛋白溶液(上述缓冲液配制)lmL， 35。C反应15mim，加入3mL5。/。三氯乙酸(TCA)溶液终止反应(对照组实验先加TCA后 加底物)。静置，8000转/分离心20min，取滤液于280nm波长下比色。
权利要求
1. 一种尼龙亲和膜的制备方法，包括下列步骤(1)活化后的尼龙膜，浸入壳聚糖溶液中，室温反应后，80-90℃烘干，用1vol.％醋酸和去离子水冲，进行尼龙膜的改性；(2)经壳聚糖改性后的尼龙膜浸入Reactive Red 120染料溶液中，保温30-50min后，加入质量分数为15％～20％NaCl溶液，55℃～60℃恒温振荡反应30-50min，然后升高水浴温度，加入Na2CO3溶液，65℃～80℃继续恒温振荡反应4-5h，分别用热的去离子水、甲醇溶液、NaCl溶液、尿素溶液和去离子水充分洗涤，得以Reactive Red 120为配基的尼龙亲和膜。
2. 根据权利要求1所述的一种尼龙亲和膜的制备方法，其特征在于，所述的尼龙膜活化 是指尼龙膜在25-3(TC lmol/LHCl中水解后，用甲醛进行活化。
3. 根据权利要求1所述的一种尼龙亲和膜的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖溶液是 以lvol，c/。醋酸溶解的质量分数为2%的壳聚糖溶液。
4. 根据权利要求1所述的一种尼龙亲和膜的制备方法，其特征在于，所述的Reactive Red 120染料溶液浓度为5mg/mL 15mg/ mL。
5. 根据权利要求4所述的一种尼龙亲和膜的制备方法，其特征在于，所述的Reactive Red 120染料溶液浓度为8mg/ mL 12mg/ mL。
6. 根据权利要求1所述的一种尼龙亲和膜的制备方法，其特征在于，所述的Na2C03溶液 是指质量分数为15n/。 20c/。Na2CO3溶液。
7. 根据权利要求1所述的一种尼龙亲和膜的制备方法，其特征在于，所述的洗涤是分别 用热的去离子水、体积分数为10%甲醇溶液、2mol/LNaCl溶液、6mol/L尿素溶液和去 离子水充分洗涤。
8. 一种尼龙亲和膜的应用，其特征在于，尼龙亲和膜用于分离纯化木瓜蛋白酶。
9. 根据权利要求8所述的一种尼龙亲和膜的应用，其特征在于，尼龙亲和膜分离纯化木 瓜蛋白酶的方法包括Tris—HC1缓冲液中的木瓜粉，上样于以Reactive Red 120为配基的 尼龙亲和膜，Tris—HCl缓冲液冲洗后，用NaSCN溶液洗脱，得到木瓜蛋白酶；
10. 根据权利要求8所述的一种尼龙亲和膜的应用，其特征在于，所述的Tris—HCl缓冲 液是0.05M 1M pH 8.0 8.5的Tris—HCl缓冲液。
11. 根据权利要求9所述的一种尼龙亲和膜的应用，其特征在于，所述的Tris—HCl缓冲 液是0.05 M pH 8.5的Tris—HCl缓冲液。
12. 根据权利要求8所述的一种尼龙亲和膜的应用，其特征在于，所述的木瓜粉溶液是 10.0 15.0 mg/mL的木瓜粉溶液。
13.根据权利要求8所述的一种尼龙亲和膜的应用，其特征在于，所述的NaSCN溶液是 指1 mol/L pH 6.0的NaSCN溶液。
全文摘要
本发明公开了一种以Reactive Red 120为配基的尼龙亲和膜的制备方法及应用，制备方法包括如下步骤活化后的尼龙膜经壳聚糖改性后浸入Reactive Red 120染料中，反应后得到以Reactive Red 120为配基的尼龙亲和膜；将所制备的尼龙亲和膜应用于提纯木瓜蛋白酶，提纯方法不仅快速、简便，而且分离量大、提取的酶活性好、纯度高，与柱亲和色谱方法相比更适用于规模化纯化分离。
文档编号B01D71/00GK101380551SQ20081003498
公开日2009年3月11日 申请日期2008年3月21日 优先权日2008年3月21日
发明者朱利民, 聂华丽, 苏赛男, 陈天翔 申请人:东华大学