专利名称：：氧化硅-鱼精蛋白-pss杂化微胶囊及制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种氧化硅一鱼精蛋白-聚苯乙烯磺酸钠(PSS)杂化微胶囊及制备方法，属于高分子_无机杂化微胶囊的技术。
背景技术：
：高分子微胶囊是一种常用的固定化酶载体。常用的高分子材料包括聚赖氨酸、聚苯乙烯磺酸(PSS)等聚电解质。利用高分子微胶囊包埋酶具有条件温和、生物相容性好、有利于维持酶的结构完整性、进而提高酶的活性维持率的优点，特别是利用层层组装法制备高分子微胶囊可以对微胶囊的尺寸和囊壁厚度进行调控。F=A厶口fcfc、V+"Ai1々AAi古八7-'無口7V;SS"^RFItir/1,駄a!/a^力^nAA,、jnHK曰业田CT"培,+rt、'/F1rtjrfe/z;feti农!fZ;巾!i货口'J两'刀"-J城rtX裁tt间疋'Ki鹏巡币1于13:口'JIHJ魁疋dPT-f〃l、倶、yH恤/夂，PH)发生变化时，囊壁会变得疏松，因而造成酶分子的泄漏。解决酶泄漏的方法包括对微胶囊囊壁进行交联(热交联、紫外光照交联或化学试剂交联等)，使凝胶载体结构变得更加致密；增加囊壁层数；或是在微胶囊外表面构造无机壳层，制备有机一无机杂化微胶囊。氧化硅是有机一无机杂化材料中常见的无机组分，用于制备杂化微胶囊可以提高囊壁的稳定性，降低酶的泄漏率，提高酶对温度、pH变化的耐受性，同时提高储存和循环使用稳定性。仿生硅化为氧化硅材料的制备提供了一条新途径。自然界中的硅藻利用水中溶解的微量硅可形成坚硬的硅质细胞壁。研究表明，这类硅藻植物都是通过在有机质参与下的生物硅化作用来构建细胞壁的，即由一定的有机模板通过静电吸引作用促进和调控氧化硅的沉积。仿生硅化过程避免了酸碱催化剂的使用，所用原料均具有很好的生物相容性，适用范围广。
发明内容本发明的目的在于提供一种氧化硅一鱼精蛋白-聚苯乙烯磺酸钠(PSS)杂化微胶囊及制备方法，该微胶囊内固定着过氧化氢酶，对酶泄漏率低，抗高温和耐酸碱环境能力强，储存稳定性好，其制备方法过程简单。本发明是通过以下技术方案加以实现的，一种氧化硅一鱼精蛋白-聚苯乙烯磺酸钠杂化微胶囊，该微胶囊内固定着过氧化氢酶，它由表面层和表面层内的囊壁层构成，其特征在于表面层为氧化硅层，囊壁层为由内至外依次由鱼精蛋白层和聚苯乙烯磺酸钠层交替构成，其中鱼精蛋白层层位为奇数，聚苯乙烯磺酸钠层层位为偶数，外表层氧化硅层与囊壁层的鱼精蛋白层相结合。上述的氧化硅一鱼精蛋白-聚苯乙烯磺酸钠杂化微胶囊的制备方法，其特征在于包括以卜.过程:(1)将过氧化氢酶溶解于0.2-0.4mol/L的氯化钙溶液中，过氧化氢酶浓度为2-5mg/mL。按体积比1:1向上述溶液中加入0.2-0.4raol/L的碳酸钠溶液，以转速1000-1200r/min搅拌30-60s，静置10-15min，所得的碳酸钙沉淀用去离子水洗涤，得到含过氧化氢酶的碳酸钙颗粒。(2)将鱼精蛋白溶解于0.1-0.5mol/L的氯化钠溶液中，用盐酸或氢氧化钠调节其pH值为6.5-7.0，配制得到2-5mg/mL的鱼精蛋白溶液。(3)将聚苯乙烯磺酸钠(PSS)溶解于O.1-0.5mol/L的氯化钠溶液中，用盐酸或氢氧化钠调节其pH值为6.5-7.0，配制得到3-5mg/mL的聚苯乙烯磺酸钠溶液。(4)将硅酸钠溶解于去离子水中，用盐酸调节其pH值为6.5-7.0，配制得到30-50mmol/L的硅酸钠溶液。,c:、4^A:Tf為/U^船iVi比敏亡TF師ikA庄县古3fefrfcr森牲疋rS^、、'杰iVi乂+to宜:lt^fr一LU水1、u乂，乂。Ai平V!Hj^^两口'JW敗n柳Tl/m里兀双imTram口nT/lXW'JK4M、毛乂I:55X"Mj,y丄50—100，将步骤(1)制得的含过氧化氢酶的碳酸钙颗粒加入步骤(2)制得的鱼精蛋白溶液中，浸泡10-20min，离心分离，用去离子水洗涤，得到组装了第1层鱼精蛋白层的含过氧化氢酶的碳酸钙颗粒。(6)按含过氧化氢酶的碳酸钙颗粒质量克数与聚苯乙烯磺酸钠溶液的体积毫升数之比为1:50-100,将步骤(5)组装了第1层鱼精蛋白层的含过氧化氢酶的碳酸钙颗粒，分散于步骤(3)制得的聚苯乙烯磺酸钠溶液中，浸泡10-20min，离心分离，用去离子水洗涤，得到组装了第l层为鱼精蛋白层，第2层为聚苯乙烯磺酸钠层的双层囊壁层的含过氧化氢酶的碳酸钙颗粒。(7)将步骤(6)所制得的组装双层囊壁层的含过氧化氢酶的碳酸钙颗粒，按照歩骤(5)的过程进行，分散于鱼精蛋白溶液中，得到组装了第l层为鱼精蛋白层，第2层为聚苯乙烯磺酸钠层，第3层为鱼精蛋白层的3层囊壁层的含过氧化氢酶的碳酸钙颗粒。(8)将步骤(7)所制得的组装3层囊壁层的含过氧化氢酶的碳酸钙颗粒，按照歩骤(6)的过程进行，分散于聚苯乙烯磺酸钠溶液中，得到组装了第l层为鱼精蛋白层，第2层为聚苯乙烯磺酸钠层，第3层为鱼精蛋白层，第4层为聚苯乙烯磺酸钠层的4层囊壁层的含过氧化氢酶的碳酸钙颗粒，如此重复歩骤(5)和步骤(6)，得到组装了以鱼精蛋白层和聚苯乙烯磺酸钠层相互间隔的多层囊壁层的过氧化氢酶的碳酸钙颗粒，其中囊壁层的最外层为鱼精蛋白层。(9)按含过氧化氢酶的碳酸钙颗粒质量克数与硅酸钠溶液的体积毫升数之比为1:200-500，将歩骤(8)制得的组装了多层囊壁层的含过氧化氢酶的碳酸钙颗粒分散于歩骤(4)制得的硅酸钠溶液中，浸泡30-45min，离心分离，用去离子水洗涤，得到外表层为氧化硅层，囊壁层为鱼精蛋白层和聚苯乙烯磺酸钠层相互间隔的氧化硅-鱼精蛋白-聚苯乙烯磺酸钠杂化颗粒。(10)按含过氧化氢酶的碳酸钙颗粒质量克数与乙二胺四乙酸二钠溶液的体积毫升数之比为1:200-1:500，将步骤(9)制得的氧化硅-鱼精蛋白-聚苯乙烯磺酸钠杂化颗粒浸入浓度为O.1-0.2mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液中，浸泡1-2h，离心分离，得到囊内固定着过氧化氢酶的氧化硅-鱼精蛋白-聚苯乙烯磺酸钠杂化微胶囊。本发明提出的制备方法的优点在于制备条件温和，制备工艺简单易行，所得杂化载体对酶具有很好的固定能力，固定化过氧化氢酶的泄漏率低，对高温和酸碱耐受性能强，储存稳定性好。图i为实施例一制备的氧化硅-鱼精蛋白-pss杂化微胶囊和对比例一制备的鱼精蛋白-pss微胶囊固定的过氧化氢酶在不同pH值下相对酶活力曲线图。图中▲表示本发明微胶囊曲线图，一S—表示对比例微胶囊曲线图。图2为实施例一制备的氧化硅-鱼精蛋白-pss杂化微胶囊和对比例一制备的鱼精蛋白-pss微胶囊固定的过氧化氢酶在不同温度下相对酶活力曲线图。图中一A—表示本发明微胶囊曲线图，一參一表示对比例微胶囊曲线图。图3为本发明实施例二制备的氧化硅-鱼精蛋白-pss杂化微胶囊的扫描电子显微镜照片，囊壁层由内至外第1，3，5层为鱼精蛋白层，2，4层为聚苯乙烯磺酸钠层，外表层为氧化硅层。图4为比例二制备的微胶囊的扫描电子显微镜照片，其中囊壁层由内至外第l，3，5层为鱼精蛋白层，2，4，6层为聚苯乙烯磺酸钠层，无氧化硅外表层。具体实施方式实施例一将鱼精蛋白溶解于0.lmol/L的氯化钠溶液中，用盐酸或氢氧化钠调节其pH值为7.0，5mg/mL的鱼精蛋白溶液；将聚苯乙烯磺酸钠溶解于0.lmol/L的氯化钠溶液中，用盐酸或氢氧化钠调节其pH值为7.0，得到5mg/mL的聚苯乙烯磺酸钠溶液；将硅酸钠溶解于去离子水中，用盐酸调节其pH值为7.0，得到30mmol/L的硅酸钠溶液。准确称取60mg过氧化氢酶溶解于12mL0.2mol/L氯化钙溶液中，得到5mg/mL过氧化氢酶溶液，向上述混合液中加入12mL0.2mol/L的碳酸钠溶液，以转速1000r/min搅拌30s，静置10min，所得碳酸钙沉淀用去离子水洗涤，得到含过氧化氢酶的碳酸钙颗粒。将含过氧化氢酶的碳酸钙颗粒分散于24mL浓度为5mg/mL的鱼精蛋白溶液中，浸泡10min，离心分离，用去离子水洗涤2次，得到组装了一层鱼精蛋白层的碳酸钙颗粒；将组装了一个鱼精蛋白层的碳酸钙颗粒分散于24mL浓度为5mg/mL的聚苯乙烯磺酸钠溶液中，浸泡10min，离心分离，用去离子水洗涤2次，得到组装了内层为鱼精蛋白层、外层为聚苯乙烯磺酸钠层的双层囊壁层的碳酸钙颗粒。重复上述以鱼精蛋白溶液和聚苯乙烯磺酸钠溶液交替浸泡的过程，可得到组装了以鱼精蛋白层和聚苯乙烯磺酸钠层相互间隔的2-6个双层的含过氧化氢酶的碳酸钙颗粒。将以上不同层数的颗粒分别分散于24mL浓度为5mg/mL的鱼精蛋白溶液中，浸泡10min，离心分离，用去离子水洗涤2次后分散于120mL浓度为30mmol/LpH7.0的硅酸钠溶液中，浸泡45min，离心分离，用去离子水洗涤2次，得到最外层为氧化硅，内部为鱼精蛋白层和聚苯乙烯磺酸钠层相互间隔的氧化硅-鱼精蛋白-聚苯乙烯磺酸钠杂化颗粒。将氧化硅-鱼精蛋白-聚苯乙烯磺酸钠杂化的含过氧化氢酶的碳酸钙颗粒浸泡于120mL浓度0.lmol/L的乙二胺四乙酸二钠溶液中，浸泡lh，离心分离，得到中空的氧化硅-鱼精蛋白-聚苯乙烯磺酸钠杂化微胶囊。测定微胶囊固定化过氧化氢酶的泄漏率将固定化过氧化氢酶的微胶囊分别浸泡于PH3.0-pHll.O磷酸盐缓冲溶液中15h，分别控制浸泡温度为25-70°C。采用考马斯亮兰法(Bradford法)检测溶液中过氧化氢酶的含量，得到固定化过氧化氢酶的泄漏率。测定微胶囊固定化过氧化氢酶的相对酶活力将30%过氧化氢溶液用0.05mol/L不同pH值的磷酸盐缓冲溶液稀释，得到浓度为0.01mol/L的过氧化氢溶液。向过氧化氢溶液中加入固定化过氧化氢酶的微胶囊，在37'C下进行过氧化氢分解反应，用紫外一可见分光光度计确定过氧化氢的消耗量，并以最适pH条件下测得的固定化过氧化氢酶的酶活力为基准，计算得到固定化过氧化氢酶的相对酶活力。将30%过氧化氢溶液用0.05mol/LpH7.0的磷酸盐缓冲溶液稀释，得到浓度为0.01mol/L的过氧化氢溶液。向过氧化氢溶液中加入固定化过氧化氢酶的微胶囊，在不同温度下进行过氧化氢分解反应，用紫外一可见分光光度计确定过氧化氢的消耗量，并以最适温度条件下测得的固定化过氧化氢酶的酶活力为基准，计算得到固定化过氧化氢酶的相对酶活力。测定微胶囊固定化过氧化氢酶的储存稳定性将30%过氧化氢溶液用0.05mol/LpH7.0磷酸盐缓冲溶液稀释，得到浓度为0.01mol/L的过氧化氢溶液。向过氧化氢溶液中加入固定化过氧化氢酶微胶囊，在37'C下进行过氧化氢分解反应，用紫外一可见分光光度计确定过氧化氢的消耗量，得到固定化过氧化氢酶的初始酶活力。将固定化过氧化氢酶微胶囊分别存放l天、3天、6天、10天、15天、21天后，重复上述反应过程，得到固定化过氧化氢酶酶的酶活力，以初始酶活力为基准，计算得到相对酶活力。对比例一将鱼精蛋白溶解于0.lmol/L的氯化钠溶液中，用盐酸或氢氧化钠调节其pH值为7.0，5mg/mL的鱼精蛋白溶液；将聚苯乙烯磺酸钠溶解于0.lmol/L的氯化钠溶液中，用盐酸或氢氧化钠调节其pH值为7.0，得到5mg/mL的PSS溶液。准确称取60mg氧化氢酶溶解于12mL0.2mol/L氯化钙溶液中，得到5mg/mL过氧化氢酶溶液，向上述混合液中迅速倾倒入12mL0.2mol/L的碳酸钠溶液，剧烈搅拌30s，静置10min，所得碳酸钙沉淀用去离子水洗涤，得到含过氧化氢酶的碳酸钙颗粒。将含过氧化氢酶的碳酸钙颗粒分散于24mL浓度为5mg/mL的鱼精蛋白溶液中，浸泡lOmin，离心分离，用去离子水洗涤2次，得到组装了一层鱼精蛋白层的碳酸钙颗粒；将组装了一层鱼精蛋白层的碳酸钙颗粒分散于24mL浓度为5mg/mL的聚苯乙烯磺酸钠溶液中，浸泡10min，离心分离，用去离子水洗涤2次，得到组装了内层为鱼精蛋白层、外层为聚苯乙烯磺酸钠层的双层囊壁层的碳酸钙颗粒。重复上述以鱼精蛋白溶液和聚苯乙烯磺酸钠溶液交替浸泡的过程，可得到组装了以鱼精蛋白层和聚苯乙烯磺酸钠层相互间隔的2-6个双层的含过氧化氢酶的碳酸钙颗粒。将以上颗粒溶解于120mL浓度0.1mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液中，得到2至6个双层的中空鱼精蛋白-聚苯乙烯磺酸钠高分子微胶囊。按照实施例一中的方法测定鱼精蛋白-聚苯乙烯磺酸钠高分子微胶囊固定化过氧化氢酶的泄漏率、不同温度和pH值下的相对酶活力以及储存稳定性。实施例二本实施例与实施例一过程相同，只是改变其中的将过氧化氢酶用量变为24mg,相应的过氧化氢瞎浓度变为2mg/mL。将氯化钙和碳酸钠的浓度均变为0.4mol/L，将搅拌速度变为1200r/min，将搅拌时间变为60s，将静置时间变为15min。将鱼精蛋白溶液浓度变为2mg/mL，聚苯乙烯磺酸钠溶液浓度变为3mg/mL，在鱼精蛋白和聚苯乙烯磺酸钠溶液中的浸泡时间均变为15min。硅酸钠溶液pH值变为6.5和浓度变为50mmol/L，所用硅酸钠溶液体积变为48mL，在硅酸钠溶液中的浸泡时间变为30min。乙二胺四乙酸二钠溶液的浓度变为0.2mol/L,浸泡时间变为2h。对比例二本实施例与实施例一过程相同，只是改变其中的将过氧化氢酶用量变为24mg,相应的过氧化氢酶浓度变为2mg/mL。将氯化钙和碳酸钠的浓度均变为0.4mol/L，将搅拌速度变为1200r/min，将搅拌时间变为60s，将静置时间变为15rain。将鱼精蛋白溶液浓度变力2mg/mL，聚苯乙烯磺酸钠溶液浓度变为3mg/mL，在鱼精蛋白和聚苯乙烯磺酸钠中的浸泡时间均变为15min。乙二胺四乙酸二钠溶液的浓度变为0.2mol/L，浸泡时间变为2h。表1所示为实施例一和对比例一测定的不同层数氧化硅一鱼精蛋白-PSS杂化微胶囊与鱼精蛋白-PSS高分子微胶囊固定化过氧化氢酶的泄漏率对比结果。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表2所示为实施例一和对比例一测定的氧化硅一鱼精蛋白-PSS杂化微胶囊与鱼精蛋白-PSS高分子微胶囊固定化过氧化氢酶在不同pH值下的泄漏率对比结果。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表3所示为实施例一和对比例一测定的氧化硅一鱼精蛋白-PSS杂化微胶囊与鱼精蛋白-PSS高分子微胶囊固定化过氧化氢酶在不同温度下的泄漏率对比结果。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表4所示为实施例一和对比例一测定的氧化硅一鱼精蛋白-PSS杂化微胶囊与鱼精蛋白-PSS高分子微胶囊固定化过氧化氢酶储存21天过程中酶活力的对比结果。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>权利要求1.一种氧化硅—鱼精蛋白-聚苯乙烯磺酸钠杂化微胶囊，该微胶囊内固定着过氧化氢酶，它由表面层和表面层内的囊壁层构成，其特征在于，表面层为氧化硅层，囊壁层为由内至外依次由鱼精蛋白层和聚苯乙烯磺酸钠层交替构成，其中鱼精蛋白层层位为奇数，聚苯乙烯磺酸钠层层位为偶数，外表层氧化硅层与囊壁层的鱼精蛋白层相结合。2.—种权利要求1所述的氧化硅一鱼精蛋白-聚苯乙烯磺酸钠杂化微胶囊的制备方法，其特征在于包括以下过程(1)将过氧化氢酶溶解于0.2-0.4mol/L的氯化钙溶液中，过氧化氢酶浓度为2-5mg/mL，按体积比1:1向上述溶液中加入0.2-0.4mol/L的碳酸钠溶液，以转速1000-1200r/min搅拌30-60s，静置10-15min，所得的碳酸钙沉淀用去离子水洗涤，得到含过氧化氢酶的碳酸钙颗粒；(2)将鱼精蛋白溶解于0.1-0.5mol/L的氯化钠溶液中，用盐酸或氢氧化钠调节其pH值为6.5-7.0，配制得到2-5mg/mL的鱼精蛋白溶液；(3)将聚苯乙烯磺酸钠溶解于0.1-0.5mol/L的氯化钠溶液中，用盐酸或氢氧化钠调节其pH值为6.5-7.0，配制得到3-5mg/mL的聚苯乙烯磺酸钠溶液；(4)将硅酸钠溶解于去离子水中，用盐酸调节其pH值为6.5-7.0，配制得到30-50mmol/L的硅酸钠溶液；(5)按含过氧化氢酶的碳酸钙颗粒质量克数与鱼精蛋白溶液的体积毫升数之比为1:50—100，将步骤(1)制得的含过氧化氢酶的碳酸钙颗粒加入步骤(2)制得的鱼精蛋白溶液中，浸泡10-20min，离心分离，用去离子水洗涤，得到组装了第1层鱼精蛋白层的含过氧化氢酶的碳酸钙颗粒；(6)按含过氧化氢酶的碳酸钙颗粒质量克数与聚苯乙烯磺酸钠溶液的体积毫升数之比为1:50-100，将步骤(5)组装了第1层鱼精蛋白层的含过氧化氢酶的碳酸钙颗粒，分散于步骤(3)制得的聚苯乙烯磺酸钠溶液中，浸泡10-20min，离心分离，用去离子水洗涤，得到组装了第l层为鱼精蛋白层，第2层为聚苯乙烯磺酸钠层的双层囊壁层的含过氧化氢酶的碳酸钙颗粒；(7)将步骤(6)所制得的组装双层囊壁层的含过氧化氢酶的碳酸钙颗粒，按照步骤(5)的过程进行，分散于鱼精蛋白溶液中，得到组装了第l层为鱼精蛋白层，第2层为聚苯乙烯磺酸钠层，第3层为鱼精蛋白层的3层囊壁层的含过氧化氢酶的碳酸钙颗粒；(8)将歩骤(7)所制得的组装3层囊壁层的含过氧化氢酶的碳酸钙颗粒，按照歩骤(6)的过程进行，分散于聚苯乙烯磺酸钠溶液中，得到组装了第l层为鱼精蛋白层，第2层为聚苯乙烯磺酸钠层，第3层为鱼精蛋白层，第4层为聚苯乙烯磺酸钠层的4层囊壁层的含过氧化氢酶的碳酸钙颗粒，如此重复步骤(5)和歩骤(6)，得到组装了以鱼精蛋白层和聚苯乙烯磺酸钠层相互间隔的多层囊壁层的过氧化氢酶的碳酸钙颗粒，其中囊壁层的最外层为鱼精蛋白层；(9)按含过氧化氢酶的碳酸钙颗粒质量克数与硅酸钠溶液的体积毫升数之比为1:200-500，将步骤(8)制得的组装了多层囊壁层的含过氧化氢酶的碳酸钙颗粒分散于步骤(4)制得的硅酸钠溶液中，浸泡30-45min，离心分离，用去离子水洗涤，得到外表层为氧化硅层，囊壁层为鱼精蛋白层和聚苯乙烯磺酸钠层相互间隔的氧化硅-鱼精蛋白-聚苯乙烯磺酸钠杂化颗粒；(10)按含过氧化氢酶的碳酸钙颗粒质量克数与乙二胺四乙酸二钠溶液的体积毫升数之比为1:200-1:500，将歩骤(9)制得的氧化硅-鱼精蛋白-聚苯乙烯磺酸钠杂化颗粒浸入浓度为O.l-0.2mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液中，浸泡1-2h，离心分离，得到囊内固定着过氧化氢酶的氧化硅-鱼精蛋白-聚苯乙烯磺酸钠杂化微胶囊。全文摘要本发明公开了一种氧化硅-鱼精蛋白-聚苯乙烯磺酸钠杂化微胶囊及制备方法。该微胶囊由表面的氧化硅层和囊壁层构成，其中囊壁层为由内至外依次由鱼精蛋白层与聚苯乙烯磺酸钠层相间排列组成。其制备方法包括鱼精蛋白溶液、聚苯乙烯磺酸钠溶液、硅酸钠溶液的配制，含过氧化氢酶的碳酸钙颗粒的制备，在含过氧化氢酶的碳酸钙颗粒表面组装鱼精蛋白层和聚苯乙烯磺酸钠层，在囊壁表面形成氧化硅层，碳酸钙颗粒溶解后得到囊内固定着过氧化氢酶的氧化硅-鱼精蛋白-聚苯乙烯磺酸钠杂化微胶。本发明的优点在于，工艺过程简单，制得的微胶囊对过氧化氢酶的泄漏率低，抗高温和耐酸碱环境能力强，储存稳定性好。文档编号B01J13/02GK101429503SQ20081015373公开日2009年5月13日申请日期2008年12月4日优先权日2008年12月4日发明者洪吴,姜忠义,健李申请人:天津大学