专利名称：多球壳菌素粗品的化学分离纯化方法
技术领域：
本发明涉及多球壳菌素粗品的分离纯化方法，特别涉及多球壳菌素粗 品的化学分离纯化方法。
背景技术：
多球壳菌素具有多种药理作用。Fujita等研究显示，多球壳菌素具有 显著的双向免疫调节作用，能阻断白介素-2受体以下的途径，抑制丝氨酸 棕榈酰转移酶活性，从而特异性抑制T细胞的增殖。另外，Hojjati等报道 多球壳菌素可抑制动脉粥样硬化形成，利用多球壳菌素抑制鞘脂类合成的 关键酶——丝氨酸棕榈酰转移酶的机理，连续60天对8周龄的动脉粥样硬化 的大鼠每隔一天注射浓度为O. 3mg/kg多球壳菌素，结果显示多球壳菌素对 鞘脂类的合成有明显的抑制作用，该大鼠动脉硬化损伤面积明显减少，因 此，多球壳菌素抑制丝氨酸棕榈酰转移酶活性可能作为治疗动脉粥样硬化 的一个选择。基于多球壳菌素的药理价值及临床应用前景，制备医药工业 所需的高纯度多球壳菌素具有重要意义。多球壳菌素内酯也具有与多球壳 菌素相似药理作用。
目前关于多球壳菌素分离纯化方法的报道都不是采用化学分离纯化方法,Fujita等(Fungal metabolites. Part 11. A potent immunosuppressive activity found in/s<ar/a w'"c/"z'n7 metabolite. Fujita T, et al. J. Antibiotics, 1994， 47(2): 208 215)采用免疫抑制细胞模型活性跟踪，通过联用大孔吸附树 脂和制备薄层色谱分离纯化获得多球壳菌素。Kluepfel等(Myriocin,anew antifimgal antibiotic from A^Wococc a/6o附少ces. Kluepfel D， a/. Journal of Antibiotics, 25: 109 115, 1972)以水-甲醇-二氯甲烷采取液液萃取结晶 工艺纯化多球壳菌素；该方法工艺简单，然而得率低，重复性差，操作技 术难度大。这些方法不足之处在于不适宜工业化。目前关于多球壳菌素内 酯制备方法的报道中，文献(Fungal metabolites. Part 12. Potent immunosuppressant, 14-deoxomyriocin, (2S，3R,4R)-(E)-2-amino-3 ，4-dihydroxy-2-hydroxymethyleicos—6—enoic acid and structure—activity relationships of myriocin derivatives. Fujita & a/. Journal of Antibiotics, 47: 216^~224, 1994) 提供了一种以多球壳菌素甲醇溶液与氯化氢甲醇溶液反应，反应物以硅胶 为色谱介质，以氯仿-甲醇为洗脱剂洗脱，随后以氯仿-石油醚结晶，制备 多球壳菌素内酯单体的方法。如将该方法用于分离纯化多球壳菌素粗品是 不可行的，因为该方法是采用多球壳菌素单体制备多球壳菌素内酯，需先 制备多球壳菌素单体。目前还没有使用化学方法进行分离纯化多球壳菌素 粗品的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种能简化产品后续纯化流程、提高得率、降低
5能耗、适合工业化的多球壳菌素粗品的化学分离纯化方法。
本发明采用的技术方案如下多球壳菌素粗品的分离纯化方法，包括 以下步骤
(1 )取多球壳菌素重量含量是2 50%的多球壳菌素粗品用无水乙醇 溶解后硅胶柱色谱分离，用溶剂A与酸催化剂的混合溶液洗脱，收集多 球壳菌素内酯馏分；其中所述溶剂A与酸催化剂的体积比为6 12. 5 : 0.2 1.5;所述溶剂A是选自乙酸乙酯、丙酮、无水乙醇、甲醇、正丁 醇中的一种或多种按任意比例组成的溶剂，所述酸催化剂是甲酸或乙酸 中的一种；
(2) 将步骤(1)所得的多球壳菌素内酯馏分蒸干，剩余物用溶剂B 结晶，收集晶体，得多球壳菌素内酯单体；其中所述溶剂B是选自乙醇、 甲醇、水中的一种或多种按任意比例组成的溶剂；
(3) 取多球壳菌内酯单体置于碱和水中形成反应体系，多球壳菌素 内酯单体在碱性条件下与水完全反应，得到多球壳菌素溶液，然后将该
溶液蒸干得剩余物即为分离纯化的多球壳菌素单体；其中所述碱是吡啶 或氨水中的一种。
其中步骤(1)所述多球壳菌素重量含量是2 50%的多球壳菌素粗品， 是指凡是含有多球壳菌素的各种制品，其中多球壳菌素单体的百分含量(重 量)范围是2 50%。如蝉花免疫抑制活性有效部位ISP提取物，采用申 请号2007100786688的中国发明专利"蝉花免疫抑制活性有效部位ISP提取物的提取分离方法"提供的方法制备。本发明所述的分离纯化方法适合
于含量在2 50%多球壳菌素的粗品，所以在分离之前应对样品中多球壳菌 素的含量进行初步分析估测。多球壳菌素粗品中多球壳菌素含量初步分析 方法可采用文献(固相萃取结合HPLC测定蝉花菌丝体中多球壳菌素的含 量，余佳文等，中国药学杂志，43: 1191-1193， 2008年)提供的高效液相 色谱法进行测定。
其中步骤(1)所述溶剂A与酸催化剂的混合溶液优选的配制是乙酸 乙酯、无水乙醇、甲酸，按体积比5. 5 8. 5 : 0. 5 4. 0 : 0. 5 1. 5进行配
制，最好是乙酸乙酯、无水乙醇、甲酸按体积比7 : 3 : l进行配制。
其中步骤(2)所述溶剂B优选乙醇和水按体积比比10 20 : 1 5进
行配制。
其中步骤(3)中所加的碱和水必须足量，所加碱的量需完全溶解多球 壳菌素内酯，所加水与多球壳菌素内酯的摩尔比必须大于3倍，使多球壳 菌素内酯单体完全反应，否则影响得率和产品纯度。
其中步骤(3)中所加的碱优选吡啶。
为了证实多球壳菌素粗品经过本发明所述技术方案处理后得到的是多 球壳菌素单体，做了下述实验-
1、称取步骤(3)所得的剩余物约5mg，用lOmL甲醇溶解，进行高 效液相色谱分析。采用2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)，包括2996 二极管阵列检测器、在线脱气机、自动进样器、柱温箱；色谱柱为InertsilODS-3 (GL Sciences Inc., 4.6mmx250mm， 5 |im)，柱温35。C， ？荒动相 为乙腈/水(75:25， V/V，经0.45pm微孔滤膜抽滤)，流速1.0mL/min， 进样量10 ^L，检测波长为201 nm。结果见附图1，可见在保留时间为10.1 min出现一个峰，峰形良好(保留时间约3min的峰为溶剂峰)。对此峰用 二极管阵列检测器进行光谱图分析及用Waters色谱工作站软件进行纯度检 查，结果显示该峰是单一峰，且为末端吸收。
2、 称取步骤(3)所得的剩余物约2mg，再加入干燥KBr粉末约200 mg，在玛瑙研钵中充分研细，装入压片机压成透明薄片，再放入红外分光 光度计中进行扫描，扫描范围400 4 000 cm"，所得红外光谱图在3 440.8、 2 958.6、 2 929.7、 1 666.4、 1 537.2、 1 450.4、 1 384.8、 1 082.0 cm-1处有较 3虽口及收,与文献(Myriocin, a new antifungal antibiotic from Afyn.ococcwm a/6ow少ces. Kluepfel D, Journal of Antibiotics, 25: 109 115， 1972)报道 的多球壳菌素单体红外光谱图一致。
3、 称取步骤(3)所得的剩余物约5mg，用10 mL甲醇溶解，取2 注入质谱仪进行质谱分析，选用ABI Q TRAP质谱仪(美国应用生物系 统公司)，扫描范围m/z为100 800，在ESI负离子全扫描方式下，主要 生成[M-H]—的准分子离子峰，得其(M-H)为400.3，分子量为401，与 多球壳菌素单体的理论值相同。
综合上述高效液相色谱分析结果、红外光谱分析结果、质谱分析结果 等数据，可判定所分析成分步骤(3)所得剩余物为多球壳菌素单体。
8本发明是通过反应分离耦合技术实现的将待分离纯化的多球壳菌素 的粗品在存在色谱介质、酸催化剂和溶剂的条件下，将化学反应与分离过 程耦合，得到多球壳菌素内酯，再碱化多球壳菌素内酯得到纯化的多球壳 菌素单体。整个过程发生的化学反应示意图见附图2。
利用本发明的原理还可以利用多球壳菌素粗品制备多球壳菌素内酯单 体，而现有技术常规是用多球壳菌素单体制备多球壳菌素内酯单体。
本发明的有益效果是采用化学的方式对多球壳菌素粗品进行分离纯 化，并且将化学反应与分离耦合在一起，同时进行。将性质相近的混合物 中的目标化合物衍生化为性质不同的新物质，同时将新物质从复杂体系中 分离纯化出来。这样大大简化了产品后续纯化流程，提高得率，降低能耗， 减少投资，适合工业化生产。
图1多球壳菌素单体HPLC图
图2本发明的所涉及的化学反应示意图 具体实施例(共2例) 实施例l
(1)取150克100 150目硅胶，用乙酸乙酯拌匀后装柱，用乙酸乙
酯/无水乙醇/甲酸(7:3: i，v/v)淋洗并平衡色谱柱，备用。取多球壳菌
素含量约10%的粗品500毫克用无水乙醇使其溶解，搅拌均匀使样品充分
吸附于5克硅胶上，后挥干溶剂，上柱；用乙酸乙酯/无水乙醇/甲酸(7 :
3:i，v/v)洗脱，通过薄层色谱跟踪，收集多球壳菌素内酯馏分。薄层色谱是将步骤(1)的洗脱液用内径0.5 mm的毛细管在硅胶GF254 薄层板上点样，样点干燥后放入密闭的层析缸中展开，展开剂为氯仿/甲醇 /水(65 : 30 : 5， V/V)。展开后挥干溶剂用质量浓度2%的茚三酮乙醇溶液 喷雾后于105 110 "C烘箱加热显色。
(2) 通过上述步骤获得的多球壳菌素内酯馏分，蒸干溶剂，加入温度 是75 。C的乙醇，制得多球壳菌素内酯饱和溶液，冷却至O 'C结晶，收集 晶体，得多球壳菌素内酯单体约10 mg。
(3) 取所得多球壳菌素内酯单体，加吡啶和水，体积分别是IO mL、 2 mL，回流2小时，蒸干溶液，得到的剩余物即是多球壳菌素单体。 实施例2
(1) 取1.5千克80 100目硅胶，装柱，用乙酸乙酯/甲酸(6 : 0. 2,V/V) 淋洗并平衡色谱柱，备用。取多球壳菌素含量约5%的粗品3. 5克用无水乙 醇使其溶解，搅拌均匀使样品充分吸附于30克硅胶上，后挥千溶剂，上柱; 用乙酸乙酯/甲酸(6 : 0.2， V/V)洗脱，通过薄层色谱跟踪，收集多球壳菌 素内酯馏分。
薄层色谱是将步骤(1)的洗脱液用内径0.5 mm的毛细管在硅胶GF254 薄层板上点样，样点干燥后放入密闭的层析缸中展开，展开剂为氯仿/甲醇 /水(65 : 30 : 5， V/V)。展开后挥干溶剂用质量浓度1%的茚三酮乙醇溶液 喷雾后于105 110 'C烘箱加热显色。
(2) 通过上述步骤获得的多球壳菌素内酯馏分，蒸干溶剂，加入80 °C的质量百分比浓度分别是50%、 30%的乙醇和甲醇按体积比1: 1配制的混 和溶液，制得多球壳菌素内酯饱和溶液，冷却至4"C结晶，收集晶体，得 多球壳菌素内酯单体约40 mg。
(3)取所得多球壳菌素内酯单体，加吡啶和水，体积分别是20mU 60mL，回流2小时，蒸干吡啶和水溶液，得到的剩余物即是多球壳菌素单 体。
实施例3
(1) 取3千克80 100目硅胶，装柱，用乙酸乙酯/无水乙醇/正丁醇
/乙酸(8 : 2 : 2.5 : i. 5， v/v)淋洗并平衡色谱柱，备用。取多球壳菌素含
量约20%的粗品4克用无水乙醇使其溶解，搅拌均匀使样品充分吸附于50
克硅胶上，后挥干溶剂，上柱；用乙酸乙酯/无水乙醇/正丁醇/乙酸(8 : 2 :
2.5 : 1.5，V/V)洗脱，通过薄层色谱跟踪，收集多球壳菌素内酯馏分。
薄层色谱是将步骤(1)的洗脱液用内径0.5 mm的毛细管在硅胶GF254 薄层板上点样，样点干燥后放入密闭的层析缸中展开，展开剂为氯仿/甲醇 /水(65 : 30 : 5， V/V)。展开后挥干溶剂用质量浓度1%的茚三酮乙醇溶液 喷雾后于105 110 'C烘箱加热显色。
(2) 通过上述步骤获得的多球壳菌素内酯馏分，蒸干溶剂，加入温度 是80'C、质量百分比浓度是30%的甲醇溶液，制得多球壳菌素内酯饱和溶 液，冷却至室温结晶，收集晶体，得多球壳菌素内酯单体约300 mg。
(3) 取所得多球壳菌素内酯单体，加吡啶和水，体积分别是5 mL、50mL，回流2小时，蒸干吡啶和水溶液，得到的剩余物即是多球壳菌素单 体。
权利要求
1、一种多球壳菌素粗品的化学分离纯化方法，包括以下步骤(1)取多球壳菌素重量含量是2～50％的多球壳菌素粗品用无水乙醇溶解后硅胶柱色谱分离，用溶剂A与酸催化剂的混合溶液洗脱，收集多球壳菌素内酯馏分；其中所述溶剂A与酸催化剂的体积比为6～12.5∶0.2～1.5；所述溶剂A是选自乙酸乙酯、丙酮、无水乙醇、甲醇、正丁醇中的一种或多种按任意比例组成的溶剂，所述酸催化剂是甲酸或乙酸中的一种；(2)将步骤(1)所得的多球壳菌素内酯馏分蒸干，剩余物用溶剂B结晶，收集晶体，得多球壳菌素内酯单体；其中所述溶剂B是选自乙醇、甲醇、水中的一种或多种按任意比例组成的溶剂；(3)取多球壳菌内酯单体置于碱和水中形成反应体系，多球壳菌素内酯单体在碱性条件下与水完全反应，得到多球壳菌素溶液，然后将该溶液蒸干得剩余物即为分离纯化的多球壳菌素单体；其中所述碱是吡啶或氨水中的一种。
2、 如权利要求l所述的多球壳菌素粗品的化学分离纯化方法，其中步 骤(1)所述溶剂A与酸催化剂的混合溶液是乙酸乙酯、无水乙醇、甲酸按 体积比5. 5 8. 5 : 0. 5 4. 0 : 0. 5 1. 5进行配制的。
3、 如权利要求2所述的多球壳菌素粗品的化学分离纯化方法，其中步骤(1)所述溶剂A与酸催化剂的混合溶液是乙酸乙酯、无水乙醇、甲酸按体积比7 : 3 : l进行配制的。
4、如权利要求i所述的多球壳菌素粗品的化学分离纯化方法，其中步骤(2)所述溶剂B由乙醇和水按体积比10 20 : 1 5进行配制的。
全文摘要
本发明提供了一种多球壳菌素粗品的化学分离纯化方法，在存在色谱介质、酸催化剂和由乙酸乙酯、丙酮、无水乙醇、甲醇、正丁醇中的一种或多种按任意比例组成的溶剂的条件下，将化学反应与分离过程进行耦合，多球壳菌素的粗品中的多球壳菌素衍生化为多球壳菌素内酯，再碱化多球壳菌素内酯得到纯化的多球壳菌素单体。将化学反应与分离耦合在一起，两者同时进行，这就大大简化了产品后续纯化流程，提高得率，降低能耗，减少投资，适合工业化生产。
文档编号B01D15/34GK101503368SQ200910103398
公开日2009年8月12日 申请日期2009年3月17日 优先权日2009年3月17日
发明者余佳文, 徐红娟, 朱华李, 毛先兵, 钟国跃, 陈仕江, 马开森 申请人:重庆市中药研究院