专利名称：一种口蹄疫油乳剂灭活疫苗的破乳方法
技术领域：
本发明涉及口蹄疫疫苗质量检测技术中的一个关键步骤，具体为一种口蹄疫油乳剂灭活疫苗的破乳方法。
背景技术：
口蹄疫(foot and mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)引起偶蹄类动物感染的一种急性、烈性、接触性传染病，主要危害猪、 牛、羊等70种家畜和野生动物，人也易感，对畜牧业危害极大。口蹄疫病毒属RNA病毒，由 4种结构蛋白(VP1、VP2、VP3和VP4)和7种非结构蛋白组成，呈二十面体。完整病毒颗粒的离心沉降系数为146S。通常，人们认为用完整的病毒颗粒(即146S抗原)制备的疫苗效果最好。国内常用的口蹄疫灭活疫苗的制作过程是将灭活病毒与佐剂(常用法国ISA 206 佐剂)混合制成较复杂的双相乳剂疫苗(水/油/水)。现有的疫苗质量标准中规定效力检验必须采用本动物进行检验，由于国家实行100%的强化免疫政策，很难选出易感的检验用动物，而且动物攻毒对实验设施要求高 (BSL3级实验室)、耗时长(一个月以上)、资金花费大。如果采用血清中和试验选择易感动物，在技术上难以排除具有细胞免疫的非易感动物，在检验实际中经常发生检验数据不规律的问题，影响检验的准确性。因此口蹄疫疫苗尤其是用于牛的疫苗的质量检测一直困扰着兽药监测部门和相关生产企业。因此需要尽快研制体外检验技术，代替现有的本动物试验。许多试验证明，146S抗原的含量与疫苗的免疫效果有很好的相关性。如果能发明一种油乳剂分离技术即破乳技术，使商品口蹄疫疫苗中的146S抗原重新分布到水相，且不破坏病毒的完整性，这样就可以通过检测破乳后水相中146S抗原的含量确定疫苗的质量， 同时也方便兽药监察部门对市场上各个厂家的口蹄疫疫苗质量进行实时监控。
发明内容
本发明旨在提供一种口蹄疫油乳剂灭活疫苗的破乳方法，该方法简便快速，破乳后146S抗原重新分布到水相，同时可保证口蹄疫病毒粒子的稳定性，并且水相中146S抗原含量与原疫苗中的146S抗原含量具有高度相关性。本发明提供的口蹄疫油乳剂灭活疫苗的破乳方法如下采用破乳剂与口蹄疫油乳剂灭活疫苗充分混勻，静置，使油、水分层，使口蹄疫病毒粒子分布到水相。较佳地，所述破乳剂选自下列有机溶剂的任意一种苯甲醇、正戊醇、氯仿、正己较佳地，所述口蹄疫油乳剂灭活疫苗与所述破乳剂按1 0. 06 0. 2的体积比混勻。较佳地，所述静置过程在分液漏斗中进行。
较佳地，所述静置过程的温度设置为4°C、时间设定为30分钟以上。进一步地，分离出含有146S抗原的水相层。对于破乳后所得水相层中的146S抗原，可采用密度梯度离心法进行检测。本发明的优点在于⑴本发明所述方法简便迅速，可在30分钟内完成；(2) 抗原分离效果好，同时可保证口蹄疫病毒粒子的稳定性；(3)破乳后分离出的水相中的 146S抗原含量可以采用密度梯度离心法进行检测；(4)破乳后水相中抗原回收率高，达 70% -95% ； (5)破乳后水相中的146S抗原含量与原疫苗中的146S抗原含量有很高相关性；(6)适用于对ISA206佐剂乳化的商品口蹄疫疫苗进行破乳，进而对水相中的完整病毒粒子进行定量，从而评价商品口蹄疫疫苗的质量。综上所述，本发明所述方法特别适合作为口蹄疫疫苗生产企业和国家质量检测部门对商品口蹄疫疫苗进行质量监测的方法。
具体实施例方式实施例一口蹄疫油乳剂灭活疫苗的破乳方法取100ml ISA 206佐剂乳化的商品口蹄疫疫苗，放入250ml分液漏斗中，加入6 20ml破乳剂正戊醇(或者选用苯甲醇、氯仿、正己醇中的任意一种)，充分混悬1分钟以上； 将分液漏斗放入4°C冰箱，静置30分钟以上，可见油、水分离；分离出水相层约；Mml，其中含有146S抗原。实施例二口蹄疫油乳剂灭活疫苗破乳后的146S抗原的回收与含量测定试验取4份口蹄疫油乳剂灭活疫苗样品，分别编号为1#_4#，按照实施例一中的方法破乳；取破乳后得到的水相即146S抗原液，按照申请号为200910092779的发明专利描述的蔗糖密度梯度紫外光定量法检测其中146S抗原的含量，具体步骤如下1. 146S抗原液浓缩超速离心含146S抗原液，用PBS液重悬至原体积的1/10，得到抗原浓缩液，置于2 8°C冰箱中备用；2.制备 15% 45%蔗糖梯度用含 0. 04mol/L 磷酸盐、0. 15mol/L NaCl，pH7. 6 8. 0的PBS缓冲液制备5管15% 45%均勻线性蔗糖梯度。3.蔗糖密度梯度超速离心对加至15% 45%均勻线性蔗糖梯度顶部的4管浓缩抗原液及1管空白对照在35，000rpm、10°C下超速离心3小时。4.连续流紫外分光光度计定量检测离心结束后，舍弃梯度顶部1 2ml液体，将连接在连续流紫外分光光度计流动样品池上进样端的长针头缓慢插入待检4管样品的管底，按照连续流紫外分光光度计的操作程序，对每管样品泵入流动样品池的各个级份进行连续不间断测定OD259nm值。5.计算146S抗原含量分别检测4个被检测样品OD值峰面积PA，根据公式
w FP >f P 4 :- F^D ‘「丨广“'丨Λ； m “/·.'..'计算出抗原液中146S抗原的含量g/ml)。检测时，所用连续流紫外分光光度计的比色皿的光程长度PL为0. 5cm，校正系数 E的经验值=76，加在梯度上的样品的原始体积W为10ml，设定蔗糖通过样品池的流速FR 为lml/min，吸光度单位FSD为0. 5，速度S为lcm/min，检测1#样品的OD值峰面积PA为1. 21cm2,则计算出其146S含量X0为1. 59 μ g/ml ；检测2#_4#样品的OD值峰面积PA分别为 0. 65,0. 46,0. 33cm2、则计算出 2#_4# 样品的 146S 含量 X0 分别为 0. 86,0. 61,0. 43 μ g/ ml (见表1)。已知在配制口蹄疫油乳剂灭活疫苗时每IOOml疫苗中加入的含146S抗原的水相体积为46ml，破乳后水相体积变为3細1，则146S含量测定值的校正系数为46/34 = 1. 35， 则146S含量的测定校正值Χ(μ g/ml)的计算公式为X = X0/l. 35据此公式，得出上述1#_4#样品破乳后146S含量的测定校正值X分别为1. 18、 0. 64,0, 45,0, 32 μ g/ml (见表 1)。已知上述1#-4#146S抗原液样品在配制疫苗时，每IOOml油乳剂灭活疫苗中加入的46ml水相中的146S抗原的含量Y分别1. 2、1. 0、0. 8、0. 6 μ g/ml (见表1)，则1#_4#样品中破乳后146S含量的测定校正值与配制疫苗时146S抗原含量对应关系如表1所示表1 口蹄疫油乳剂灭活疫苗破乳后146S抗原的回收与含量测定
样品序号配制疫苗时146S的加入量 Y (pg/ml)破乳后水相中146S含量的测定值知(Pg/ml)146S含量的测定校正值X (Pg/ml)1#1.21. 591. 182#1. 00. 860. 643#0. 80. 610. 454#0. 60. 430. 32由表1结果可得回归方程为Y = -1. 0343Χ2+2. 244Χ-0. 0082，回归系数为R2 = 0.9995。可见，破乳后水相中的146S抗原含量校正值X与原疫苗中的146S抗原值Y具有很高相关性。这一实验结果还表明，随疫苗中146S抗原含量的不同，破乳后水相中146S抗原测定值也不同，并随之呈高低分布，146S回收率稳定于70% -95%范围内，具有较好重复性， 批间偏差小于5%。实施例三口蹄疫油乳剂灭活疫苗中146S抗原含量测定口蹄疫油乳剂灭活疫苗中146S抗原的含量测定方法如下(1)取100ml ISA 206佐剂乳化的商品口蹄疫灭活疫苗，按实施例一中的方法破乳，得到含146S抗原水相约34ml ；(2)按照实施例二中描述的蔗糖密度梯度紫外光定量法检测水相中146S抗原含量(X0)为0. 78 μ g/ml，进一步得146S抗原含量校正值(X)为0. 58 μ g/ml ；。(3)按照公式Y = -1. 0343X2+2. 244X-0. 0082，计算出疫苗中的146S抗原含量(Y) 为 0. 94 μ g/mlο已知该疫苗样品在配制时146S抗原的加入量为0. 9 μ g/ml，而按照本实施例所述方法所得结果为ο. 94μ g/ml，二者的符合系数为0. 96，可见二者具有高度的一致性。这一结果进一步表明证实本发明所述方法可用于口蹄疫油乳剂灭活疫苗中146S抗原含量的测定。
权利要求
1.一种口蹄疫油乳剂灭活疫苗的破乳方法，其特征在于，采用破乳剂与口蹄疫油乳剂灭活疫苗充分混勻，静置，使油、水分离，使口蹄疫病毒粒子分布到水相。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述破乳剂选自下列有机溶剂中的任意一种苯甲醇、正戊醇、氯仿、正己醇。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述口蹄疫油乳剂灭活疫苗与所述破乳剂与按1 0. 06 0. 2的体积比混勻。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述静置过程在分液漏斗中进行。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述静置过程的温度设置为4°C、时间设定为30分钟以上。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，进一步分离出含有146S抗原的水相层。
全文摘要
本发明涉及口蹄疫疫苗质量检测技术中的口蹄疫油乳剂灭活疫苗的破乳方法。该方法为采用破乳剂与口蹄疫油乳剂灭活疫苗充分混匀，静置，使油、水分离，使口蹄疫病毒粒子分布到水相；其中所述破乳剂选自有机溶剂苯甲醇、正戊醇、氯仿、正己醇中的任意一种。本发明所述方法基本不破坏口蹄疫病毒粒子146S的完整性，破乳快速、简单易行，抗原146S回收率高，稳定性好，特别适合作为口蹄疫疫苗生产企业和国家质量检测部门对商品口蹄疫疫苗进行质量监测的方法。
文档编号B01D17/025GK102380232SQ201110177350
公开日2012年3月21日 申请日期2011年6月30日 优先权日2011年6月30日
发明者刘国英, 刘玉梅, 徐师军, 范秀丽, 韩润林 申请人:金宇保灵生物药品有限公司