专利名称：ε-聚赖氨酸硅纳米颗粒的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种ε-聚赖氨酸硅纳米颗粒的制备方法，系由硅纳米颗粒与ε-聚赖氨酸结合后制得，具有吸附DNA等带有负电荷物质的功能，涉及生物材料技术及其应用领域。
背景技术：
聚赖氨酸的化学合成是在1947年首先完成的。化学法合成的聚赖氨酸为α型， 其赖氨酸残基之间的酰胺键是由α-氨基和α-羧基缩合而成。1977年日本学者从放线菌培养过滤液中提取出一种含有25 30个赖氨酸残基的同型单体聚合物。这种赖氨酸聚合物是赖氨酸残基通过α-羧基和ε-氨基形成的酰胺键连接而成，故称为ε-聚赖氨酸 (ε "PL)。ε -聚赖氨酸是淡黄色粉末，吸湿性强，略有苦味，带正电荷，可以和带有阴离子的物质结合；具有较好的溶解性和抗热性，其水溶液加热至100°C处理30分钟后也不会发生分解，仍保持原有聚合物的长度。ε -聚赖氨酸具有广谱抑菌性，因此作为新型的食品防腐剂在日本、美国、韩国等国家广泛应用，但在其它领域应用很少。α-聚赖氨酸在ρΗ中性环境中带正电荷，可通过静电作用吸附带负电荷的DNA、 RNA，可用作非病毒载体系统。据检索，发现以下相关文献和专利。朱诗国等人在2002年第47卷第3期《科学通报》发表的论文“一种新型的非病毒 DNA传递载体多聚赖氨酸硅纳米颗粒”公开了一种通过0Ρ-10/环己烷/氨水微乳液体系合成了不同粒径的硅纳米颗粒，并利用正交分析阐明了该体系中各组分对硅纳米颗粒粒径及其分布的影响；成功地在小粒径(约20nm)硅纳米颗粒表面修饰上多聚赖氨酸，研制出复合纳米材料一多聚赖氨酸-硅纳米颗粒。DNA结合分析及DNase I消化实验发现，多聚赖氨酸-硅纳米颗粒能有效结合和保护DNA。细胞转染实验发现，它能高效传递DNA进入 HNEI细胞，并产生高水平的绿色荧光蛋白表达，这些结果表明多聚赖氨酸一硅纳米颗粒是一种新型的非病毒纳米DNA传递载体，并将可能在基因表达与功能研究及基因治疗等领域发挥重要作用。肖苏尧等人在2004年第47卷第3期《中国科学B辑》发表的论文“多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒基因载体的研制及应用”公开了一种以可溶性淀粉为原料，利用反向微乳液法， 加入交联剂三氯氧磷，制备了直径为50nm左右带负电荷的交联淀粉纳米颗粒。以该纳米颗粒为内核，经多聚赖氨酸修饰，得到了多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒(PHtNP)。对PHtNP 进行了颗粒粒度、稳定性和电性的表征，并通过颗粒的体外细胞毒性检测、颗粒与DNA结合能力及细胞转染等方面的分析，发现多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒(PLL-MNP)有可能作为基因载体，在此基础上发展了多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒基因载体的构建与基因转染技术。作为非病毒基因载体，赖氨酸淀粉纳米颗粒具有基因装载量大、转染率高、细胞毒性低以及可生物降解等优点。专利CN1462763A公开了一种多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒与制备方法及作为基因载体的应用。多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒，是在阴离子型淀粉纳米内核表层修饰有阳离子型多聚赖氨酸核壳。其制备方法，是将淀粉水解液加入油相中，搅拌形成微小乳液；加入交联剂， 搅拌反应，用酒精洗涤、干燥，得阴离子型淀粉纳米颗粒，将其分散悬浮于磷酸缓冲液中，加入多聚赖氨酸水溶液，振摇，离心分离，即可在PH中性环境中得到高电位值的阳离子型多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒。该纳米颗粒与外源基因结合作为基因载体应用。本发明的多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒无毒副作用，材料易得，成本低廉；其制备方法工艺简单；作为基因载体，转导效率高，无免疫原性，无细胞毒性，且具有生物可降解性。文献和专利制备的多聚赖氨酸硅纳米颗粒采用的均为α构型，且分子量均在 75000以上。本发明所涉及的ε-多聚赖氨酸硅纳米颗粒采用的为ε-聚赖氨酸，分子量在5000以下，与文献报道有显著不同。实验发现，制备的ε-聚赖氨酸硅纳米颗粒能有效结合DNA等带负电荷物质，可用作色谱填料或基因载体。
发明内容
针对聚赖氨酸的特性，本发明的目标是，提供一种新型吸附带负电荷物质的吸附材料的制备方法。针对现有技术上存在的问题，本发明所要解决的技术问题是提供一种无毒副作用，表面带有阳性氨基团，易于修饰，可用作色谱填料或基因载体的硅纳米颗粒材料。技术方案本发明应用纳米制备技术得到硅纳米颗粒，再修饰上ε -聚赖氨酸，得到在PH中性环境中带正电荷的ε-聚赖氨酸硅纳米复合颗粒。修饰硅纳米颗粒时，增加
聚赖氨酸的用量，复合纳米颗粒的吸附能力增强，其吸附量随即增大。本发明中的多聚赖氨酸修饰硅纳米颗粒的制备方法如下 制备稳定透明的微乳液体系。即将环己烷、壬基酚聚氧乙烯醚、正己醇和水按一定比例混合均勻，磁力搅拌使其形成油包水型微乳液。将正硅酸乙酯加入到微乳液体系中，并加入适量氨水催化它在微乳液体系中的水解。反应完成后，加入适量丙酮洗脱，离心，去上清，用双蒸水分别洗沉淀，离心收集沉淀，冷冻干燥。称取硅纳米颗粒，重悬于碳酸钠溶液中，超声分散；加入ε -聚赖氨酸干粉，混勻，弃上清，沉淀重悬于无菌水中或冻干保存。本发明所用原材料为ε -聚赖氨酸，无毒性，无副作用，本方法制备硅纳米颗粒， 相比于其他方法，反应时间短，颗粒易于洗涤，分散性好，是一种绿色生物吸附材料。发明制备工艺简单，设备要求不高，反应时间短，条件温和，材料易得，成本低廉。
泳道M表示D2000DNA Marker，泳道1_5表示ε -聚赖氨酸硅纳米颗粒与DNA的质量比分别为 10 1,20 1,30 1,40 1,50 1;
具体实施例方式实例实施1称取8. Og壬基酚聚氧乙烯醚放于锥形瓶内，将锥形瓶放置于磁力搅拌器上，边搅拌边一次加入IOOml环己烷、1. 2ml双蒸水。向瓶内逐滴加入正己醇至溶液突然由浑浊变澄清为止。搅拌10分钟后，将1. Oml正硅酸乙酯加入到微乳液体系中，并加入1. Oml氨水催化它在微乳液体系中的水解，室温搅拌M小时。向制备好的硅纳米的锥形瓶内加入20. Oml丙酮，洗脱附着于硅纳米表面的活性剂，然后12000r/min离心10分钟，弃上清液。沉淀用双蒸水洗涤3次，12000r/min离心10分钟收集沉淀。将硅纳米沉淀进行冷冻干燥，制成粉末。称取4. Omg硅纳米干粉，在紫外灯下照30分钟杀菌。向装有硅纳米干粉的无菌离心管中加入1. OmlNa2CO3(0. 6mol/L)溶液，冰水浴超声分散15分钟至溶液无肉眼可见颗粒， 12000r/min离心10分钟，弃去上清。将沉淀悬于Iml无菌水中，冰水浴超声分散20分钟， 加入3. Omg ε -聚赖氨酸干粉，充分混勻后4°C振荡M小时。12000r/min离心，弃去上清， 将沉淀悬于无菌水中，冰水浴超声分散后4°C贮存。实例实施2称取4. Og壬基酚聚氧乙烯醚放于锥形瓶内，将锥形瓶放置于磁力搅拌器上，边搅拌边一次加入50ml环己烷、0. 6ml双蒸水。向瓶内逐滴加入正己醇至溶液突然由浑浊变澄清为止。搅拌10分钟后，将5. Oml TEOS加入到微乳液体系中，并加入1.0ml氨水催化它在微乳液体系中的水解，室温搅拌M小时。(以上操作在通风橱内完成。)向制备好的硅纳米的锥形瓶内加入20. Oml丙酮，洗脱附着于硅纳米表面的活性剂，然后12000r/min离心10 分钟，弃上清液。沉淀用双蒸水洗涤3次，12000r/min离心10分钟收集沉淀。将硅纳米沉淀进行冷冻干燥，制成粉末。称取4. Omg硅纳米干粉，在紫外灯下照30分钟。向装有硅纳米干粉的无菌离心管中加入1. 5ml Na2CO3 (0. 6mol/L)溶液，封口，冰水浴超声分散15分钟至溶液无肉眼可见颗粒，12000r/min离心10分钟，弃去上清。将沉淀悬于Iml无菌水中，冰水浴超声分散20分钟，加入4. Omg ε -聚赖氨酸干粉，充分混勻后4°C振荡M小时。12000r/ min离心，弃去上清，冻干后4°C贮存。在此说明书中，本发明已参照其特定的实施作了描述，但显然仍可以做出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，本说明书应被认为是说明性而非限制性的。
权利要求
1.一种ε-聚赖氨酸硅纳米颗粒及制备方法，其特征在于硅纳米内核表层修饰有阳离子型ε-聚赖氨酸。
2.一种ε-聚赖氨酸硅纳米颗粒及制备方法，其特征在于将壬基酚聚氧乙烯醚放于容器内，边搅拌边加入环己烷和蒸馏水，环己烷、壬基酚聚氧乙烯醚、蒸馏水比例为2 4(w) 50 100 (ν) 0.5 I(V)，向瓶内逐滴加入正己醇至溶液突然由浑浊变澄清为止， 使其形成油包水型微乳液。
3.一种ε-聚赖氨酸硅纳米颗粒及制备方法，其特征在于将0.3 2% (ν/ν)正硅酸乙酯加入到微乳液体系中，并加入0.3 2% (ν/ν)氨水催化它在微乳液体系中的水解，反应完成后，加入10 50%丙酮洗脱，离心，去上清，用蒸馏水洗沉淀，离心收集沉淀，重复洗涤三次，冷冻干燥得到硅纳米干粉。
4.一种ε-聚赖氨酸硅纳米颗粒及制备方法，其特征在于称取一定质量的硅纳米干粉，重悬于0. 5 0. 8mol/L碳酸钠溶液中成浓度为2 10mg/ml，冰水浴超声分散至溶液无肉眼可见颗粒，离心，将沉淀悬于无菌水中，冰水浴超声分散，加入ε -聚赖氨酸干粉，充分混勻后4°C振荡M小时，12000r/min离心，弃去上清，将沉淀冻干备用或悬于无菌水中，冰水浴超声分散后4°C贮存备用。
5.根据权利要求1所述的ε_聚赖氨酸硅纳米颗粒及制备方法，其特征在于用于 ε-聚赖氨酸硅纳米颗粒制备用的ε -聚赖氨酸为赖氨酸残基通过α-羧基和ε -氨基形成的酰胺键连接而成，ε -聚赖氨酸的分子量在5000以下。
6.根据权利要求1所述其特征在于ε-聚赖氨酸与硅纳米粒质量比0.1 1 5 1。
全文摘要
本发明涉及一种ε-聚赖氨酸硅纳米颗粒及制备方法。ε-聚赖氨酸硅纳米颗粒是在硅纳米内核表层修饰有阳离子型ε-聚赖氨酸核壳。其制备方法是，采用正硅酸乙酯在油包水型微乳液体系中水解，直接制备二氧化硅纳米颗粒，再与ε-聚赖氨酸结合得到。本发明的ε-聚赖氨酸硅纳米颗粒制备方法简单，具有良好的生物相容性，并且无细胞毒性，具有吸附DNA等带有负电荷物质的功能，可作为一种新型基因载体或色谱填料。
文档编号B01J20/30GK102489270SQ201110360129
公开日2012年6月13日 申请日期2011年11月15日 优先权日2011年11月15日
发明者乔长晟, 姚爽, 姚芳莲, 张帆, 戴玉杰, 谭之磊, 贾原媛, 贾士儒, 钟成, 韩培培 申请人:天津科技大学