专利名称：基于量子点的免疫荧光微流控芯片及其制法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及量子点免疫荧光微流控芯片单细胞水平细胞膜表面糖基分析方法。
背景技术：
单细胞行为信息的获取是非常重要的。[参见(a) Sethuraman, N. ; Stadheim,T. A Curr. Opin. Biotechnol. 2006，17，341 346. (b) Rao, C. V. ; Wolf, D. Μ.;Arkin, A. P. Nature 2002, 420, 231 237.]。流式细胞术作为最常用的技术之一可以实现单细胞数据的高通量获取，然而其对少量细胞样品的分析能力受到一定的限制。光钳技术，介电电泳技术虽可以有效捕获并操控单细胞并用于分析，但这些技术通量均不高 从而并不适用于细胞生物学实验室。微流控芯片技术以其便捷的细胞操控，精确的试剂传输，和低的样品消耗正受到广泛关注[参见(c) Carlo, D. D. ; Aghdam, N. ; Lee, L. P.Anal. Chem. 2006, 78,4925 4930. (d) fflodkowic, D. ; Faley, S. ; Zagnoni, M.;ffikswo, J. P. ; Cooper, J. M. Anal. Chem. 2009, 81, 5517 5523. (e) Figueroa,X. A. ; Cooksey, G. A. ; Votaw, S. V. ; Horowitz, L. F. ; Folch, A. Lab Chip 2010,10, 1120 1127. (f) Hosokawa, M. ; Hayashi, T. ; Mori, T. ; Yoshino, T. ; Nakasono,S. ; Matsunaga, T. Anal. Chem. 2011, 83, 3648 3654·]。免疫荧光技术在科学研究和临床诊断当中都被广泛使用。其被用于评估组织、培养细胞群体、单细胞特异性蛋白[参见(g) Behrens, M.; Born, S.; Redel, U.;Voigt, N. ; Schuh, V. ; Raguse, J. _D. ; Meyerhof, ff. PLoS One 2012, 7, e40304. (h)Fitzpatrick, E. ; Mcbride, S. ; Yavelow, J. ; Najmi, S. ; Zanzucchi, P. ; Wieder, R.Clin. Chem. 2006，52，1080 1088.]、生物小分子[参见(i) Falsey, J. R. ; Renil,Μ. ; Park, S. ; Li, S. ; Lam, K. S. Bioconjugate Chem. 2001, 12, 346 353·]、糖残基[参见(j) Venkatesan, C. ; Chrzaszcz, M. ; Choi, N. ; ffainwright, M. S.J. Neuroinflammation 2010, 7, 32.]等。其中，细胞表面糖残基的表达与细胞的贴壁、分化以及免疫识别都密切相关。其表达改变常常与疾病相关，特别是癌症[参见(k) Radhakrishnan, P. ; Lin, M. F. ; Cheng, P. ff. Glycoconjugate J. 2009, 26,75 81·]。目前常用得糖基分析方法包括质谱法[参见(1) Yamada, K. ; Hyodo, S.;Kinoshita, M. ; Hayakawa, T. ; Kakehi, K. Anal. Chem. 2010, 82, 7436 7443.]，色谱法[参见(m) Klapoetke, S. ; Zhang, J. ; (n) Becht, S. ; Gu, X. ; Ding, X. J.Pharm. Biomed. Anal. 2010, 53, 315 324.],核磁共振[参见(o) Gustafsson, A.;SjobIom, Μ. ; Strindelius, L. ; Johansson, Τ. ; Fleckenstein, Τ. ; Chatzissavidou,N. ; Lindberg, L. ; Angstrom, J. ; Rova, U. ; Holgersson, J. Glycobiology 2011, 21,1071 1086.]等。然而这些方法常常需要昂贵的仪器设备，专业化的操作人员，尤其是需要对细胞样品进行破坏性处理从而限制其应用。而基于有机染料或荧光蛋白的免疫荧光分析方法又常常面临一个光漂白的问题。量子点作为一种高量子产率和高稳定性的纳米材料成为一类新型荧光探针，受到越来越多的关注。但至今尚未有基于量子点的免疫荧光芯片用于单细胞水平膜表面糖基表达分析方法的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于量子点的免疫荧光微流控芯片，用该芯片可以进行高灵敏、高通量单细胞水平膜表面糖基表达的分析。—种免疫突光微流控芯片，如图1所不，它是由两片聚二甲基娃氧烧(PDMS)叠合而成，上层由集成有入口微流路和细胞培养微腔的PDMS薄膜构成，PDMS膜厚2±0. 5mm，所述的入口微流路是由一条长5 ±O. 5_的入口流路下接多条入口分支流路构成，多条入口分支流路与一个长2. 5±0· 5mm、宽2±0· 5mm的细胞培养微腔相通，在细胞培养微腔的入口微流路的相对方向有出口微流路，出口微流路与入口微流路相对应，也由与细胞培养微腔相通的多条出口分支流路和出口流路构成，多条入口分支流路和多条出口分支流路可以保证液体均匀地流入和流出细胞培养微腔；下层由集成有微坑阵列的PDMS薄膜构成，所述的PDMS膜厚200±20Mm，微坑阵列为30-40行、25±45列微坑组成的、长2. 5±0. 5mm、宽 2±0. 5mm微坑阵列，微坑为圆形,直径为30±5Mm,深度为25±5 μ m,相邻两微坑边界距离为25土5Mm，上层PDMS薄膜的细胞培养微腔与下层PDMS薄膜的微坑阵列对齐，两层PDMS薄膜通过氧等离子体处理后进行不可逆封接，构成基于量子点的免疫荧光微流控芯片。上述的免疫荧光微流控芯片，所述的入口微流路可以是由一条入口流路连接两条分支流路，每条分支流路又连接两条二级分支流路，四条二级分支流路与细胞培养微腔相通。上述的免疫荧光微流控芯片，所述的出口分支流路与入口分支流路相对应。上述的免疫荧光微流控芯片，所述的微流路是宽O. 2±0. 05mm、深60±5μπι的液流管道，所述的细胞培养微腔深60±5 μ m。一种制备上述的免疫荧光微流控芯片的方法，它包括如下步骤
步骤1.免疫荧光微流控芯片模具的制备
按上述的免疫突光芯片的参数，用直径52mm的单抛娃片为模板,在上面旋涂一层60±5Mm 厚的 SU-8 2050 负光刻胶(2000 转，30s)，经过前烘 65°C、3min 和 95°C、5min，然后通过集成有微管道和培养微腔的掩模板进行光刻(24mW/cm2，8s),
然后经过后烘65 V、3 min和95 °C、5min，显影、固膜后得到制备集成有微管道和培养微腔的上层PDMS薄膜的娃片模具；用直径52mm的单抛娃片为模板,在上面旋涂一层25±5Mm厚的光刻胶(5000转，30s)，前烘、曝光及后烘参数同上，经显影、固膜后得到制备集成有微坑阵列的下层PDMS薄膜的硅片模具；
步骤2.免疫荧光芯片的制备
将单体和固化剂质量比为20:1的PDMS充分混合，抽真空IOmin后，浇注在步骤I得到的具有微流路和培养微腔及具有微坑阵列的硅片模具上，静置IOmin后放置于70°C烘箱内烘2h，从硅片模具上剥离PDMS膜，厚度2±0. 5mm裁切为合适大小，制得具有微流路和培养微腔的PDMS芯片；将具有微坑阵列的硅片模具放置在匀胶台上，然后将单体和固化剂质量比为10:1的PDMS约3g倾倒在硅片模具上，1000转，30s，后放置于70°C烘箱内烘2h，从硅片模具上剥离PDMS膜，裁切为合适大小制得具有微坑阵列的PDMS芯片，芯片厚度200 土 20Mm，所得集成微流路和培养微腔PDMS薄膜和集成有微坑阵列的PDMS薄膜置于氧等离子清洗器内处理lmin，将两片薄膜对齐后封合，用75%乙醇溶液进行消毒处理后，用PBS(磷酸盐缓冲溶液)冲洗后即得免疫荧光微流控芯片。一种上述的免疫荧光微流控芯片用于单细胞水平膜表面糖基表达分析方法，其包括如下步骤
步骤1.将I X IO6 5 X IO6ceIls mr1细胞悬液通过重力作用从入口流路引入细胞培养微腔内；
步骤2.通过平衡出入口液面高度使液流保持静止，让细胞通过重力作用进入微坑； 步骤3.通过抬高出口液面高度使液流向相反方向流动，重复步骤2，再次实现细胞捕
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犾；
步骤4.重复步骤2和3，得到满意细胞捕获效率；
步骤5.经PBS (磷酸盐缓冲溶液)冲洗未沉降细胞后，引入甲醛固定细胞，经三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液冲洗，牛血清白蛋白封闭后引入凝集素孵育，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液-吐温20冲洗，牛血清白蛋白封闭后，引入凝集素抗体孵育，冲洗封闭后引入CdTe量子点探针；
步骤6.三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液-吐温20冲洗后，置于激光共聚焦显微镜下拍照并分析。本发明细胞捕获效率通过倒置荧光显微镜计数分析获得。结果表明，90%的微坑可以捕获细胞，且可得到约70%的含单细胞微坑。本发明细胞活性通过钙黄绿素Calcein AM和碘化丙啶PI进行表征。结果表明，细胞在微芯片内进行12小时培养后细胞仍保持高活性。本发明通过激光共聚焦显微镜对细胞免疫荧光染色效果进行观察。结果表明，在单细胞水平呈现高亮红色荧光。
图1为本发明所用微流控芯片平台设计示意图。图2为本发明细胞捕获图。图3为本发明细胞活性表征结果钙黄绿素Calcein AM细胞活性染色(图A)，碘化丙啶PI细胞死亡染色(图B)。图4为本发明用于单细胞膜表面糖基免疫荧光染色分析结果。图A为共聚焦专用玻璃底培养皿内细胞荧光图片，图B和C为免疫荧光微流控芯片内细胞荧光图片。
具体实施例方式下面结合附图所示实施例进一步说明本发明的具体内容
实施例1.免疫荧光微流控芯片的模具制备
芯片装置采用聚二甲基硅氧烷材料(PDMS)通过标准软光刻方法制备。设定微坑芯片参数如下集成有微管道和培养微腔的PDMS薄膜的具体参数图1A所示；微坑阵列芯片的微坑按40行、35列设置，共1400个微坑,坑间距25±5Mm (两坑边界距离)，直径30±5Mm,深25±5Mm，用直径52mm的单抛硅片为模板，在上面旋涂一层60±5Mm厚的SU-8 2050负光刻胶(2000转，30s)，经过前烘(65°C 3min，95°C 5min )然后通过集成有微管道和培养微腔的掩模板进行光刻(24mW/cm2，8s),然后经过后烘(65°C 3min,95°C ),显影、固膜后制得集成有微管道和培养微腔的硅片模具；用直径52 mm的单抛硅片为模板，在上面旋涂一层25±5Mm厚的光刻胶(5000转，30s)，前烘、曝光及后烘参数同上，经显影后烘后制得集成有微坑阵列的硅片模具。实施例2.免疫荧光微流控芯片的制备
将单体和固化剂质量比为20:1的PDMS充分混合，抽真空IOmin后，浇注在步骤I得到的具有微流路和培养微腔的硅片模具上，静置IOmin后放置于70°C烘箱内烘2h。从硅片模具上剥离PDMS膜，PDMS膜厚为2±0. 5mm,裁切为合适大小，制得具有微流路和培养微腔的PDMS芯片；将具有微坑阵列的硅片模具放置在匀胶台上，然后将单体和固化剂质量比为10:1的PDMS约3g倾倒在硅片模具上，1000转，30s，后放置于70°C烘箱内烘2 h，从硅片模具上剥离PDMS膜，裁切为合适大小制得具有微坑阵列的PDMS芯片，芯片厚度200±20Mm。两PDMS膜用洗洁净清洗后，分别于乙醇、二次水中超声lOmin，氮气吹干后放于烘箱内70°C烘lh。将烘干的集成微流路和培养微腔的PDMS薄膜和集成有微坑阵列的PDMS薄膜置于氧等离子清洗器内处理lmin。将两片芯片对齐后封合，用75%乙醇溶液进行消毒处理后，用PBS (磷酸盐缓冲溶液)冲洗备用。实施例3.重力沉降作用结合出入口溶液体积变化单细胞捕获
将I X IO6 5 X IO6ceIls mr1的细胞悬液通过微注射器引入芯片入口，降低出口液面高度，依靠重力差将细胞引入微流路管道，通过平衡出入口体积中止液体流动，由于重力作用细胞向微坑里沉降，增加出口液面高度，此时流体流动方向与此前相反，出口内的细胞再次通过微坑阵列区域，重复上述操作，细胞向微坑内沉降，获得满意的单细胞捕获效率。此时在入口管加入PBS (磷酸盐缓冲溶液)溶液，将微流路及微培养腔内未被捕获的细胞冲洗至出口处，用微注射器吸出。表征结果见图2。实施例4.微流控芯片平台上细胞活性测试
在微芯片平台上，细胞孵育12h后，将钙黄绿素Calcein AM和碘化丙啶PI引入微流路管道，孵育IOmin后进行显微观察，结果显示在该平台上细胞经12h孵育，仍保持高细胞活性。分析结果见图3。实施例5.微流控芯片平台上的免疫荧光染色分析
将4%甲醛溶液引入微流路管道对细胞进行固定，时间10 min，在室温下进行。细胞固定后用三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液冲洗lOmin，并用牛血清白蛋白封闭细胞表面非特异性位点30 min。将凝集素溶液引入芯片，与细胞在室温下孵育10 min。用三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液-吐温20溶液冲洗细胞，并用牛血清白蛋白封闭10 min。将抗凝集素抗体引入芯片37 V孵育I h，重复上述冲洗封闭步骤。将CdTe量子点探针引入芯片，37 V孵育I h。用三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液-吐温20溶液冲洗芯片并将芯片置于激光共聚焦显微镜下拍照，获取单个细胞膜表面糖基表达信息。
权利要求
1.一种免疫荧光微流控芯片，其特征是它是由两片聚二甲基硅氧烷(PDMS)叠合而成，上层由集成有入口微流路和细胞培养微腔的PDMS薄膜构成，PDMS膜厚度为2±0. 5mm,所述的入口微流路是由一条长5±0. 5mm的入口流路下接多条入口分支流路构成,多条入口分支流路与一个长2. 5±0. 5mm、宽2±O. 5mm的细胞培养微腔相通，在细胞培养微腔的入口微流路的相对方向有出口微流路，出口微流路与入口微流路相对应，也由与细胞培养微腔相通的多条出口分支流路和出口流路构成，多条入口分支流路和多条出口分支流路可以保证液体均匀地流入和流出细胞培养微腔；下层由集成有微坑阵列的PDMS薄膜构成，所述的PDMS膜厚度为200 土 20Mm，微坑阵列为40 ± 10行、35 ± 10列微坑组成的，微坑为圆形，直径为30±5Mm，深度为25±5μπι，相邻两微坑边界距离为25±5Mm，上层PDMS薄膜的细胞培养微腔与下层PDMS薄膜的微坑阵列对齐，两层PDMS薄膜通过氧等离子体处理后进行不可逆封接，构成基于量子点的免疫荧光微流控芯片。
2.根据权利要求1所述的免疫荧光微流控芯片，其特征是所述的入口微流路是由一条入口流路连接两条分支流路，每条分支流路又连接两条二级分支流路，四条二级分支流路与细胞培养微腔相通。
3.根据权利要求2所述的免疫荧光微流控芯片，其特征是所述的出口分支流路与入口分支流路相对应。
4.根据权利要求1所述的免疫荧光微流控芯片，其特征是所述的微流路是宽O.2±0. 05mm、深60±5 μ m的液流管道，所述的细胞培养微腔深60±5 μ m。
5.一种制备权利要求1所述的免疫荧光微流控芯片的方法，其特征是它包括如下步骤步骤1.免疫荧光微流控芯片模具的制备按上述的免疫突光芯片的参数，用直径52mm的单抛娃片为模板,在上面旋涂一层60±5Mm厚的SU-8 2050负光刻胶，经过前烘65°C、3min和95°C、5min，然后通过集成有微管道和培养微腔的掩模板进行光刻，然后经过后烘65°C、3min和95°C、5min，显影、固膜后得到制备集成有微管道和培养微腔的上层PDMS薄膜的娃片模具；用直径52mm的单抛娃片为模板,在上面旋涂一层25±5Mm厚的光刻胶，前烘、曝光及后烘参数同上，经显影、固膜后得到制备集成有微坑阵列的下层PDMS薄膜的娃片模具；步骤2.免疫荧光芯片的制备将单体和固化剂质量比为20:1的PDMS充分混合，抽真空IOmin后，浇注在步骤I得到的具有微流路和培养微腔的硅片模具上，静置I min后放置于70°C烘箱内烘2h，从硅片模具上剥离PDMS膜，膜厚2±0. 5mm,裁切为合适大小，制得具有微流路和培养微腔的PDMS芯片；将具有微坑阵列的硅片模具放置在匀胶台上，然后将单体和固化剂质量比为10:1的PDMS约3g倾倒在硅片模具上，1000转，30s，后放置于70°C烘箱内烘2h，从硅片模具上剥离PDMS膜，裁切为合适大小制得具有微坑阵列的PDMS芯片，芯片厚度200±20Mm，两PDMS膜用洗洁净清洗后，分别于乙醇、二次水中超声lOmin，氮气吹干后放于烘箱内70°C烘IhJf烘干的集成微流路和培养微腔的PDMS薄膜和集成有微坑阵列的PDMS薄膜置于氧等离子清洗器内处理lmin，将两片芯片对齐后封合，用75%乙醇溶液进行消毒处理后，用PBS (磷酸盐缓冲溶液)冲洗后即得免疫荧光微流控芯片。
6.根据权利要求3所述的制备免疫荧光微流控芯片的方法，其特征是步骤I所述的进行光刻是功率为24 mff/cm2,时间是8s。
7.权利要求1所述的免疫荧光微流控芯片在单细胞水平膜表面糖基表达分析中的应用。
8.根据权利要求5所述的免疫荧光微流控芯片在单细胞水平膜表面糖基表达分析中的应用，其特征是具体步骤如下步骤1.将I X IO6 5 X IO6ceIls ml/1细胞悬液通过重力作用从入口流路引入细胞培养微腔内；步骤2.通过平衡出入口液面高度使液流保持静止，让细胞通过重力作用进入微坑； 步骤3.通过抬高出口液面高度使液流向相反方向流动，重复步骤2，再次实现细胞捕-M-犾；步骤4重复步骤2和3，得到满意细胞捕获效率；步骤5.经PBS (磷酸盐缓冲溶液)冲洗未沉降细胞后，引入甲醛固定细胞，经三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液冲洗，牛血清白蛋白封闭后引入凝集素孵育，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液-吐温20冲洗，牛血清白蛋白封闭后，引入凝集素抗体孵育，冲洗封闭后引入 CdTe量子点探针；步骤6.三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液-吐温20冲洗后，置于激光共聚焦荧光显微镜下拍照并分析。
全文摘要
本发明公开一种免疫荧光微流控芯片，它是由两片聚二甲基硅氧烷(PDMS)叠合而成，上层由集成有入口微流路和细胞培养微腔的PDMS薄膜构成，下层由集成有微坑阵列的PDMS薄膜构成，所述的微坑阵列为40±10行、35±10列微坑组成的、长2.5±0.5mm、宽2±0.5mm微坑阵列，微坑为圆形，直径为30±5μm，深度为25±5μm，上层PDMS薄膜的细胞培养微腔与下层PDMS薄膜的微坑阵列对齐，两层PDMS薄膜通过氧等离子体处理后进行不可逆封接，构成基于量子点的免疫荧光微流控芯片。本发明的免疫荧光微流控芯片可以应用于单细胞水平膜表面糖基表达分析。本发明公开了其制法。
文档编号B01L3/00GK103018437SQ201210545258
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月14日 优先权日2012年12月14日
发明者朱俊杰, 曹俊涛 申请人:南京大学