具有可拆卸载玻片的样品处理装置制造方法
【专利摘要】一种生物和化学样品处理装置，该装置b.包括一个抗高压的、浅的并且宽面积的微流体腔室，该微流体腔室具有由可拆卸的载玻片形成的至少一个壁，该载玻片含有诸如固定的实体、生物样品或分子的样品，c.包括用于将流体注射到所述腔室并且从该腔室收集流体的微流体出入孔的安排，d.与形成在该腔室外部的入口端口和微流体通道接合，e.被配置为使得该载玻片可以与该装置接触而形成所述腔室，f.被适配为在所述腔室的内部以快速的方式优选地在小于15秒之内、并且由于所述微流体出入孔的安排而以规则或均匀的方式递送和转运流体物质和试剂。
【专利说明】具有可拆卸载玻片的样品处理装置 发明背景
[0001] 在现代肿瘤学中，生物标志物分析是一种用于癌症诊断和预测的不可缺少的工 具。在医学实验室中，免疫组织化学（IHC)已经被用作常规组织病理学检查过程中用于癌 症生物标志物分析的重要工具。IHC是一种由许多地方与国际当局，例如食品药品管理局 批准的技术，其用于组织标本和的生物标志物分析。一般而言，某些生物标志物（事实上为 抗原）是用与靶标生物标志物具有亲和力的特异性一级抗体进行搜索的。随后，使用与标 记物结合且与这些一级抗体具有亲和力的特异性二级抗体进行特异性标记。这种标记普 遍地是一种荧光标志物或有色标志物，并且在荧光的情况下，该技术被称为免疫组织荧光 (IHF)。
[0002] 另一方面，IHC和IHF不能立即应用于样品组织而需要一些预处理阶段。经由固 定步骤开始预处理，此时使已经从患者取得的疑似组织学样品首先经历一个保存该组织内 部的蛋白质和抗原以及该组织的形态的程序。虽然存在许多固定技术，固定步骤通常是经 由涉及液氮使用的非常迅速的冷却步骤的冷冻固定、或甲醛固定来完成的。随后，使组织经 历显微切片术过程，此时它们被切成薄切片（4ym-lOym)并被固定在标准的载玻片上。为 了后续较长时间保存，将冷冻固定的（CF)组织切片保持冷冻，而将甲醛固定的组织用一层 石蜡保存。后者称为"甲醛固定的石蜡包埋的（FFPE)"组织切片。在固定步骤后，待恢复到 环境温度之后，可使这些冷冻固定的组织直接经历IHC程序，而这些FFPE组织需要一些另 外的处理。这些处理包括石蜡的化学消除和称为抗原修复1的另一个步骤。通过使用不同 的手段，包括加热和酶促反应，该抗原修复步骤有助于恢复被甲醛交联的抗原。
[0003] 除了在实验室中手工处理之外，该技术的重要性和常规诊断的需1在许多资源中， 抗原修复也称为"表位修复"。此外，如果在抗原修复过程中涉及样品的加热，抗原修复也可 称为热诱导的或热介导的抗原修复。要触发了用于IHC过程自动化的商用组织处理器的开 发。这些仪器能够从抗原修复到染色处理组织切片，并且它们常规地在医学实验室中用于 诊断和预测。对于常规仪器而言，该过程时间在3小时到24小时之间变化，并且它们通常 能够处理多个载玻片。 长过程持续时间
[0004] 并非为技术的先进，可以认为现有的组织处理器就能使该手工过程自动化和并行 化，以便将处理量和再现性提高而达到一定的程度。眼前的问题之一是这种处理周期的持 续时间较长。一般而言，这些过程运行过夜，且在次日之前不能获得经处理和染色的组织。 目前，这是当前IHC的过程的较大障碍，因为所需要的时间期限不允许在手术干预过程中 完成分析。然而，如果能够在干预过程中完成IHC，则通过即时使用来自IHC的结果可以精 确调整外科治疗方案。一个非常重要的实例是癌症的诊断及其后续的治疗步骤。当患者已 经诊断患有癌症时，惯常程序通常是实现疑似组织的组织活检。然后，使这些样品经历IHC 分析，从而看出癌症之嫌疑是否是真实的。如果答案是肯定的，那么进行第二次手术来清除 所有来自身体的肿瘤，这是一个关键步骤，因为即使单个的活癌细胞也能够再次生长为肿 瘤。不幸的是，直到现在，还没有提供一种证实肿瘤被完全清除的技术。因此，有时候，患者 可能需要再次手术或化学疗法来清除这些可能已经留下的细胞。当计数时，手术的次数在1 到3次之间变化，这对于患者增加了风险、代价和焦虑，并造成重大的卫生资源例如医师的 时间和手术室可用性的损失。
[0005] 被称为术中的程序的正规时间少于20分钟。直到现在，仅仅介绍了一种减少 IHC所需要的时间的IHC系统。这种技术是基于被称为"波"机制的一种现象，并利用了 两个邻近载玻片（其中之一携带组织切片）的'波状'铰链运动（PCT/US2006/015020和 W0/2006/116037)。该技术可以将冷冻固定载玻片的染色期缩短至15分钟，并因此可以称 为术中技术。另一方面，这15分钟不包括固定、观察和成像时间，其中判断这些事项可能还 需要至少大约15分钟，这样就超出了术中条件。因此，染色方案持续时间应当减少至低于 5分钟，以便使总的IHC过程是在'术中'。而且，尽管冷冻固定的组织的处理比较容易，但 是由于许多原因，FFPE组织更受欢迎。首先，由于所需要的设备，在冷冻固定程序中，组织 保存和归档具有更高的成本。更突出的是，冷冻固定的组织相比于FFPE组织更频繁地显示 出假阴性或假阳性。因此，虽然冷冻固定可以提供更快的结果，FFPE是更合宜的。报告的 用于FFPE组织切片使用"波"机制的处理时间是70分钟，这个时间期限接近于常规的自动 化组织处理器的时间。 在定量分析中的受限准确度
[0006] 除了术中方面之外，直到现在为止，正如在某些测定法过程中所需要的，当使用借 助于免疫组织化学获得的信号的范围处理需要定量性生物标志物表达分析的病例时，用任 何技术获得的结果的准确度都受到了限制。当需要这种半定量分析时，常规技术可产生高 达20%病例的模棱两可的结果，而仅仅使用免疫组织化学并不能实现最终的诊断结果。因 此，当前的标准是使这些病例经受后续的遗传分析（原位杂交），以便实现最终的诊断结 果，为诊断过程增加了可观的成本和时间（几天）。
[0007] 定量免疫组织化学分析的不准确性来源于免疫组织化学信号的强度，由于非特异 性结合反应、以及组织变性的不可预测效应、在组织固定、石蜡包埋、和热诱导的表位修复 方面的变化，该强度不一定与抗原表达的程度成比例。常规IHC是一种宏观操作，其中在30 分钟到数小时范围之内的反应时间对于实现表面抗原对生物试剂的均匀暴露和结果的可 再现性是需要的。这源于扩散时间长、试剂控制和定量精确性的缺乏、以及受限的流体交换 率。此外，长的测定时间和抗体暴露时间可以导致显著的抗体吸附和非特异性结合，使得生 成的免疫组织化学信号不再是组织上的靶标生物标志物浓度的线性函数。这些定量生物标 志物的表达水平的得分经常受到病理学家的判读和经验的影响。
[0008] 然而，如果可以保证在生物标志物表达水平与免疫组织化学信号之间的比例性， 则免疫组织化学信号将是定量的，并且可以高得多的准确度完成阳性样品与阴性样品之间 的区别。
[0009] 事实上，在靶标抗原与获自免疫测定的信号之间的这种非比例性不仅仅对于诊断 性免疫组织化学或一般的免疫组织化学是特异性的。这个问题在表面上存在固定靶标的所 有情形中存在，并且一种或多种检测试剂以受到这些检测试剂的扩散速度限制的比率与这 种靶标结合。这些情形可以包括但不限于免疫组织化学、DNA杂交、RNA定量、适体和低聚物 探针。另外，空间位阻机制也可以影响这种非比例性并且损害最后的定量测定。 需要在基础设施、设备和专门人才方面进行投资
[0010] 除了过程持续时间长和准确度受限制的固有问题之外，最先进的自动化设备还具 有少数其他缺点。现代商业自动化IHC是笨重的，其被提供在工作台中或置于台面上。因 此，它们远非便携式和手持式的。虽然便携不是必需的，但是例如对于术中操作，这可以增 加在缺乏实验室环境或电的情形的偏远地方的可及性。
[0011] 在具有低预算以及位于偏远地方的全科诊所中，没有能够进行这种诊断的必需基 础设施、设备和专门技术。事实上，对于小型诊所而言，形成和维持这样一个实验室是极其 昂贵的，需要大约1MCHF在基础设施和设备方面的投资以及每年对于专门人才的300KCHF 以上的投资。因此，形成可以进行免疫组织化学的实验室所需要的投资是主要的障碍之一， 其阻止了全世界大量患者对这种诊断技术的可及性。
[0012] 由最先进的设备所要求的当前实验室结构引起的一个另外的主要障碍是定制问 题，当在新的生物标志物发现和相关研究使用时，这显得特别突出。与新发现的分子和生物 标志物一起使用的现有大规模诊断设备的改变是昂贵且耗时的。这源于在研究和发现中需 要的灵活性与中心诊断实验室所需要的并行化程度及处理量之间的矛盾。此外，中心设施 抵制这样的定制，因为它们的当前诊断工作超载或者这种定制可以影响后面的再现性。因 此，通常手工完成涉及免疫组织化学的研究任务。然而，当考虑需要确认结果的大量试验以 及再现性的需要时，用于手工完成这样的研究需要的总时间可能跨越数年，显著影响了生 物标志物发现的总体研究与开发成本。
[0013] 可以在构成以下装置的3个不同部分下对现有技术进行概述：（a)进行IHC的芯 片上实验室装置、（b)呈现的减少过程时间的自动化宏观IHC处理器以及（c)具有相似微 流体设计的针对其他应用制造的芯片上实验室装置。在此，我们概述了这些装置并给出了 就品质因数进行的比较。 进行IHC的芯片上实验室装置
[0014] 直到现在，对于IHC有少数微流控方法，用于改良常规IHC的某些方面，这些方法 可潜在地受益于减少的扩散时间和改进的流体交换控制。这些方法中的一些旨在减少总的 分析时间，并且另一些旨在利用多个平行的小通道进行多路IHC，用于搜索具有更高抗体稀 释度的在空间上移位的位置中的不同靶标生物标志物。然而，在这些研究中没有一个暗示 微流控方法导致在定量分析准确度方面的增加以及通过这种分析获得的模棱两可的诊断 结果的减少。
[0015] 我们团队已经阐明了针对IHC设计的多种芯片上实验室装置，以便降低时间与输 出量的比值。我们已经证明在PDMS中的第一代L0C，其容许相对较快的组织分析（相对于 常规的2小时，为20分钟）[V.费尔南德斯-莫雷拉（Fernandez-Moreira)等人，分析家 (Analyst)，第135期，第42-52页，2010]。不幸的是，这种装置显示出受限的分析速度和检 测区。该系统不能保持高压，导致最大操作体积流量大约为50nL/s。该系统组装和拆开都 麻烦（手工整合），显著增加了分析时间和死体积。并且，仅有组织切片的一部分可以被暴 露（不到表面的百分之十几），由此限制了TS检测区。
[0016] 随后，我们证明了又在PDMS中生产的第二代装置（A.T.塞弗蒂里克（Ciftlik)等 人，用于化学和生命科学的微型系统的第14届国际会议会刊（Proc.of14thInt.Conf.on MiniaturizedSystemsforChemistryandLifeSciences) (microTAS'10),第 699-701 页，2010年10月），其增加了该区域并将孵育时间减少至3. 5分钟。在另一方面，这种装置 受制于许多问题，这些问题在很大程度上损害了定量分析的准确度和它的低成本商品化。 低准确度源于最后的发生在腔室内的经扩散控制的抗原抗体反应，这也致使时间分辨荧光 的使用是不可缺少的。腔室和与其连接的微流体通道的截面结构形成如在图1中展示的 结构。在该截面中，该腔室是一个宽而浅的长方形，并且该组织切片形成底宽侧。这些微流 体通道为大约50ym高的多个管道，并且这些通道在左手边和右手边的浅边缘上与该腔室 连接，靠近发现与组织切片相对的上部宽侧。在这样的设计中，当通过使用浅侧上的界定 的并且接近上部宽侧的入口和出口诱导流体流时，流体流的幅度仅仅在上部表面周围是显 著的，而它在组织切片周围低得多。因此，IHC方案试剂到组织表面的转运在很大程度上仍 然依赖于分子从上部表面的缓慢横向流扩散。此外，该设计要求该腔室高度应当始终高于 这些微流体通道的高度，并且这种条件致使在抗体转运方面的扩散的限制作用甚至更加显 著。这种在先设计转化为不能制造低于250ym的腔室，从而当与50ym高的腔室比较时， 扩散时间增加了 25倍（参见第0029段）。更突出的是，方案试剂到组织表面的缓慢的扩散 受限的转运损害了在获得的信号与组织表面上的抗原表达程度之间的比例性，使得不可能 成功地定量评估免疫组织化学信号。
[0017] 在这样一个扩散受限的系统中使用短的孵育时间（如在第0016段和引证文献中 所述）只有在使用先进的成像设备和材料时才有可能。由于如此长的扩散时间，当在该方 案中使用短的试剂孵育时间时，只有小部分一级抗体和二级抗体可以到达组织切片表面， 并且只有通过时间分辨荧光才有可能检测到如此低的信号。时间分辨荧光是一种先进的成 像技术，其中荧光团激发和发射的记录是通过利用特殊的时间分辨标志物结合的抗体（镧 化合物）在非重叠时期完成的，这些抗体在激发之后很长时间能够继续显著地发射。激发 和发射过程的时间多路复用在很大程度上消除了源于组织和周围材料的自体荧光背景信 号，并且使得在组织上非常少量的结合（一级和二级）抗体易于被检测到。使用标准的荧 光成像设备和商业荧光团，不可能检测这种信号。尽管如此，用于时间分辨标志物（镧化合 物）的荧光团和显微镜设备两者都是非常昂贵且不标准的，并且结合的诊断抗体是不可商 购的。结果，时间分辨显微镜的要求构成了阻止该装置的成功且低成本商业实施的另一个 障碍，因此，当采用像荧光团和发色团之类的标准染色试剂时，这是不能操作的。
[0018] 除了以上列出的设计相关问题（第0016-0017段和引证文献）之外，还有许多由 于使用PDMS作为结构材料所致的缺点。PDMS的相对低的杨氏模量使得这些通道在较高流 体压力下易于严重变形。也就是说，这些流动特征可能在一个方案中涉及的不同压力和流 速下发生改变。而且，在这种先前设计中，整合的组织切片载玻片的密封是使用形成下面的 入口 /出口微通道的壁的PDMS来完成的。此外，由于PDMS的低杨氏模量，更好地密封该组 织载玻片所需要的力可能易于使这些通道变形，其程度可至这些通道被阻断，并且该装置 的操作变得不可能。由于这些通道易于变形所致的在设计维度和流速方面的这些改变可能 引入在生成的IHC信号方面的改变，并且，当用于诊断时，可能在很大程度上损害结果的再 现性。此外，PDMS的热性能阻止了 70°C以上温度的使用，并且PDMS与可能涉及IHC方案的 许多试剂例如二甲苯（lineXylene)在化学上不相容。这种装置的另一个缺点是它仅仅接 受非标准组织切片载玻片形状，其构成了定制以及因此所致的这种结构作为诊断装置的商 业化发行的成本问题。
[0019] 最后，在第0016-0018段中描述的系统仅仅改进了免疫组织化学测定的方案时 间，但是这以使用时间分辨荧光为代价，就所需要的材料和基础设施而言，这是昂贵且最不 可及的方法。而且，测定时间最小化并没有消除试剂到组织表面的扩散控制的转运，并且进 行可以用这个系统完成的定量分析的能力与常规设置并没有不同：可能不能定量组织生物 标志物。最后但相当重要，由于在形成该系统的微流体结构中的可能变形，该系统的低杨氏 模量高度损害了再现性。
[0020] 在文献中呈现的另一种方法为所谓的多路微流体IHC(MMIHC)平台（M.S.金（Kim) 等人，生物材料（Biomaterials)，第 32 卷，Iss: 5，第 1396-1403 页，2011，以及金（Kim)等 人，PLoS0NE，第5(5)卷：第el0441页，2010)，其具有多个小通道，用于搜索在空间不同位 置中的不同标志物。该装置具有90分钟的响应时间，仍然处于自动化IHC处理器的那些时 间范围。而且，该装置可能使大约1. 5%的TS区染色，这对于该技术的推广是一个缺点。尽 管作者已经表明，对于具体的乳腺癌病例，即使对于这个小的区域，与完全染色的TS有大 约85%相关，不能实现充分的相关。对于每个不同的病例实现这种相关研究也是一项麻烦 的工作。另一方面，作者已经表明，它们可以使一级抗体浓度降低10倍，这对于减少昂贵抗 体的消耗是一个重要的步骤。 减少过程时间的商业自动化宏观IHC处理器
[0021] 如前面已经介绍的，具有低IHC过程时间的在市场上的唯一处理器是"波"系统 (PCT/US2006/015020和W0/2006/116037)。这种技术是基于称为"波"机制的一种现象，并 利用了两个邻近载玻片（其中之一携带组织切片）的'波状'铰链运动（切莱鲁斯诊断公 司（CelerusDiagnostics))。它可以将冷冻固定载玻片的染色期缩短至15分钟，并因此可 以称为术中技术。另一方面，这15分钟不包括固定、观察和成像时间，其中判断这些事项可 能还需要至少大约15分钟，这样就超出了术中条件。 具有相似微流体设计的针对其他应用制造的芯片上实验室装置
[0022] 可以在文献中找到基于坚向孔的装置，该坚向孔接受具有固定化标本的载玻片。 迈克尼里（Mcneely)等人（PCT/US2002/07113 和W0/2002/072264)介绍了针对DNA微阵列 处理制造的这样一种装置。不同于在IHC中需要的宽面积腔室，这种DNA微阵列处理装置具 有多个坚向孔和将试剂递送到存在DNA微阵列元件的每个小点的微流体通道网络。还呈现 了一种称为"微流体探针"的相似装置（A.克瓦尔（Queval)等人，实验室芯片（LabChip)， 第 10 卷，第 326-334 页，2010,以及专利文件PCT/IB2010/052018 和W0/2010/128483)，其中 坚向微流体孔安排在非常小的点（约100Um，呈对角线排列）内，以便将组织或细胞单层中 的某些点染色，其中这种探针可以在空间上移动。在另一个德拉马什（Delamarche)等人的 专利中（PCT/IB2003/005350和W0/2004/050246)，介绍了一种使液体在一种表面上流动的 装置，其中使用坚向孔和垫片来形成该表面上的腔室。
[0023] 还呈现了用相似的技术制成的另外的DNA杂交装置（US/2006/0003440)和测序装 置（PCT/US2010/047392和W02011/026136)，其中它们也包含连接至具有固定化DNA的微流 体通道的坚向孔。阿迪（Adey) (PCT/US02/24616和W0/2003/015922)已经描述了另一种装 置，该装置具有用于DNA和RNA处理的低体积腔室，该腔室具有柔性偏转膜，以根据应用来 改变腔室高度。金等人（PCT/US2008/074865和W0/2009/029845)还描述了一种宽面积微 流体装置，其具有均匀分布的半环形入口孔和三角形出口孔。
[0024] 在坚向微流体孔的研究中，未曾提供具有高压抗性的、在非常短的时间内操作的、 宽面积的且均匀分布试剂的装置。在以上装置和研究中没有一个暗示了微流控方法导致在 固定靶标的定量分析准确度方面的增加以及通过这种分析获得的模棱两可的结果的减少。 此外，要么正如在仅有一级抗体孵育在芯片上完成的MMIHC的情况下，半手工的芯片上实 验室IHC处理器可以仅仅使一部分TS染色，要么具有高的试剂成本。 发明说明
[0025] 本发明涉及如权利要求书中定义的装置和方法。
[0026] 具体而言指的是在临床免疫组织化学中用于准确的生物标志物检测的微流体组 织处理器（MTP)。大面积（256mm2)且浅的（〈100ym)腔室是通过夹紧标准的载有乳腺癌组 织切片的显微镜载玻片形成的，该载玻片具有玻璃/娃微机械加工的结构，其结合了用于 将组织切片迅速且均匀地暴露于免疫测定生物试剂的出入孔。结合有浅腔室中小的坚向扩 散长度的微流体流动模式允许使用短至2分钟的生物试剂孵育时间。这允许通过保留在表 面靶标量与生成的信号之间的比例性的准确定量分析。 微流体装置的设计
[0027] 作为具有固定的组织切片的简单标准显微镜载玻片的组织载玻片（TS)与微流体 通道的快速组装是相当重要的，因为总测定时间是关键参数。除了快速组装之外，我们设 想了这样一种系统，其中我们仅仅需要改变TS，而其他方面（微流体回路）保持不变。图 2显示了该装置的截面图示，该装置具有位于以下位置的微流体出入孔：（a)沿着用于流入 和流出的组织腔室的边缘以及（b)在用于流入的腔室的中心和在用于流出的腔室的边缘。 该装置具有用于引导并预处理递送到TS的流体的横向微流体通道，其使用顶部微流体层 和用于接近薄腔室（通过使用〇型环将TS密封到该微流体通道装置部分上而形成）的坚 向微流体出入孔。
[0028] 不同于先前提供的其中该腔室从侧面直接进入的系统（参见第0016-0019段）， 这些微流体通道通过坚向微流体出入孔与该组织腔室连接。这种安排容许调整顶层微流体 通道参数（厚度、结构、保压能力等等），不依赖于该组织腔室的形成和结构。由于该组织 腔室的保压能力也是测定时间的决定因素，该具有TS的微流体腔室的密封是很关键的。在 此，该密封是通过定制的〇型环使用聚二甲基硅氧烷（PDMS)成型而产生的。利用这种设计， 所施加的密封力仅仅影响腔室厚度和该腔本身的保压能力，并且这种密封机制从该微流体 系统的其余部分机械地解耦。
[0029] 此外，这种设计允许该腔室高度大大低于先前的系统（参见第0016-0019段）。具 体而言，该组织腔室高度仅由相对于〇型环凹槽的该〇型环厚度的选择以及施加于TS的密 封力决定。事实上，该腔室的厚度是一个关键参数，因为它直接影响在IHC过程中使用的试 剂的孵育时间，这是由较大抗体分子的缓慢扩散所要求的。当该装置与TS整合时，形成具 有在50 y m与100 y m之间的厚度的组织腔室。对于普遍使用的抗体，像小鼠抗人IgG分子， 我们已经计算出1分钟的孵育时间需要小于100Um的腔室高度。另一方面，降低腔室高度 至低于50 y m是可能的，但是可能潜在地导致在高压充填与洗涤周期过程中组织从TS的脱 离，并且可能增加总流持续时间。
[0030] 形成这样的浅流体腔室的能力对于将主要转运机制从扩散转换成平流是关键的。 改变该腔室中的试剂的主导转运机制对于防止扩散控制的反应是关键的，这些反应损害了 固定靶标的成比例的染色并且致使定量分析不准确。通过将流体流如在图2中所示导向到 该整合的TS的表面，不仅最小腔室高度，而且该微流体出入孔的设计，都对准确定量产生 影响。该流体流的这种方向使得能够进行这些试剂向组织表面的平流介导的转运，并且允 许免疫组织化学反应在反应控制方案下发生。
[0031] 为了将该装置的可用的染色区增加到100%，必须实现具有16mm乘以16mm维度的 大腔室。在这种腔室内部的均匀流体分布对于每单位时间向每个组织部分递送相等量的试 剂和洗涤溶液是关键的。因此，我们采用了分布的微流体通道网络结构，该结构使得整个腔 室的流量均衡。图3显示了在顶层中产生的分布的网络通道以及还有该微流体出入孔安排 的俯视图。这些微流体出入孔的安排旨在实现该腔室内部的试剂的均匀分布。另一方面， 该分布的微流体通道网络结构保证了试剂均等地递送遍及该组织腔室。在原则上，人们可 以通过调整该腔室的大小、相应的微流体通道和孔安排而将该腔室面积增加到25mm乘以 50mm〇
[0032] 图4显示了在具有分布的网络通道的组织腔室中的对流的有限元法（FEM)模拟， 这些通道是针对50iim腔室高度（COMSOLKMultiphysics)的lOyL/s流速的。这种 模拟表明，在缓冲液洗涤2. 5s之后，在最坏的情况下，所达到的先前试剂的浓度仅为其初 始浓度的1〇_12。因此，我们期望没有会需要数量级更高的洗涤和充填时间的死表面位置。 如在图4中的FEM模拟给出的，只有分布的网络通道与足够薄而被视为二维度的组织腔室 结合时，分布的网络通道才有效地运作。虽然先前的运作显示出相似的微流体通道网络结 构（参见第0016-0019段和图1)，它们的截面结构阻止了这些试剂经由平流直接供应到TS 表面。也就是说，这些试剂递送到该腔室的与该组织表面的位置相对的顶侧，并且这些试剂 向该组织表面的转运完全受到扩散的支配。相比之下，具有机械脱耦的组织腔室和经由微 流体出入孔连接到该腔室的微流体通道网络的本装置展现了该模拟的平流转运的所有优 点（参见第0037-0038段和图8)。
[0033] 该整合的装置截面显示在图5中，其中该系统由为了易于整合的粗机械加工的 (macro-machined)接头和为了微流体和组织染色的微机械加工的（micromachined)芯片 组成。该微流体装置与该接头部分永久整合，而仅有这些TS在分析之间被组装和拆卸。这 种构型对于接近具有标准商业流体接头的微流体装置是需要的。而且，这种外部管道的整 合容许利用高于200巴的流体压力。
[0034] 能够实施连续处理而在试剂之间没有交叉污染的系统对于可靠地实现生物医学 染色方案是相当重要的。在我们的例子中，具有3种试剂的IHC测定对于每个靶标是需要 的。出于这个目的，在接头结构中制成了一种微流体入口小道（lane)，这种结构能结合可商 购的单向止回阀。这些止回阀在防止交叉污染中以及在TS的组装和拆卸过程中阻断外部 流体系统中是至关重要的。在操作过程中，将压力施加到所需要的试剂的注射器上，从而打 开相应止回阀并释放在该组织腔室内部的流体，而其他注射器保持未加压，因此与该组织 腔室隔离。这样的整合还提高了处理量，因为在每一置换中我们防止了外部微流体系统的 大的死体积的再充填。在另一方面，如果进行了微型止回阀到该装置中的整合，则死体积和 流动时间可以降低更多。 微细加工
[0035] 在本发明中，通过微流体沟的多步骤深反应离子蚀刻（DRIE)以及随后的与涂覆 有如在图6中例示的聚一氯对二甲苯（ParyleneC)的派热克斯（Pyrex)晶片的粘结来制 造这些微流体装置，以便实现更高的精确度和爆破压力。1)采用具有2.5 湿氧化物的 4英寸硅片作为开始。2)然后，旋转5iimAZ9260光致抗蚀剂，用DNC掩模暴露，并显影形 成这些通道。用RIE(阿尔卡特（Alcatel)601E)蚀刻在下面的氧化物。3)剥离该抗蚀剂， 并且使用5iim的AZ9260光致抗蚀剂（微量化学（MicroChemicals)GmbH公司，德国）和腔 室掩模实现另外的光刻步骤。在光刻之后，以两个步骤对前侧进行DRIE蚀刻（阿尔卡特 (Alcatel)601E)。这是为了形成不同高度的通道和腔室。首先，将该腔室蚀刻为lOOym的 深度并且将该抗蚀剂剥离。4)在抗蚀剂剥离之后，经由在第一个步骤中的图案化的硬掩模 将这些通道蚀刻。根据设计，蚀刻的深度在50ym与200ym之间变化。5)随后，将这个晶 片通过低应力聚一氯对二甲苯（Parylene-C)粘结程序粘结到2iim的聚对二甲苯涂覆的派 热克斯（Pyrex)晶片上。注意的是，在这个步骤中还可以使用阳极粘结，但这可能引起更 高的应力和裂缝。6)在粘结之后，从具有8iim厚AZ9260抗蚀剂的硅侧对粘结堆（bonded stack)施用另外的光刻步骤。稍后，实施一个另外的DRIE步骤，直到达到该腔室时为止， 这也用来产生用于0型环附着的凹槽。最后，剥离该抗蚀剂。通过划切该晶片结束该加工。 图7(a)显示了在加工和划切之后在该装置的顶层中的微流体通道。图7(b)显示了微流体 出入孔连同放置该0型环的凹槽，这些出入孔位于该装置的底侧。
[0036] 在本发明中使用的材料和微加工技术消除了先前的由于使用PDMS所致的缺点。 Si和Si02具有比PDMS高得多的杨氏模量，使得这些微流体通道在更高的流体压力下抵抗 变形，并允许施加高达16MPa的流体压力（A.T.塞弗蒂里克（Ciftlik)等人，实验室芯片 (LabChip)，第12卷，第396-400页）。当进行比较时，PDMS制造的系统限于大约0. 7MPa 的压力（M.A.艾丁斯（Eddings)等人，微机械微工程杂志（J.Micromech.Microeng.)， 18,pp. 067001)。因此，在我们的设计中，流动特征将是稳定的，即使在可能涉及IHC方案的 高得多的压力和流速下也是如此。此外，由于所使用材料的高刚性以及上文解释的机械脱 耦（参见第0028段），为了更好地密封组织载玻片所需要的力并不强加任何约束，并且这 些微流体通道保持完整。因此，由于这些通道的变形所致的在设计维度和流速方面的变化 仍然是可忽略不计的。因而，精确的方案应用是可能的，并且当用于诊断时，这种精确度保 证了再现性。此外，本装置可以在高达200°C下运行，并且就与可能涉及IHC方案中的这些 试剂的化学相容性而言是稳固得多。而且，它接受标准的组织切片载玻片形状，不需要任何 定制，并且作为诊断装置的这种结构的商业化对于在临床实践中使用的标准是直观的。图 7(c)显示了标准TS到一体化系统中的结合，并且图7(d)显示了具有该形成的组织腔室的 一体化系统。 装置性能和临床结果 浓度响应时间和均匀性表征
[0037] 通过从使用开放源ImageJ软件获得的图像分析该组织腔室的强度分布图来表征 浓度。为了分析，将具有5帧/秒的视频转化为灰阶。首先，通过计算具有40UL/S流速的 持续长时间（100smin)的整个腔室的平均强度，以实验方式找到最大浓度强度（MxCI)。类 似地，在流动PBS缓冲溶液之后，以实验方式找到最小浓度强度（MnCI)。这两个值用来将记 录在实验中的强度归一化，并且归一化的值用作试剂浓度C，其范围在0到1之间。稍后， 我们应用了试剂和缓冲溶液，这两者都应以方波波型的形式应用，具有16s的周期和50% 的占空比，但是具有180°的相移。根据所得视频，研究了在组织腔室的不同区域中的浓度 变化的响应时间、以及平均化的行为。生成的响应时间曲线用来评估我们装置的可能时间 性能。因此，我们在C和1-C的对数图中使用了直线拟合。这些拟合用十倍数（decades)/ 秒（dec/s)给出了充填和洗涤性能，这是用于计算对给定的充填/洗涤纯度所需要的洗涤 和充填时间的指标。另一方面，通过将组织染色区的像素直方图的标准差分成在完成充填 和洗涤的瞬间的照相机像素深度，计算了整个组织腔室的浓度均匀性。
[0038] 响应时间和均匀性测量的曲线图在图8中给出。图8(c)显示了位于在如所指示 的腔室的入口、中间和出口周围的不同组织腔室区域的浓度响应。虽然在入口和出口之间 的浓度响应存在着明显的滞后，试剂施用的总时间是相同的。这对于结果的再现性是相当 关键的，因为组织的某些区域的延长暴露或短时暴露于抗体和染色可以导致假靶标表达水 平。我们还观察到整个腔室的平均强度非常接近于在该腔室中部的测量值。因此，对于需要 组织切片的特定部分的高光学倍率的情况，人们可以使用该腔室的中部，因为它的其余部 分以任何方式都不能被监测。通过将整个组织腔室平均化计算出的C和1-C的对数图在图 8(a)和（b)中给出，其中最佳直线拟合斜率的平均值是针对洗涤和充填周期而示出的。观 察到-0. 40dec/S的充填性能，这意味着需要5s的充填来实现在注射器内部的试剂浓度的 99%。类似地，洗涤性能为-0. 32dec/S，指示7s的缓冲液足以将浓度降低至初始值的1% 以下。我们认为，在这两者之间的差异是由于分子的扩散所致，这有利于充填周期，但损害 了洗涤。图8(d)显示了在充填状态下的腔室的像素直方图，展示了遍及该腔室在5s的充 填之后2%的浓度不均匀性。 在癌组织上的生物标志物的比例检测的孵育时间的优化
[0039] 已经展示了该微流体腔室的时间响应，我们致力于分析在人类乳腺癌组织上的诊 断性生物标志物。基于先前的分析，需要开发序贯方案，以及在阳性病例中具有再现性高的 信背（SBR)比的产生荧光图像的最佳孵育时间。在这项优化研究中，我们使用了从相同肿 瘤切除术样品邻近地切割的7个具有强表达的HER2/neu阳性组织切片，由于用来建立孵育 条件和孵育时间的一级抗体和二级抗体的不同孵育时间（tin。）呈对数变化，取孵育的2"分 钟，其中11 = -2、-1、0、1、2、3、4，从而评估孵育时间对从15秒到16分钟所得信号的作用。 这与装置设计结合，表明在充填之后从中心到组织切片表面的1分钟扩散持续时间，并且 以上孵育时间的集合构成了在理论值周围的呈对数分布的病例。
[0040] 图9显示了方案时间的优化。（a)针对一级抗体和二级抗体的不同孵育时间 (tin。)，从相同肿瘤切除术样品邻近地切割的HER2/neu阳性组织切片获得的荧光强度。（b) 通过取（a)的信号与背景值的比率获得的关于孵育时间的信背比（SBR)。在孵育的前2分 钟期间，SBR的主要部分呈线性发展，表明免疫反应处于这个时间表上的动力学制度中。（c) 每额外孵育时间的SBR变化率。该变化率为在tin。= 2分钟时的最大值，并且当组织切片 经受更长的孵育时间时开始下降。（d)在针对表达靶标抗原的相同组织切片上的不同区域 计算的信号值水平中的变异系数（CV)的研究。具有大约2%的变异系数（CV)的可再现信 号均匀性是在2分钟和8分钟之间的孵育时间（tin。）观察到的。
[0041] 在组织制备和抗原修复之后，将显示在表1中的方案应用于组织切片上，其中试 剂充填和缓冲液洗涤时间分别选择为5s和7s。将该方案应用于MTP上之后，取出显微镜 载玻片，加盖玻片，并且用扫描荧光显微镜完成了图像采集。随后，使用这些图像通过取在 图像像素上的荧光强度平均值来获得信号值，这些图像像素与位于癌细胞的细胞膜中的 HER2/neu表达区域相对应。类似地，通过将在其余像素上的荧光强度平均化获得背景值 (图9(a))。针对如在图9(c)中显示的每一孵育时间计算出的SBR图，其中可以看出，当我 们对于HER2/neu病例增加孵育时间64倍时，即使对于n= -2的方案，该信号是可检测的， 并且SBR仅仅从1. 2提高到1. 90。在孵育的前2分钟期间，SBR的主要部分呈线性发展，表 明免疫反应处于这个时间表上的动力学（反应控制的）方案中，并且之后受到扩散的控制。 我们还研究了在针对表达靶标抗原的相同组织切片上的不同区域计算的信号值水平中的 变异系数（CV)。观察到可再现的信号均匀性，并且，尽管随着时间降低，在n= 1(图9(d)) 之后CV保持稳定。
[0042] 我们还选择了n= 1(2分钟的孵育时间）的方案，作为在我们的临床研究中使用 的最终方案。主要原因在于，对于1，免疫反应被视为处于动力学制度中，并因此在这 个时间表中的孵育将产生与组织切片上表达的抗原的量成线性比例的荧光信号。其次，SBR 增加率是最大的，直到n= 1时为止，并且当组织切片经受更长的孵育时间时，它开始下降， 因此，当使用n=l时，每孵育时间的SBR保持最大。（图9(c))。我们可以得出结论的是， n= 1的方案是最优的，因为它是这样一种方案，其中免疫反应处于具有最大SBR增益而且 在信号水平中的最小可实现的CV的动力学制度中。这直接转换成4V2分钟的总方案时间。
[0043] 为了与先前的IHC技术进行定量技术性能比较，我们设计了品质因数，其被定义 为每试剂体积、分析时间和试剂成本的染色面积。表4将这些结果列在表格中，表明在时间 上的将近100倍的提高以及相对于常规技术的1000倍的总体提高。
[0045] 在降低每靶标所花费的总时间的试图中，我们还对多路方案的可行性提出了质 疑。使用了一级抗体与二级抗体的混合物来靶向一种以上的受体，进而减少了在IHC测定 中每靶标的总时间。表2显示了这样一种方案的时间设置，将其应用于我们的乳腺癌组织 切片。虽然具有相同的总时间，每靶标的时间已经减少至非多路方案的一半。图10显示 了使用具有我们的系统的免疫组织化学进行的乳腺癌生物标志物人类表皮生长因子受体 (HER2/neu)和雌激素受体（ER)的示例性多路荧光检测。使用具有微流体组织处理器的免 疫组织化学进行乳腺癌生物标志物人类表皮生长因子受体（HER2/neu)和雌激素受体（ER) 的多路荧光检测。该检测是用优化的方案完成的，该方案具有孵育时间2分钟（n= 1)并 且使用针对各自的抗原的一级抗体和二级抗体的混合物。（a)蓝色通道代表结合有DAPI的 核复染，并有助于将细胞核可视化。（b)用单克隆兔抗人一级抗体检测HER2/neu，并且用亚 历克萨-荧光剂（Alexa-Fluor) 594标记的山羊抗兔多克隆IgG二级抗体将其可视化，此处 以红色通道表示。（c)用单克隆小鼠抗人一级抗体（克隆6F11)检测雌激素受体（ER)，并且 用亚历克萨-荧光剂（Alexa-Fluor)647结合的山羊抗小鼠多克隆IgG二级抗体将其可视 化，此处以绿色通道表示。（d)显示了在一起的三个通道。这些图像的宽度相应于eooym 并且是使用扫描荧光显微镜通过6乘以6拼接高分辨图像获得的。 临床研究
[0046] 为了在真实世界环境中测试该开发的MTP系统，我们对从病理学研究所档案检索 的一组76位乳腺浸润性导管癌进行了一系列免疫组织化学反应。在已经在MTP上建立针对 HER2/neu免疫组织化学的最佳实验条件之后，其中对于一级抗体和二级抗体的孵育时间为 2分钟（n= 1)，我们对76位乳腺浸润性导管癌应用了我们的方案。在常规IHC和MTP-IHC 之间的诊断结果的比较显示在图11中。当与常规IHC比较时，MTP-IHC产生了 90%的较少 模糊的结果，并且准确地预测了ISH扩增结果。插图表显示了对于所研究的76个病例的常 规IHC评分和MTP-IHC评分的交叉相关。使用MTP-IHC技术，对于评分（0)和⑴的病例 以及评分（+++)的病例，我们未曾产生单个假阳性或假阴性结果。更重要的是，评分（++) 的模糊病例的数量显著减少，从27例减少到3例（几乎减少了 90% )。通过MTP-IHC将借 助于经典IHC诊断的24例评分（++)的模糊病例评分为（0) /+或（+++)，并且在这些24位 病例中的每一位中，其赋值都与基因扩增状态相对应。最初被诊断为（+++)病例的一个病 例被重新赋值为评分（++)。因此，当使用呈现的MTP-IHC而不是常规的IHC时，最终的诊断 性HER2/neu结果的预测准确性要高得多。 用途的替代领域和拓展领域
[0047] 本发明的流体操作并不仅限于压力驱动流的产生。当该流体流由其他致动机制 (包括但不限于，电动流或热诱导流）诱导时，本装置的创造性（孵育时间的同时减少、在动 力学制度中维持方案反应、导致在所得读出信号与靶标抗原量之间经证实的比例性、以及 由于快速且均匀的流体交换所致的高均匀性）同样适用。例如，存在着采用电动或热诱导 流的其他发明（W0/2011/102801和EP1 974 814)，然而，在这些文献中，创造性在于诱导 流本身的特定电极的某些安排（或设计、形状等）。因此，当与其他技术组合来诱导所述微 通道和所述组织腔室内部的流体流时，这样的在先要求不能限制本发明的用途。
[0048] 类似地，当温度控制系统（不限于但优选通过一体化（金属或聚合物）电极和传 感器和/或通过使其与预热的元件接触来完成）结合在本发明中描述的微流体装置和一体 化系统内时，本装置的创造性同样适用。例如，存在着在微流体系统中采用一体化和/或附 加的温度控制系统的其他发明（US/2005/009101)，然而，在这些文献中，创造性在于构成该 温度控制系统的加热元件和传感元件的某些特征、设计和/或形状。因此，当与在所述微通 道和所述组织腔室内部实现温度控制的技术组合时，这样的在先要求不能限制本发明的用 途。
[0049] 需要温度控制的示例性应用为甲醛固定的石蜡包埋的（FFPE)组织切片的直接处 理。FFPE组织切片的处理需要在芯片上完成去除石蜡（脱蜡）、再水合和抗原修复步骤。事 实上，如果可以在该装置上形成微加热器（电极），这是可能的，因为抗原修复程序通常需 要在大约95°C加热组织。基于染色方案所需要的已知时间，我们可以估计实现这种芯片上 样品预处理所需要的时间。表3总结了芯片上脱蜡和抗原修复方案，表明这样的预处理在 另外的5分钟时期内是可行的。因此，加上染色所需要的2. 5分钟，该装置具有在7. 5分钟 内实现完全处理FFPE组织切片的潜力，而直到现在为止报道的最快的完全处理是"波"机 制（PCT/US2006/015020 和W0/2006/116037)，其具有 70 分钟的方案时间。
[0050] 类似地，当用于固定在腔室内的实体成像的成像系统（不限于但优选地包括光检 测器或光源、或光检测器阵列，可以使用硅微电子技术加工）与本发明中描述的微流体装 置和一体化系统组合时，本装置的创造性同样适用。例如，存在着在微流体背景下采用这样 的成像系统（W0/2010/148252)的其他发明，然而，在这些文献中，创造性在于构成这些成 像系统的这些元件和/或结构的某些特征、设计和/或形状。因此，当与在这些微通道和该 组织腔室内部整合一种成像系统的技术组合时，这样的在先要求不能限制本发明的用途。
[0051] 类似地，当光学部件（不限于但优选地包括透镜、物镜、微透镜阵列、偏振和/或荧 光滤光器，位于光检测器和光源或这些光检测器和光源阵列的前面）与本发明中描述的微 流体装置和一体化系统组合时，本装置的创造性同样适用。例如，存在着在微流体背景下采 用这样的光学元件（W0/2010/148252)的许多其他发明，然而，在这些文献中，创造性在于 构成这些光学系统的这些元件和/或结构的某些特征、设计和/或形状。因此，当与在这些 微通道和该组织腔室内部整合光学元件的技术组合时，这样的在先要求不能限制本发明的 用途。
[0052] 证明了在本发明中描述的装置对于癌症生物标志物的免疫组织化学检测是有用 的，当与常规免疫组织化学比较时，就诊断结果而言具有大大提高的辨别力（正如通过基 因扩增所证实的）（图11)。这通过显著缩短的孵育时间得以解释，其允许获益于控制初始 的第一次孵育分钟数的比例性，其中抗体以高度成比例的方式结合至抗原，具有作为抗体 和抗原浓度的直接函数的恒定结合率。因此，本发明的应用并不限于IHC，而且可以用于可 以致力于在比例性动力学制度下运作的任何表面反应，以便实现与固定在固体载体上的靶 标的范围成线性比例的反应。
[0053] 在本发明中描述的装置利用了坚向出入孔和分布在腔室外周附近的微流体通道 网络的智能构造安排（图3)以及用以保证在低体积的覆盖组织切片的大（16_乘以16_) 而非常浅（小于lOOum)的孵育腔室内的快速、完全、和均匀的生物试剂交换的高压（图 2-8)。以这种方式，由于获得的对流流动，在组织切片上的生物试剂的洗涤和充填时期保持 在5-7秒的绝对极小值，同时在实际孵育期间保证了无流动条件。此外，我们观察到作为孵 育时间的函数的SBR比的增加在初始反应限制的线性制度期间更为突出（图9 (c))，表明在 本装置中的短孵育时间通常足以获得足够强的读出信号，而不必增加检测抗体的浓度。
[0054] FFPE组织的10分钟完全处理时间也与该技术的术中利用的时间表、以及独立的 微型化且自动化的诊断性IHC系统的使用良好拟合。减少死体积、增加系统压力以及实现 均匀的在组织样品上的试剂和缓冲液流有助于减少测定时间，其短至足以被视为在手术过 程中的即时反馈。将固定在标准载玻片上的组织切片机械地夹固到微流体结构上并且可以 在一分钟之内将其置放，这样，仅仅在组装步骤需要改变TS。品质因数比较（表4)揭示，当 与现有技术比较时，本发明可以展现出1000倍的提高。
[0055] 该呈现的技术可通过整合微型显微镜而容易地转化成独立的、完全的免疫组织化 学诊断解决方案。因此，可以完成诊断而不需要另外的基础设施、专门人才，并且几乎不需 要维护。
[0056] 然而本发明并不限于前面论述的实例。 引用的参考文献 瓦妮莎?费尔南德斯（VanesaFernandez)-莫雷拉（Moreira)、泊松（BoSong)、VenkataragavaluSivagnanam、安妮-索菲肖万（Anne-SophieChauvin)、凯若琳 (Caroline)D.B.范德维夫（Vandevyver)、马丁 ?吉斯（MartinGijs)、伊尔卡?海米拉 (IlkkaHemmi丨5)、汉斯-安东?莱尔（Hans-AntonLehr)、和珍-克劳德（Jean-Claude) G.班兹利（Biinzli)，作为用于癌症生物标志物的芯片上实验室检测的多标记的生物结 合的镧系发光螺旋配合物（Bioconjugatedlanthanideluminescenthelicatesas multilabelsforlab-on-a-chipdetectionofcancerbiomarkers) ?分析家（Analyst), 第 135 期，第 42-52 页，2010.B。 安塔?图纳?塞弗蒂里克（AtaTunaCiftlik)、泊松（BoSong)、凯若琳?范德维夫 (CarolineVandevyver)、珍-克劳德?班兹利（Jean-ClaudeBtinzli)、汉斯-安东?莱 尔（Hans-AntonLehr)、和马丁努斯?吉斯（MartinusGijs)，用于癌症组织切片的快速 免疫组织化学生物标志物检测装置（Fastimmunohistochemicalbiomarkerdetection deviceforcancertissueslices)，用于化学和生命科学的微型系统的第14届国际会议 会干丨J(Proceedingsof14thInternationalConferenceonMiniaturizedSystemsfor ChemistryandLifeSciences)，格罗宁根，荷兰，10 月 3 日至 10 月 7 日，2010 年，2010。 金瑕硕S(MinseokS.Kim)、权世容（SeyongKwon)、金泰民（TaeminKim)、李恩淑（Eun SookLee)、朴在均（Je-KyimPark)，使用用于免疫组织化学和免疫细胞化学的多路微流体 平台进行的乳腺癌的定量蛋白质组学图谱（Quantitativeproteomicprofilingofbreast cancersusingamultiplexedmicrofluidicplatformforimmunohistochemistryand immunocytochemistry)，生物材料（Biomaterials)，第 32 卷，第 5 次发行，2011 年 2 月，第 1396-1403 页。 金MS(KimMS)、金T(KimT)、孔S-Y(KongS-Y)、权S(KwonS)、衰CY(BaeCY)等人， 使用微流体多路免疫组织化学平台进行乳腺癌诊断（Breastcancerdiagnosisusinga microfluidicmultiplexedimmunohistochemistryplatform)，PLoSONE5 (5):el0441. doi:10.1371/journal.pone. 0010441，2010。 佩奇?埃里克森（PageErickson)、迈克尔?艾弗曼（MichaelEverman)、迈克尔?贝 尔（MichaelBell)、凯文?埃德伯格（KevinEdberg)、马修?波特克（MatthewBotke)， 用于自动化的快速免疫组织化学的增强流体方法和设备（Enhancedfluidicmethod andapparatusforautomatedrapidimmunohistochemistry)，PCT/US2006/015020， W0/2006/116037,2011。 米歇尔?麦克内利（MichealMcneely)、利斯?阿迪（NisAdey)、马克?施普特（Mark Spute)、爱德华?艾利夫（EdwardAyliffe)等人，用于微流体分界面分类的方法和系 统（Methodandsystemformicrofluidicinterfacingtoarray)，PCT/US02/07113， W0/2002/072264?2002〇 亚瑟?克瓦尔（ArthurQueval)、纳格斯瓦拉R.吉哈塔曼埃尼（Nageswara R.Ghattamaneni)、塞西尔M?佩罗（C6cileM.Perrault)、拉明德尔?吉尔（Raminder Gill)、玛 _亚姆?米萨耶（MaryamMirzaei)、R.安妮?麦金尼（R.AnneMcKinney)和大 卫?容克（DavidJuncker)，用于器官型脑切片的微量灌注的腔室和微流体探头（Chamber andmicrofluidicprobeformicroperfusionoforganotypicbrainslices)，实验室 芯片（LabChip)，2010, 10, 326-334。 伊曼纽尔?德拉马什（EmmanuelDelamarche)、乌特?德雷克斯勒（UteDreschsler)、 和罗伯特?诺齐克（RobertLovchik)，多层微流体探头及其加工方法（Multilayer microfluidicprobeheadandmethodoffabricationthereof)，PCT/IB2010/052018， W0/2010/128483,2010。 伊曼纽尔?德拉马什（EmmanuelDelamarche)、大卫?容克（DavidJuncker)、布鲁 诺?米切尔（BrunoMichel)、和海因茨?施密德（HeinzSchmid)，用于在一种表面上流 动液体的方法和装置（Methodanddeviceforflowingaliquidonasurface)，PCT/ IB2003/005350,W0/2004/050246, 2004。 兰普雷克特?瓦尔特劳德（LamprechtWaltraud)、麦西斯?安东（MathesAnton)、文 策尔?乔治（WenczelGyoergy)、和施特赖特?沃尔夫冈（StreitWolfgang)，用于提供杂交 室的装置和方法（Deviceandprocessunitforprovidingahybridizationchamber)， US/2006/0003440,2006。 乔恩?星崎（JonHoshizaki)、杨沫俊（JoonMoYang)、玛丽亚姆?沙里亚蒂（Maryam Shariati)、大卫?科克斯（DavidCox)、克尔科?希拉诺（KirkHirano)等人，低体积 测序系统及其使用方法（Low-volumesequencingsystemandmethodofuse)，PCT/ US2010/047392，W0 2011/026136,2011。尼尔斯?阿迪（NilsAdey)，分层的微阵列界面装 置（Laminatedmicroarrayinterfacedevice)，PCT/US02/24616，W0/2003/015922,2003。 金基范（GibumKim)、托德?施沃雷尔（ToddSchwoerer)，用于宽面积微流体的微流 体设备（Microfluidicapparatusforwideareamicrofluidics)，PCT/US2008/074865， W0/2009/029845?2009〇 安塔?图纳?塞弗蒂里克（AtaTunaCiftlik)和马丁A.M?吉斯（MartinA.M.Gijs)， 用于高压微流体与CMOS装置整合之后的聚对二甲苯与氮化娃的粘结（Paryleneto siliconnitridebondingforpost-integrationofhighpressuremicrofluidics toCMOSdevices)，芯片上实验室（LabonaChip)，2012, 12 (2) ,396-400.doi:10. 1039/ cllc20727j。 马克A艾丁斯（MarkAEddings)、米切尔A约翰（MichaelAJohnson)和布鲁斯K盖 尔（BruceKGale)，用于微流体装置的最佳PDMS-PDMS粘结技术的确定（Determiningthe optimalPDMS-PDMSbondingtechniqueformicrofluidicdevices)，微机械学和微工 程学杂志（JournalofMicromechanicsandMicroengineering)，2008, 18, 067001。 纳撒尼尔?罗宾逊（NathanielRobinson)和佩尔?埃兰德松（PerErlandsson)，一种 电动流体系统（Anelectrokineticfluidicsystem)，W0/2011/102801，2011。 荷兰皇家飞利浦电子公司（KoninklijkePhilipsElectronicsNV)，一种基于 活性基质原理的微流体装置（Amicrofluidicdevicebaseduponactivematrix principles)，EP1974814, 2008。 盖理?布莱克本（GaryBlackburn)，包含生物通道的微流体装置（Microfluidic devicescomprisingbiochannels),US/2005/009101,2005〇 乔迪?维考卡尔（JodyVykoukal)、戴恩尼M.维考卡尔（DayneneM.Vykoukal)、格雷戈 里P.斯通（GregoryP.Stone)、埃克哈德U.阿尔特（EckhardU.Alt)，用于定量显微成像的 方法和设备（methodandapparatusforquantitativemicroimaging)，W0/2010/148252， 2010〇
【权利要求】
1. 一种生物和化学样品处理装置，该装置 a. 包括一个抗高压的、浅的并且宽面积的微流体腔室，该微流体腔室具有由可拆卸的 载玻片形成的至少一个壁，该载玻片含有诸如固定的实体、生物样品或分子的样品， b. 包括用于将流体注射到所述腔室并且从该腔室收集流体的微流体出入孔的安排， c. 与形成在该腔室外部的入口端口和微流体通道接合， d. 被配置为使得该载玻片可以与该装置接触而形成所述腔室， e. 被适配为在所述腔室的内部以快速的方式优选地在小于15秒之内、并且由于所述 微流体出入孔的安排而以规则或均匀的方式递送和转运流体物质和试剂。
2. 根据权利要求1所述的装置，该装置包括用于在该腔室内部产生流体流，即，诱导入 口与出口之间的压差的压力驱动流发生工具。
3. 根据权利要求1所述的装置，该装置包括用于通过在所述微流体腔室、所述微流体 通道和所述微流体出入孔的任何两个或更多个点之间施加电位差而在该腔室内部产生流 体流的电动流发生工具。
4. 根据权利要求1所述的装置，该装置包括用于在该腔室内部产生流体流，即，通过在 所述微流体腔室、所述微流体通道和所述微流体出入孔的任何两个或更多个点之间经由发 生温差而诱导流体流的热诱导流发生工具。
5. 根据以上权利要求中任一项所述的装置，该装置包括调整和控制局限在所述腔室、 所述微流体通道和所述微流体出入孔中的流体的温度的一个加热元件和一个温度传感器。
6. 根据以上权利要求中任一项所述的装置，该装置结合用硅微电子技术加工的光检测 器和光源或光检测器和光源的阵列，用于固定在载玻片上的实体的数字成像而用于明视野 或荧光检测。
7. 根据以上权利要求中任一项所述的装置，该装置包括位于光检测器和光源或这些光 检测器和光源阵列的前面的微透镜阵列、偏振和/或荧光滤光器。
8. -种使用如在关于以上权利要求的任一项中定义的装置进行的生物和化学样品处 理的方法，该方法包括以下步骤： a. 手工或自动地获得在一侧或多侧上具有实体的所述载玻片 b. 通过手工或自动地将所述载玻片结合到所述微流体装置上建立所述形成的腔室 c. 使在所述载玻片上的实体在预定时期期间并且以预定温度依次经受合适的流体或 反应物质 d. 使在所述载玻片上的实体在预定时期期间并且以预定温度依次经受合适的用于指 示检测的流体或反应物质。
9. 根据权利要求8所述的方法，该方法包括以下之一： a. 提供少于10分钟的总组织化学检测 b. 提供少于5分钟的组织化学检测 c. 提供少于2. 5分钟的组织化学检测 d. 提供少于10分钟的细胞化学检测 e. 提供少于5分钟的细胞化学检测 f. 提供少于2. 5分钟的细胞化学检测 g. 提供少于2分钟的染色过程 h. 提供少于2分钟的石蜡溶解或蚀刻过程 i. 少于5分钟的抗原修复过程 j. 少于5分钟的表位修复过程 k. 少于5分钟的热诱导抗原修复过程 l. 少于5分钟的热诱导表位修复过程。
10. 根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于相对短的处理和流体交换时间，以此 方式来减少非特异性指示、假阳性和模糊结果。
11. 如在权利要求1到7的任一项中定义的装置的用途，用于使在该载玻片的表面上的 实体在预定时期期间经受合适的流体或反应物质或任何合适的流体反应物质的序列，所述 用途包括以下操作的至少一个： i. 一个组织化学过程 ii. 一个细胞化学过程 iii. 一个免疫组织化学过程 iv. -个免疫细胞化学过程 v. -个免疫组织荧光过程 vi. -个免疫细胞荧光过程 vii. -个原位杂交过程 viii. -个荧光原位杂交过程 ix. -个抗原修复过程 X. 一个表位修复过程 Xi. -个热诱导抗原修复过程 xii. -个热诱导表位修复过程 xiii. -个石蜡溶解或蚀刻过程 xiv. -个染色过程。
【文档编号】B01L3/00GK104284725SQ201380022147
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2013年2月15日 优先权日:2012年2月27日
【发明者】阿塔·图纳·奇夫特里克, M·吉斯 申请人:洛桑联邦理工学院