生物触酶制剂及其制备方法与在除甲醛除异味中的应用与流程

本发明涉及除甲醛除异味的方法，特别涉及生物触酶制剂在除甲醛除异味方面的应用。

背景技术：

近年来，随着人们生活水平的提高及生活节奏的加快，环境污染问题越来越受到人们的重视。继煤烟型、光化学烟雾型污染之后，以“室内空气污染”为标志的第三污染时期已经开始影响人们日常生活。据统计，人类90％的时间处于室内工作学习生活，其中的60％的时间处于自己家中。甲醛因来源广、毒性大、污染时间长等原因，已经成为重要的日常污染物之一。而室内甲醛的源头来自于室内装修，据有关国际组织调查发现，全世界每年有280万人直接或间接死于装修污染，世界上30％的新建和重修的建筑物存在着有害身体健康的毒害气体。对于处于快速发展中的中国来说，污染更为严重。除此之外，家庭生活中出现的二次烟雾、下水道反味、垃圾异味等也成为影响人们生活健康的主要问题。据中消协公布的一项调查结果显示：北京地区室内空气检测结果表明甲醛超标率达70％以上，最高超标量达40倍。因此，如何提高室内空气品质，保证居民身体健康，已经引起有关部门重视及全国人民的广泛关注。

为消除甲醛及其它异味源污染，国内外学者采取了多种方法进行治理，如光触媒法、空气触媒法、二氧化钛—活性炭纤维合成技术及等离子电催化空气净化技术等。以上技术主要集中于物理和化学方法，随着科技的进步，生物方法也越来越受到研究者的关注。生物触酶是特定微生物或其代谢产物的总称，可氧化分解、利用相应有机化合物或无机物，具有防污、杀菌和除臭功能。

技术实现要素：

本发明的目的在于通过生物方法消除日常生活环境中甲醛及其它有害气体，进而提高人们生活空气品质的产品。

为了达到上述目的，本发明提供了一种应用微生物代谢产物及天然植物提取物制备的生物触酶制剂。

上述生物触酶制剂包括：由混合浓缩粗酶提取物、大豆氨基酸提取液及稀释保护剂按体积比2～5:1～5:100混合组成；

所述混合粗酶提取物为乳酸链球菌浓缩粗酶提取物、嗜热乳链球菌浓缩粗酶提取物、罗伊氏乳杆菌浓缩粗酶提取物按比例1:1:1混合构成；

所述乳酸链球菌浓缩粗酶提取物、嗜热乳链球菌浓缩粗酶提取物、罗伊氏乳杆菌浓缩粗酶提取物的制备方法为：

(1)将乳酸链球菌、嗜热乳链球菌、罗伊氏乳杆菌使用LB培养基在37℃进行活化，得到浓度为10⁸CFU/mL的乳酸链球菌微生物活化液、嗜热乳链球菌微生物活化液及罗伊氏乳杆菌微生物活化液；

(2)将步骤(1)制得的乳酸链球菌微生物活化液、嗜热乳链球菌微生物活化液及罗伊氏乳杆菌微生物活化液分别在LB培养基中接种，接种量为所述LB培养基体积的1～3％，培养24h，摇床转速为140rpm，得到乳酸链球菌种子液、嗜热乳链球菌种子液、罗伊氏乳杆菌种子液；

(3)以脱脂乳为培养基，将步骤(2)制得的乳酸链球菌种子液、嗜热乳链球菌种子液、罗伊氏乳杆菌种子液分别进行连续发酵，发酵温度为30～37℃，发酵时间为40～48h，得到乳酸链球菌发酵液、嗜热乳链球菌发酵液、罗伊氏乳杆菌发酵液；

所述种子液的接种量为所述脱脂乳培养基体积的5％；

(4)将步骤(3)制得的乳酸链球菌发酵液、嗜热乳链球菌发酵液、罗伊氏乳杆菌发酵液分别过200目筛后，采用凝胶层析柱和离子交换层析柱进行提纯，随后采用200KD超滤膜包进行超滤，收集截留液；将所述截留液与4℃预冷乙醇按体积比1:2.5混合，在4℃条件下、10000r/min离心10min，除去上清液，收集沉淀；将所述沉淀与0.1mol/L的醋酸缓冲液按质量体积比1:50～100(g/mL)的比例混合至沉淀溶解，即得乳酸链球菌浓缩粗酶提取物、嗜热乳链球菌浓缩粗酶提取物、罗伊氏乳杆菌浓缩粗酶提取物；

所述稀释保护剂为甘露醇、可溶性淀粉、乳糖、海藻糖中的一种或几种组合，以水为溶剂稀释，得到稀释保护剂。

优选情况下，所述稀释保护剂的质量配比为2～4％甘露醇，1～2％乳糖，1～3％可溶性淀粉、2～5％海藻糖，86～93％水。

本发明还提供了上述生物触酶制剂的制备方法，具体步骤如下：

S1、乳酸菌浓缩粗酶提取物的制备：

(1)将乳酸链球菌、嗜热乳链球菌、罗伊氏乳杆菌使用LB培养基在37℃进行活化，得到浓度为10⁸CFU/mL的乳酸链球菌微生物活化液、嗜热乳链球菌微生物活化液及罗伊氏乳杆菌微生物活化液；

(2)将步骤(1)制得的乳酸链球菌微生物活化液、嗜热乳链球菌微生物活化液及罗伊氏乳杆菌微生物活化液分别在LB培养基中接种，接种量为所述LB培养基体积的1～3％，培养24h，摇床转速为140rpm，得到乳酸链球菌种子液、嗜热乳链球菌种子液、罗伊氏乳杆菌种子液；

(3)以脱脂乳为培养基，将步骤(2)制得的乳酸链球菌种子液、嗜热乳链球菌种子液、罗伊氏乳杆菌种子液分别进行连续发酵，发酵温度为30～37℃，发酵时间为40～48h，，得到乳酸链球菌发酵液、嗜热乳链球菌发酵液、罗伊氏乳杆菌发酵液；

所述种子液的接种量为所述脱脂乳培养基体积的5％；

(4)将步骤(3)制得的乳酸链球菌发酵液、嗜热乳链球菌发酵液、罗伊氏乳杆菌发酵液分别过200目筛后，采用凝胶层析柱和离子交换层析柱进行提纯，随后采用200KD超滤膜包进行超滤，收集截留液；将所述截留液与4℃预冷乙醇按体积比1:2.5混合，在4℃条件下、10000r/min离心10min，除去上清液，收集沉淀；将所述沉淀与0.1mol/L的醋酸缓冲液按质量体积比1:50～100(g/mL)的比例混合至沉淀溶解，即得乳酸链球菌浓缩粗酶提取物、嗜热乳链球菌浓缩粗酶提取物、罗伊氏乳杆菌浓缩粗酶提取物；

经酶学性质分析，确定粗酶提取物主要包括有机酸合成酶系、乳酸脱氢酶系、分解亚硝胺酶系、脂肪分解酶系等。

S2、大豆氨基酸成分提取：

(1)将大豆与水按质量体积比为1:4～6(g/L)的比例混合，常温浸泡4～8h，研磨、过200目筛，获得大豆匀浆；

(2)随后采用超声破碎方式将步骤(1)制得的大豆匀浆破乳分层，超声功率为140～160W，提取温度为46～50℃，提取时间为41～50min，得到破乳匀浆；将所述破乳匀浆在8000r/min条件下离心20～30min，去除上层油脂，收集水相，即为大豆氨基酸成分提取液；

将(2)中的氨基酸提取液通过氨基酸分析仪进行成分分析，主要包括甘氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、赖氨酸、谷氨酸等。

S3、稀释保护剂制备：

稀释保护剂的成分包括甘露醇、可溶性淀粉、乳糖、海藻糖中的一种或几种组合，以水为溶剂稀释，得到稀释保护剂；

优选情况下，所述稀释保护剂的质量配比为2～4％甘露醇，1～2％乳糖，1～3％可溶性淀粉、2～5％海藻糖，86～93％水。

S4、将步骤S1制得的乳酸链球菌浓缩粗酶提取物、嗜热乳链球菌浓缩粗酶提取物、罗伊氏乳杆菌浓缩粗酶提取物按1:1:1混合，得到混合粗酶提取物；

将所述混合粗酶提取物与步骤S2制得的大豆氨基酸成分提取液、步骤S3制得的稀释保护剂按体积比2～5:1～5:100混合，得到生物触酶制剂。

在考虑产品生物活性、投入成本与产出效益比的情况下，本发明所涉及的三种乳酸菌的粗酶提取物及氨基酸提取物与稀释保护剂的调配体积比例为2～5:1～5:100。

本发明所涉及的乳酸菌酵素来自于常见的工业微生物如乳酸链球菌(Streptococcus lactis)、嗜热乳链球菌(Streptococcus thermophilus)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)。

本发明所涉及的氨基酸提纯物来自于大豆等原料。

本发明还提供了上述生物触酶制剂的应用，用于除甲醛及异味。

优选方式下，所述除甲醛及异味的具体操作步骤为将制得的生物触酶制剂装罐、喷涂；

喷涂量≥10mL/m³，喷涂距离距目标物体表面距离为30～40cm。

将本发明生物触酶制剂应用于去除生活环境中甲醛及其它异味源的污染，营造清新无异味环境，其中喷涂量≥10mL/m³，喷涂距离距目标物体表面距离为30-40cm，喷涂过程中如有流淌现象，用抹布涂抹均匀即可。本发明生物触酶制剂可直接从异味的根源进行吸附、分解并清除日常家庭生活中存在的各种毒害气体。

经皮肤刺激实验证明其安全、无毒副作用，并对甲醛、氨气、厨房异味有很好去除作用，该产品有望成为清洁室内环境的新型生物制剂。

本发明生物触酶制剂经小鼠安全性实验，饲喂环境喷涂一日两次，喷涂量不少于10mL/m³，对照组给予等量纯净水喷涂，连续给予20天后，将小鼠脱颈处死，尸检，其肺部、肝脏、肾脏、腹腔均未发现病变症状，初步验证本发明生物触酶制剂的安全性。

本发明的生物触酶制剂经第三方权威机构检测(说明书附图2和3)，具有清除甲醛、氨、异味的功能。本发明采用的是微生物代谢产物及天然植物氨基酸提取物，安全、绿色、无公害。本发明的制备方法可有效地提取获得相应的目标产物，且对目标产物具有明显的保护作用。同时，本发明为液体制剂，便于运输、保藏、应用。

本发明的技术创新在于：

1.本发明可清除装修材料、家具、地毯、窗帘织物等释放的甲醛及生活垃圾中释放的氨等异味，提高环境质量。

2.本发明采用的是微生物的代谢产物及大豆的氨基酸提取物，可防止微生物对生活环境造成的二次污染，且大豆原材料成本低廉，氨基酸成分易提取。

3.本发明中含有大量无菌去离子水，成本低廉，喷洒目标环境可提高湿度，增加环境舒适度，且使用便捷。

4.本发明经第三方实验证明安全无毒。

附图说明

图1为本发明生物触酶制剂的瓶装物样品

图2为本发明生物触酶制剂去除甲醛的检测报告

图3为本发明生物触酶制剂去除氨的检测报告

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实验中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂、材料、菌种等，如无特殊说明，均可从商业途径获得，或可以通过常规方法确定。

实施例1

本实施例提供了一种生物触酶制剂的制备方法，该生物触媒制剂命名为KPS生物触酶，属于环保工程领域。

S1、乳酸菌发酵产物中原酶液的提取

将本发明所涉及的乳酸链球菌、嗜热乳链球菌、罗伊氏乳杆菌等使用LB培养基在37℃进行活化，取活化后的乳酸链球菌、嗜热乳链球菌、罗伊氏乳杆菌等微生物各2mL按2％接种量分别在200mL LB培养基中培养过夜，摇床转速为140rpm，获得以上菌株的种子液。将以上获得的种子液分别在液体自动连续发酵罐中进行自动连续发酵，发酵温度为37℃，发酵时间为48h，发酵体积为10L，培养基成分为脱脂乳。48h后，分别将每种乳酸菌发酵液经5层纱布过滤后用再滤纸过滤，随后采用一体化超滤设备进行超滤，去除杂质，得到代谢产物的超滤液。按超滤液:乙醇的体积比1:2.5添加预冷乙醇，在4℃条件下10000r/min离心10min，除去上清液，用适量的0.1mol/L醋酸溶液溶解沉淀，即得浓缩粗酶液。

S2、大豆中活性氨基酸的提取

将大豆原料按1:5比例添加水后，常温浸泡8h，通过砂轮磨浆机研磨，过200目筛，获得匀质白色豆浆。

随后采用超声破碎方式将匀浆破乳分层，8000r/min离心30min，去除上层油脂，水相即为含有氨基酸成分的提取液。

采用分光光度法确定氨基酸提取含量。采用三因素三水平(33)正交实验设计进行提取工艺优化，如表1所示。

采用SPSS(Version 12.0)统计软件进行实验结果极差分析和方差分析。结果显示对氨基酸提取影响的主次顺序为超声功率＞提取温度＞提取时间，在超声功率为140-160W，提取温度为46-50℃，提取时间为41-50min时，提取液成分中的氨基酸总量最高。

表1正交试验因素水平表

S3、制备稀释保护剂

本实验中采用的粗酶制剂保护剂为甘露醇、可溶性淀粉、乳糖、海藻糖等，稀释剂为去离子水。

其中，保护剂成分均设为三个梯度，采用4因素3水平(34)正交实验设计对保护方案进行工艺优化，如表2所示。采用SPSS(Version 12.0)统计软件进行实验结果极差分析和方差分析。

结果显示，保护剂的最优配方为2％-4％甘露醇，1％-2％乳糖，1％-3％可溶性淀粉、2％-5％海藻糖。

采用相同方法确定浓缩粗酶提取物及氨基酸提取物与稀释保护剂的调配比例为2～5:1～5:100。

混合后的KPS生物触酶制剂为白色透明状液体，如附图1所示。

表2正交试验因素水平表

应用例1：KPS生物触酶降解甲醛及氨试验

该试验进行单位为辽宁鑫磊检测技术有限公司，如附图2和3所示。检测依据为GB/T18883-2002《室内空气质量标准》和GB/T18204.25-2000(酚试剂分光光度法)。检测设备采用分光光度计、大气采样仪、气象色谱仪。试验方法如下：在两个密闭的1.5m³的测试舱中进行对比实验，分为空白对照舱与样品舱；在3张1m³的纸基质上，将本发明产品试样喷涂三遍，第一遍自然晾干后在喷涂第二遍，随后进行第三遍喷涂，然后将3张处理好的基质悬挂于样品舱内；将甲醛或氨释放源分别放于样品舱与空白舱内，开启风扇，使释放源与两舱内空气充分均匀混合，随后关闭风扇，对两个实验舱进行采样并测定甲醛或氨初始浓度值；48h后，采样测定两舱内甲醛或氨浓度值。其中三种乳酸菌粗酶提取物质量为1:1:1，稀释保护剂成分为2％甘露醇，1％乳糖，2％可溶性淀粉、3％海藻糖、92％去离子水，且浓缩粗酶提取物、氨基酸提取物及稀释保护剂质量比为2:1:100。检测结果如表3所示，该结果表明采用本发明可在48h内去除相应环境中的甲醛及氨的含量，从而保证环境清洁安全。

表3KPS生物触酶制剂降解甲醛和氨的试验结果

应用例2：皮肤刺激性试验

该试验在上海通标标准技术服务有限公司进行，测试方法根据中华人民共和国卫生部《消毒技术规范》2002版，报告编号为SHCPCH151105347.1。实验动物为普通级新西兰白兔3只，体重2.0-3.0kg，由上海科硕实验动物有限公司提供，合格证号：SCXK(沪)2012-0026。动物饲料由嘉善晨晨饲料有限公司提供，批准文号：浙饲证(2014)06017。实验环境为普通级兔房，合格证号SCXK(沪)2014-0020，环境温度为18-23℃，相对湿度为45％-65％。实验步骤如下：试验前24h，去除实验动物背部脊柱两侧部位毛发，避免损伤皮肤，去毛范围为3cm×3cm；取0.5mL本发明产品样品直接贴敷于测试部位，采用封闭试验，4h后去除敷料，用温水清洗接触部位。分别于清除受试物后1、24、48和72h观察皮肤的红斑和水肿反应。其中三种乳酸菌粗酶提取物含量为1:1:1，稀释保护剂成分为2％甘露醇，1％乳糖，2％可溶性淀粉、3％海藻糖、92％去离子水，且浓缩粗酶提取物、氨基酸提取物及稀释保护剂质量比为2:1:100。皮肤刺激强度等级如表4所示，实验结果如表5所示，该结果表明施用本发明对人体皮肤无害，具有施用安全性。

表4皮肤刺激强度等级

表5KPS触酶制剂对皮肤刺激反应试验结果

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。