本发明涉及血液净化
技术领域：
，更具体地，涉及一种包膜并共价固定肝素的血液灌流吸附剂及其制备方法。
背景技术：
：血液灌流吸附剂是一种多孔和高比表面积的医疗耗材，主要用于中小分子毒素吸附，肝病胆红素吸附及免疫领域致病因子的吸附。目前主要的应用方式有单独的血液灌流模式、血液透析联合血液灌流模式及血浆分离吸附模式。血液灌流吸附剂一般为球形树脂或球形活性炭，在临床使用过程中，血液中的血细胞(如血小板)会粘附聚集在吸附剂表面，造成凝血。此外，吸附剂如果破碎还会脱落微粒，造成微粒栓塞、过敏等不良反应。因此，通常需要在吸附剂表面包裹一层膜材料来改善吸附剂的血液相容性。虽然包膜能改善吸附剂的血液相容性，但吸附剂的抗凝血能力改善非常有限，吸附剂与血液接触时仍然容易产生凝血。因此，在进行血液灌流时，通常需要在患者静脉注射一定量的肝素，进行全身抗凝，以保证灌流治疗的顺利进行。若肝素用量太大，则可能在体内引起难以控制的出血，甚至造成多器官功能障碍。目前，市场上使用的血液灌流吸附剂用火棉胶包膜，无法将肝素固载到吸附剂上，临床灌流时经常出现凝血现象。因此，开发表面具有抗凝血能力的吸附剂对血液灌流治疗过程中减少肝素用量、提高治疗安全性有重要意义。海洋生物贻贝通过分泌具有强黏附性的蛋白，可在海水中牢牢黏附在礁石、船体表面。受此黏附蛋白的启发，科学家发现，多酚类的化合物具有类似于贻贝黏附蛋白的性能。例如聚多巴胺和单宁酸在弱碱性条件下能可以在材料表面形成薄膜。在公告号为cn105064040a的中国发明专利中，采用多酚类化合物(多巴胺、单宁酸)在一种多孔疏水材料表面粘附进行亲水性改性。但这种多酚类化合物在材料表面的粘附有两个缺点：(1)粘附不牢固。研究表明，同时含有多酚和多胺基团的化合物，在材料表面的黏附性更强，例如：一个多巴胺分子含有两个酚基和一个氨基，单宁酸分子只含有多个酚基没有氨基，多巴胺在材料表面的黏附性强于单宁酸。(2)粘附的材料表面活性基团不足，不能共价固定足量的肝素。在公告号为cn102614783a的中国发明专利中，就用多巴胺粘附在纳米材料表面改性。在公告号为cn103316600a的中国发明专利中，采用了多巴胺在聚乳酸血透膜表面粘附后固定肝素，该方案中包膜和固载肝素分两步进行，固载前还需要对肝素进行活化，肝素固载率低，工艺复杂。更重要的是，该方案中，肝素钠活化过程不清楚，按照本领域技术人员的理解，仅将肝素钠在酸性条件下活化后，是无法共价固定在聚多巴胺涂覆的聚乳酸膜表面的，必需经过其它修饰和催化剂的作用。技术实现要素：有鉴于此，本发明为克服上述现有技术所述的至少一种不足，采取多酚类化合物和多胺类化合物在血液灌流吸附剂表面共沉积包膜，进一步共价固定肝素，解决吸附剂血液相容性差、微粒脱落问题，同时提高吸附剂的抗凝血性能。为了解决上述存在的技术问题，本发明采用下述技术方案：一种包膜并共价固定肝素的血液灌流吸附剂，由吸附剂浸泡在多酚类化合物和多胺类化合物的水溶液中共沉积包膜后共价固定肝素制得。本发明通过浸泡使多酚类化合物和多胺类化合物在吸附剂表面共沉积包膜，得到包膜牢固且带有多氨基的表面，有利于下一步对肝素分子的共价固定；再通过肝素分子上的羧基与膜表面的氨基反应，共价固定肝素，制得包膜并固载有肝素的血液灌流吸附剂，可以改善吸附剂的血液相容性，减少吸附剂的微粒脱落，还可以减少血液与吸附剂接触时出现凝血的现象，提高吸附剂的抗凝血性能。所述包膜并共价固定肝素的血液灌流吸附剂表面的膜具有如下化学结构：其中，为粘附在吸附剂表面的多酚；n为1～5，分别对应的多胺类化合物为乙二胺、二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、五亚乙基六胺；heparin为肝素。所述吸附剂为球形树脂或球形活性炭。本发明还提供上述包膜并共价固定肝素的血液灌流吸附剂的制备方法：将吸附剂浸泡在多酚类化合物和多胺类化合物的水溶液中，调ph至弱碱性制得包膜并含有氨基的吸附剂；然后在酸性条件及1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)存在的条件下与肝素反应，从而在吸附剂表面共价固定肝素。上述方法通过多酚类和多胺类化合物的共沉积作用，在血液灌流吸附剂表面和孔隙内部包膜，并同时生成多氨基的亲水界面，最后在弱酸性条件和edc、nhs存在的条件下，与肝素分子的羧基反应，在血液灌流吸附剂上共价固定肝素，从而提高血液灌流吸附剂的抗凝血性能。本发明通过改善血液灌流吸附剂的疏水表面，引入氨基提高其亲水性，在吸附剂表面形成多酚/多胺薄膜，有利于提高其血液相容性，减少吸附剂的微粒脱落；特别地，通过在血液灌流吸附剂表面共价固定具有优良抗凝血性能的肝素，能够减少血液与吸附剂接触时出现的凝血现象。本发明所述制备方法简单有效，通过本发明所述制备方法制备的血液灌流吸附剂包膜牢固，固定的肝素不易脱落，适用于目前临床上使用的各类血液灌流产品，提高临床应用的安全性。所述包膜并共价固定肝素的血液灌流吸附剂的制备方法包括以下步骤：s1.将吸附剂浸泡在含有多酚类化合物和多胺类化合物的水溶液中，并加入适量弱碱性物质，调节ph为8.0-10，室温搅拌2～24小时，得到包膜并含有氨基的吸附剂；s2.用生理盐水充分冲洗，并抽干，加入含有肝素盐、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)的酸性缓冲溶液中，室温搅拌2～24小时，使肝素共价固定在吸附剂上；s3.依次用生理盐水和纯化水洗涤，得到包膜并共价固定肝素的血液灌流吸附剂。步骤s1中，所述多酚类化合物包括多巴胺或单宁酸；多胺类化合物包括乙二胺、二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、五亚乙基六胺中的任一种。本发明中多胺类化合物与多酚类化合物均为小分子，有利于进入吸附剂的孔内部，适用于孔径较小(一般小于10nm)的血液灌流吸附剂，从而进一步改善血液灌流吸附剂的生物相容性和抗凝血性能。步骤s1中，所述多酚类化合物的浓度为0.5-5g/l，多胺类化合物的浓度为0.5-5g/l。步骤s1中，所述弱碱性物质包括氨水、磷酸盐、碳酸盐和三羟甲基氨基甲烷(tris)中的一种或多种混合。步骤s2中，所述肝素盐为肝素钠、肝素钙或肝素锂，肝素盐的浓度为0.1-1g/l，edc的浓度为0.05-0.1mol/l，nhs的浓度为0.05-0.1mol/l。步骤s2中，酸性缓冲溶液为pbs缓冲溶液(磷酸缓冲盐溶液)、mes缓冲溶液或柠檬酸缓冲溶液。步骤s2中，酸性缓冲溶液的ph值为4-6。本发明与现有技术相比较有如下有益效果：以上制备方法的实施，在血液灌流上表现为提高了临床治疗效果和安全性。抗凝血试验表明，血液灌流吸附剂经过本发明的制备方法处理后，凝血时间从20分钟延长到50～140分钟，避免了临床灌流时出现凝血的现象，有利于血液灌流产品的临床应用。具体实施方式为使本发明实施的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明作进一步阐述。对本发明实施例中的技术方案是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。下面实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1将0.075g多巴胺盐酸盐和0.075g乙二胺加入到150ml纯化水中，配制含有0.5g/l多巴胺、0.5g/l乙二胺的水溶液150ml，把100ml血液灌流吸附剂(球形树脂，用于中小分子毒素吸附)置入该溶液中，加入适量氨水，使溶液ph值为10，缓慢搅拌24h，然后用生理盐水充分冲洗，抽干，制备得到包膜并带有氨基的吸附剂；将15mg肝素钠溶解在0.05m的pbs缓冲溶液(ph为6)中，配制得到150毫升浓度为0.1g/l的肝素溶液，接着加入1.438gedc和0.863gnhs搅拌使其溶解，使edc和nhs的浓度均为0.05mol/l，加入100ml带有氨基的吸附剂，缓慢搅拌24小时，得到包膜并共价固定肝素的吸附剂。最后，过滤收集吸附剂，并用纯化水冲洗，烘干得到吸附剂成品。实施例2将0.3g多巴胺盐酸盐和0.3g二亚乙基三胺加入到150ml纯化水中，配制含有2g/l多巴胺、2g/l二亚乙基三胺的水溶液150ml，把100ml血液灌流吸附剂(球形树脂，用于中小分子毒素吸附)置入该溶液中，加入适量三羟甲基氨基甲烷(tris)，使溶液ph值为8.5，缓慢搅拌24h，然后用生理盐水充分冲洗，抽干，制备得到包膜并带有氨基的吸附剂；将75mg肝素钠溶解在0.05m的mes缓冲溶液(ph为5.5)中，配制得到150毫升浓度为0.5g/l的肝素溶液，接着加入2.157gedc和1.295gnhs搅拌使其溶解，使edc和nhs的浓度均为0.075mol/l，加入100ml带有氨基的吸附剂，缓慢搅拌24小时，得到包膜并共价固定肝素的吸附剂。最后，过滤收集吸附剂，并用纯化水冲洗，烘干得到吸附剂成品。实施例3将0.75g多巴胺盐酸盐和0.75g三亚乙基四胺加入到150ml纯化水中，配制含有5g/l多巴胺、5g/l三亚乙基四胺的水溶液150ml，把100ml血液灌流吸附剂(球形树脂，用于中小分子毒素吸附)置入该溶液中，加入适量碳酸钠，使溶液ph值为8.0，缓慢搅拌24h，然后用生理盐水充分冲洗，抽干，制备得到包膜并带有氨基的吸附剂；将150mg肝素钠溶解在0.05m的柠檬酸缓冲溶液(ph为4)中，配制得到150毫升浓度为1g/l的肝素溶液，接着加入2.876gedc和1.726gnhs搅拌使其溶解，使edc和nhs的浓度均为0.1mol/l，加入100ml带有氨基的吸附剂，缓慢搅拌24小时，得到包膜并共价固定肝素的吸附剂。最后，过滤收集吸附剂，并用纯化水冲洗，烘干得到吸附剂成品。实施例4将0.075g多巴胺盐酸盐和0.075g四亚乙基五胺加入到150ml纯化水中，配制含有0.5g/l多巴胺、0.5g/l四亚乙基五胺的水溶液150ml，把100ml血液灌流吸附剂(球形活性炭，用于中小分子毒素吸附)置入该溶液中，加入适量磷酸钠，使溶液ph值为9.0，缓慢搅拌24h，然后用生理盐水充分冲洗，抽干，制备得到包膜并带有氨基的吸附剂。将75mg肝素钠溶解在0.05m的mes缓冲溶液(ph为5.5)中，配制得到150毫升浓度为0.5g/l的肝素溶液，接着加入2.157gedc和1.295gnhs搅拌使其溶解，使edc和nhs的浓度均为0.075mol/l，加入100ml带有氨基的吸附剂，缓慢搅拌24小时，得到包膜并共价固定肝素的吸附剂。最后，过滤收集吸附剂，并用纯化水冲洗，烘干得到吸附剂成品。实施例5将0.075g多巴胺盐酸盐和0.075g五亚乙基六胺加入到150ml纯化水中，配制含有0.5g/l多巴胺、0.5g/l五亚乙基六胺的水溶液150ml，把100ml血液灌流吸附剂(球形活性炭，用于中小分子毒素吸附)置入该溶液中，加入适量三羟甲基氨基甲烷(tris)，使溶液ph值为8.5，缓慢搅拌24h，然后用生理盐水充分冲洗，抽干，制备得到包膜并带有氨基的吸附剂。将75mg肝素钠溶解在0.05m的mes缓冲溶液(ph为5.5)中，配制得到150毫升浓度为0.5g/l的肝素溶液，接着加入2.157gedc和1.295gnhs搅拌使其溶解，使edc和nhs的浓度均为0.075mol/l，加入100ml带有氨基的吸附剂，缓慢搅拌24小时，得到包膜并共价固定肝素的吸附剂。最后，过滤收集吸附剂，并用纯化水冲洗，烘干得到吸附剂成品。实施例6将0.075g单宁酸和0.075g乙二胺加入到150ml纯化水中，配制含有0.5g/l单宁酸、0.5g/l乙二胺的水溶液150ml，把100ml血液灌流吸附剂(球形树脂，用于胆红素吸附)置入该溶液中，加入适量氨水，使溶液ph值为10，缓慢搅拌24h，然后用生理盐水充分冲洗，抽干，制备得到包膜并带有氨基的吸附剂。将15mg肝素钠溶解在0.05m的pbs缓冲溶液(ph为6)中，配制得到150毫升浓度为0.1g/l的肝素溶液，接着加入1.438gedc和0.863gnhs搅拌使其溶解，使edc和nhs的浓度均为0.05mol/l，加入100ml带有氨基的吸附剂，缓慢搅拌24小时，得到包膜并共价固定肝素的吸附剂。最后，过滤收集吸附剂，并用纯化水冲洗，烘干得到吸附剂成品。实施例7将0.3g单宁酸和0.3g二亚乙基三胺加入到150ml纯化水中，配制含有2g/l单宁酸、2g/l二亚乙基三胺的水溶液150ml，把100ml血液灌流吸附剂(球形树脂，用于胆红素吸附)置入该溶液中，加入适量三羟甲基氨基甲烷(tris)，使溶液ph值为8.5，缓慢搅拌24h，然后用生理盐水充分冲洗，抽干，制备得到包膜并带有氨基的吸附剂。将75mg肝素钠溶解在0.05m的mes缓冲溶液(ph为5.5)中，配制得到150毫升浓度为0.5g/l的肝素溶液，接着加入2.157gedc和1.295gnhs搅拌使其溶解，使edc和nhs的浓度均为0.075mol/l，加入100ml带有氨基的吸附剂，缓慢搅拌24小时，得到包膜并共价固定肝素的吸附剂。最后，过滤收集吸附剂，并用纯化水冲洗，烘干得到吸附剂成品。实施例8将0.75g单宁酸和0.75g三亚乙基四胺加入到150ml纯化水中，配制含有5g/l单宁酸、5g/l三亚乙基四胺的水溶液150ml，把100ml血液灌流吸附剂(球形树脂，用于胆红素吸附)置入该溶液中，加入适量碳酸钠，使溶液ph值为8.0，缓慢搅拌24h，然后用生理盐水充分冲洗，抽干，制备得到包膜并带有氨基的吸附剂。将150mg肝素钠溶解在0.05m的柠檬酸缓冲溶液(ph为4)中，配制得到150毫升浓度为1g/l的肝素溶液，接着加入2.876gedc和1.726gnhs搅拌使其溶解，使edc和nhs的浓度均为0.1mol/l，加入100ml带有氨基的吸附剂，缓慢搅拌24小时，得到包膜并共价固定肝素的吸附剂。最后，过滤收集吸附剂，并用纯化水冲洗，烘干得到吸附剂成品。实施例9将0.075g单宁酸和0.075g四亚乙基五胺加入到150ml纯化水中，配制含有0.5g/l单宁酸、0.5g/l四亚乙基五胺的水溶液150ml，把100ml血液灌流吸附剂(球形活性炭，用于中小分子毒素吸附)置入该溶液中，加入适量磷酸钠，使溶液ph值为9.0，缓慢搅拌24h，然后用生理盐水充分冲洗，抽干，制备得到包膜并带有氨基的吸附剂。将75mg肝素钠溶解在0.05m的mes缓冲溶液(ph为5.5)中，配制得到150毫升浓度为0.5g/l的肝素溶液，接着加入2.157gedc和1.295gnhs搅拌使其溶解，使edc和nhs的浓度均为0.075mol/l，加入100ml带有氨基的吸附剂，缓慢搅拌24小时，得到包膜并共价固定肝素的吸附剂。最后，过滤收集吸附剂，并用纯化水冲洗，烘干得到吸附剂成品。实施例10将0.075g单宁酸和0.075g五亚乙基六胺加入到150ml纯化水中，配制含有0.5g/l单宁酸、0.5g/l五亚乙基六胺的水溶液150ml，把100ml血液灌流吸附剂(球形活性炭，用于中小分子毒素吸附)置入该溶液中，加入适量三羟甲基氨基甲烷(tris)，使溶液ph值为8.5，缓慢搅拌24h，然后用生理盐水充分冲洗，抽干，制备得到包膜并带有氨基的吸附剂。将75mg肝素钠溶解在0.05m的mes缓冲溶液(ph为5.5)中，配制得到150毫升浓度为0.5g/l的肝素溶液，接着加入2.157gedc和1.295gnhs搅拌使其溶解，使edc和nhs的浓度均为0.075mol/l，加入100ml带有氨基的吸附剂，缓慢搅拌24小时，得到包膜并共价固定肝素的吸附剂。最后，过滤收集吸附剂，并用纯化水冲洗，烘干得到吸附剂成品。对比例1未做任何处理的球形树脂(用于中小分子毒素吸附)。对比例2未做任何处理的球形活性炭(用于中小分子毒素吸附)。对比例3未做任何处理的球形树脂(用于胆红素吸附)。测试方法：凝血试验：将待测样品1ml加入玻璃试管中，用生理盐水润洗3次，然后沿管壁加入2ml新鲜兔血。5min后每隔1min倾斜试管，直到试管中的血液不流动为止，此时的时间记为凝血时间。各实施例和对比例的成品凝血性能测试结果如下表所示：样品凝血时间(min)样品凝血时间(min)样品凝血时间(min)对比例126对比例220对比例335实施例155实施例648实施例4125实施例2108实施例7104实施例5127实施例3136实施例8129实施例9114————实施例10118上表数据表明：通过包膜并共价固定肝素后，三种血液灌流吸附剂的凝血时间明显延长，凝血性能得到明显提高，从而增加临床灌流的安全性。上述实施例以肝素钠为例，除此之外还可以往包膜并含有氨基的吸附剂加入含有其他肝素盐(例如肝素锂或肝素钙)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)的酸性缓冲溶液中，使肝素共价固定在吸附剂上，具体步骤与肝素钠实施例基本相同。显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。当前第1页12