Ti4+修饰的单宁酸-壳聚糖复合膜及其制备与应用

本发明涉及一种可重复使用的ti4+修饰的单宁酸-壳聚糖复合膜及其制备与应用。具体是采用“一锅法”策略，以壳聚糖和单宁酸为功能单体、聚乙二醇二缩水甘油醚为交联剂，将三种反应单体溶解于乙酸溶液，进行冷冻干燥成固态膜，然后将其加热进行环氧胺开环反应，得到高交联的壳聚糖复合膜。由于其含有邻苯三酚配体基团，可与钛离子进一步进行螯合，得到ti4+修饰的单宁酸-壳聚糖复合膜。该复合膜可以作为固定化金属离子亲和色谱的吸附剂，用于生物样品中磷酸肽富集的高效富集。同时其具有三维孔隙结构，提高传质效率；因邻苯三酚配体可与ti4+形成稳定的螯合键，在磷酸肽洗脱过程中，ti4+不会从复合膜上解离，因此该复合膜可以被重复使用。

背景技术：

1、随着基因组学的发展，蛋白质组学成为目前生物学领域中的研究重点之一。蛋白质组学对生物体中的蛋白质或多肽进行系统的定性、定量分析，并通过对蛋白的结构和功能等鉴定，为生物体的生理变化、病理研究以及靶药开发提供物质和理论基础(文献1.i-hsuan c.,et.al.“phosphoproteins in extracellular vesicles as candidatemarkers for breast cancer”proceedings of the national academy of sciences,2017,114,3175-3180)。蛋白质磷酸化是生物体内蛋白质翻译后修饰中的一种普遍的可逆过程，不规律的磷酸化会使细胞代谢紊乱甚至引发疾病。然而磷酸蛋白组学的研究仍面临诸多挑战，受磷酸化蛋白质的磷酸化位点少以及丰度低的限制，在复杂生物样品的分析中磷酸蛋白常常被高丰度的非磷酸蛋白掩盖。因此在基于质谱的磷酸化蛋白质组学研究中，选择性分离磷酸肽成为分析的前提和关键。目前，利用磷酸氨基酸与材料之间的相互作用开发了多种富集磷酸肽的方法，主要包括亲和层析、离子交换、抗原-抗体结合以及化学反应等。在这些方法中，固定化金属离子亲和色谱(immobilized metal affinitychromatography，imac)由于实验过程简单、特异性高、重现性好等优点而被广泛使用。然而现有的imac吸附剂普遍为一次性的，不能被重复使用且制备过程会使用一些有毒试剂，带来了资源浪费和环境污染等一系列问题。因此有必要开发绿色环保的可重复使用的imac材料，并促进其商业化。

2、近年来，膜科学与技术快速发展，在化学分析、食品生产、气体分离、废水处理、资源收集和医疗诊断与治疗等领域发挥着越来越重要的作用。壳聚糖在自然界中的存储量及来源丰富，具有良好的抗菌性、生物相容性、生物降解和易成膜性等特性。单宁酸广泛存在于松树、橡树、含羞草等自然界的多种植物组织中，生活中常见的茶和葡萄酒中也含有单宁。目前，利用单宁酸中酚羟基的不同特性开发出许多新型生物基聚合物，广泛应用于医药、食品、化妆品和水处理等行业(文献2.chen c.,et al.“tannic acid:a crosslinkerleading to versatile functional polymeric networks:a review”rsc advances,2022,12,7689-7711；文献3.ibrahim a.,et al.“synthesising tannin-basedcoagulants for water and wastewater application:a review”journal ofenvironmental chemical engineering,2021,9(1):105007)。其中单宁酸中含有的三羟基苯基团与金属离子之间的强螯合作用，使得单宁酸在重金属离子的吸附中表现出优异的吸附性能。因此本发明利用壳聚糖的易成膜性以及单宁酸与金属离子的强螯合作用，制备了绿色环保的ti4+修饰的单宁酸-壳聚糖复合膜，因其经单宁酸的修饰使得其在磷酸肽富集应用中具有可重复使用性。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种可重复使用的ti4+修饰的单宁酸-壳聚糖复合膜，其可作为固定化金属离子亲和色谱的吸附剂，用于复杂生物样品中磷酸肽的分离富集。

2、为实现上述目的，可按如下步骤操作：

3、(1)单宁酸-壳聚糖复合膜的制备：将50～1000mg壳聚糖分散于10～100ml水中，在50～150r/min的转速下，进行机械搅拌1～10min；然后加入100～500μl乙酸，继续搅拌使其形成澄清均一溶液；接着加入50～200mg聚乙二醇二缩水甘油醚及50～500mg的单宁酸，继续搅拌3～15min至完全溶解；然后将溶液转移至平底金属模具中或金属平板上，于液氮中冷冻5～25min使溶液完全冷冻成固体膜后，置于冷冻干燥机中干燥12～24h，最后将其置于50～80℃下反应2～6h得到单宁酸-壳聚糖复合膜；

4、(2)ti4+修饰的单宁酸-壳聚糖复合膜的制备：将(1)中所得的单宁酸-壳聚糖复合膜浸没于15～100ml 40-200mg/ml硫酸钛水溶液中，室温下孵育4～12h然后用水洗涤材料15～100ml/次，共3～5次，以除去过量的钛离子；最后将洗涤后的材料再次于液氮中冷冻5～25min后并置于冷冻干燥机中干燥12～24h，得到ti4+修饰的单宁酸-壳聚糖复合膜。

5、本发明采用“一锅法”策略，以壳聚糖和单宁酸为功能单体，聚乙二醇二缩水甘油醚为交联剂，将三种反应单体溶解于乙酸溶液中，冷冻干燥后成为固态膜，然后将其加热进行环氧胺开环反应，得到单宁酸-壳聚糖复合膜。因单宁酸结构中含有邻苯三酚基团，其作为配体可与钛离子(ti4+)螯合，进一步得到ti4+修饰的单宁酸-壳聚糖复合膜。该复合膜可以作为固定化金属离子亲和色谱的吸附剂，用于生物样品中磷酸肽的高效富集。

6、所制备的ti4+修饰的单宁酸-壳聚糖复合膜可作为imac吸附剂，用于复杂生物样品中磷酸肽的分离富集。该复合膜具有三维孔隙结构，因ti4+与邻苯三酚配体可以形成稳定的螯合键，在磷酸肽从复合膜上洗脱后，ti4+不会从复合膜上解离，因此可以被重复使用。

7、本发明具有如下优点：

8、(1)该方法制备过程中使用的试剂成本低，毒性小，绿色环保；

9、(2)所制备的复合膜材料，具有的三维孔结构有利于快速传质；

10、(3)所得到的ti4+修饰的单宁酸-壳聚糖复合膜作为imac吸附剂，对磷酸肽具有优异的特异性和富集效率；

11、(4)由于ti4+与邻苯三酚配体可以形成稳定的配位键，在磷酸肽富集过程中ti4+不会从复合膜上脱落，ti4+修饰的单宁酸-壳聚糖复合膜作为imac吸附剂能够被重复使用。

技术特征：

1.一种ti4+修饰的单宁酸-壳聚糖复合膜的制备方法，具体是首先以壳聚糖、单宁酸以及聚乙二醇二缩水甘油醚为前驱体溶解于水中，然后经冷冻干燥后，将得到的固体膜于50～80℃下交联得到单宁酸-壳聚糖复合膜，最后用钛离子进行螯合，得到用于磷酸肽富集的ti4+修饰的单宁酸-壳聚糖复合膜。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：ti4+修饰的单宁酸-壳聚糖复合膜的制备可按如下步骤进行：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：于冷冻干燥机中进行冷冻干燥，冷冻干燥温度条件为-40～-55℃，真空度低于20pa。

4.一种权利要求1～3任一所述方法制备获得的ti4+修饰的单宁酸-壳聚糖复合膜。

5.一种权利要求4所述ti4+修饰的单宁酸-壳聚糖复合膜的应用，其可作为固定化金属离子亲和色谱的吸附剂或固定相，用于生物样品中的磷酸肽富集。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的生物样品为人体和/或动物的体液、组织酶解液以及细胞酶解液等中的一种或二种以上。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：ti4+修饰的单宁酸-壳聚糖复合膜可被重复使用，其使用过程在于材料在经过包括平衡(acn/h2o/tfa，80/14/6，v/v/v)、上样(10μgβ-酪蛋白的上样溶液：acn/h2o/tfa，80/14/6，v/v/v)、非特异性洗脱(淋洗液a：acn/200mmnacl水溶液/tfa，50/44/6，v/v/v；淋洗液b：acn/h2o/tfa，30/69.9/0.1，v/v/v)、特异性洗脱(10％氨水)的一次富集流程后，经过重新平衡(acn/h2o/tfa，80/14/6，v/v/v)后，重复上述富集过程材料对磷酸肽仍然具有富集效果。

技术总结
本发明涉及一种可重复使用的Ti<supgt;4+</supgt;修饰的单宁酸‑壳聚糖复合膜及其制备与应用。具体是采用“一锅法”策略，以壳聚糖和单宁酸为功能单体，聚乙二醇二缩水甘油醚为交联剂，将三种反应单体溶解于乙酸溶液中，冷冻干燥后成为固态膜，然后将其加热进行环氧胺开环反应，得到单宁酸‑壳聚糖复合膜。因单宁酸结构中含有邻苯三酚基团，其作为配体可与钛离子(Ti<supgt;4+</supgt;)螯合，进一步得到Ti<supgt;4+</supgt;修饰的单宁酸‑壳聚糖复合膜。该复合膜可以作为固定化金属离子亲和色谱的吸附剂，用于生物样品中磷酸肽的高效富集。Ti<supgt;4+</supgt;修饰的单宁酸‑壳聚糖复合膜具有三维孔隙结构，因Ti<supgt;4+</supgt;与邻苯三酚配体可以形成稳定的螯合键，在磷酸肽从复合膜上洗脱后，Ti<supgt;4+</supgt;不会从复合膜上解离，因此可以被重复使用。

技术研发人员：苏超,孙传盛,潘蕾,欧俊杰
受保护的技术使用者：中国科学院大连化学物理研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16