一种亲和层析柱填料及细胞外囊泡的提取方法与流程

本发明涉及生物分离提取，具体涉及一种亲和层析柱填料及细胞外囊泡的提取方法。

背景技术：

1、细胞外囊泡（evs）是由多囊泡体与细胞膜融合形成的具有磷脂双分子层结构的纳米级小囊泡，粒径在30-150nm左右，携带表征母体细胞性质的核酸、蛋白、代谢物、磷脂等多重生物标志物，是细胞间基础生理通讯机制。evs内部装载的各类活性物质、信号分子，能够通过囊泡实现定向释放，改变受体细胞的生理和病理功能。

2、目前evs提取方法有很多种，例如超高速离心法、聚合物沉淀法等。现将现有方法的缺陷介绍如下：

3、传统的超高速离心法，是根据细胞外囊泡与其他组分密度的差异进行分离的，分离的细胞外囊泡纯度高，但该方法获得的细胞外囊泡得率低，耗时久，且依赖价格高昂的离心设备，无法大量推广。聚合物沉淀法，是利用聚合物与水分子的结合，从而降低细胞外囊泡的溶解度，通过低速离心条件将细胞外囊泡沉降，该方法获得的细胞外囊泡纯度低，且不易去除聚合物，不利于下游分析。免疫磁珠吸附法，是根据细胞外囊泡表面含有的cd9、cd63、cd81等蛋白，在磁珠表面标记相应的抗体，进而对细胞外囊泡进行特异性富集。虽然该方法获得的细胞外囊泡纯度高，但免疫磁珠结合后的细胞外囊泡不易洗脱分离，且抗体价格昂贵，不适合大量细胞外囊泡富集。切向流超滤法虽然可以方便快速的提取evs，但不能区分大小与evs相近的乳糜颗粒或脂蛋白。排阻色谱法也存在同样的问题，且对样本造成稀释，通常需要联合其他方法对所得样品进行浓缩。

4、加之，现有的方法仅能满足实验室级别的小规模提取纯化，他们处理大体积和多数量的样本时会遇到挑战，这也是目前evs技术应用于临床的瓶颈之一。

技术实现思路

1、针对现有技术的缺陷，本申请提供一种高效快速获得细胞外囊泡的亲和层析柱填料和提取方法，本申请提供的方法通量高、操作简单、省时省力，且获得的细胞外囊泡纯度高。

2、为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

3、本发明提供一种亲和层析柱填料，所述填料由多肽链与层析介质偶联得到，所述多肽链为二分支肽，所述二分支肽的结构如下：

4、；

5、其中，x为不存在、修饰或未修饰的氨基酸或者多肽，其中，所述修饰是指被一个或多个生物素或链霉亲和素所修饰；

6、l为不存在或者pegm，其中，m为1~10的整数，pegm为单臂聚乙二醇链段；

7、k表示为赖氨酸；

8、所述肽链1和所述肽链2的氨基酸序列选自以下任一组：

9、（1）seq id no:1或seq id no:2所示的氨基酸序列；

10、（2）与seq id no:1或seq id no:2所示的氨基酸序列具有至少80%、82%、85%、87%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列，并且其保留如seq id no:1或seq idno:2所示的氨基酸序列的生物学功能；

11、（3）在seq id no:1或seq id no:2所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，并且其保留如seq id no:1或seq id no:2所示的氨基酸序列的生物学功能。

12、优选地，所述x代表修饰或未修饰的氨基酸，所述氨基酸选自赖氨酸。

13、优选地，m为2~5的整数。

14、优选地，所述二分支肽的结构如下：

15、；

16、其中，x为经生物素或链霉亲和素修饰的赖氨酸；

17、所述肽链1的氨基酸序列如seq id no:1所示，所述肽链2的氨基酸序列如seq idno:2所示。

18、优选地，所述层析介质为琼脂糖凝胶或葡聚糖凝胶。

19、优选地，所述层析介质偶联链霉亲和素或生物素。

20、优选地，所述填料中所述层析介质与所述多肽链的质量体积比为1ml：20~50mg。

21、本发明第二方面提供一种包括上述任一项所述填料的亲和层析柱。

22、本发明第三方面提供一种细胞外囊泡的提取方法，所述提取方法包括利用上述任一项所述的填料或者上述所述的层析柱分离样本，得到细胞外囊泡。

23、优选地，所述方法包括以下步骤：

24、（1）将上述任一项所述的填料装入层析柱或提供上述所述的层析柱；

25、（2）将样本上样至层析柱；

26、（3）使用结合缓冲液除去未结合至填料的样本；和，

27、（4）采用洗脱缓冲液洗脱获得细胞外囊泡。

28、优选地，所述填料中层析介质与多肽链的质量体积比为1ml：20~50mg。

29、优选地，步骤（3）中，所述结合缓冲液为含有100~200mm氯化钠、质量体积百分数为0.01~1%吐温-20的浓度为20~100mm的tris-hcl缓冲液。

30、优选地，步骤（4）中，所述洗脱缓冲液为含有0.1~5m氯化钾、0.1~5m氯化镁的水溶液。

31、优选地，步骤（1）中填料装入层析柱后用3~8倍柱体积的平衡液进行洗涤。

32、进一步优选地，所述平衡液为pbs溶液或者tbs溶液。

33、优选地，所述样本包括生物体液、细胞体外培养上清、微生物体外培养上清。

34、发明的效果

35、相比于现有的细胞外囊泡分离方法，利用本申请提供的亲和层析柱填料的提取方法获得的细胞外囊泡纯度更高且具有天然构象或活性，尤其是本申请采用特殊的二分支肽与琼脂糖凝胶偶联作为填料，能够增强肽片段的结合，尤其是末端（n端）为苯丙氨酸的二分支肽可以增强肽段的结合能力，提高细胞外囊泡捕获效率，进而得率更高；同时本申请提供的检测方法还具有操作更简单、耗时更短、无需大型设备、通量高、成本低等优点。

技术特征：

1.一种亲和层析柱填料，其特征在于，所述填料由多肽链与层析介质偶联得到，所述多肽链为二分支肽，所述二分支肽的结构如下：

2.根据权利要求1所述的填料，其特征在于，所述x代表修饰或未修饰的氨基酸，所述氨基酸选自赖氨酸；

3.根据权利要求2所述的填料，其特征在于，所述二分支肽的结构如下：

4.根据权利要求1所述的填料，其特征在于，所述层析介质为琼脂糖凝胶或葡聚糖凝胶；

5.一种包括权利要求1~4中任一项所述填料的亲和层析柱。

6.一种细胞外囊泡的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括利用权利要求1~4中任一项所述的填料或者权利要求5所述的层析柱分离样本，得到细胞外囊泡。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述填料中层析介质与多肽链的质量体积比为1ml：20~50mg；

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：步骤（1）中填料装入层析柱后用3~8倍柱体积的平衡液进行洗涤；

10.根据权利要求6~9中任一项所述的方法，其特征在于，所述样本包括生物体液、细胞体外培养上清、微生物体外培养上清。

技术总结
本发明涉及一种亲和层析柱填料及细胞外囊泡的提取方法，所述填料由多肽链与层析介质偶联得到，所述多肽链为二分支肽，所述二分支肽的结构如下：；其中，X为不存在、修饰或未修饰的氨基酸或者多肽，其中，所述修饰是指被一个或多个生物素或链霉亲和素所修饰；L为不存在或者PEG<subgt;m</subgt;，其中，m为1~10的整数，PEG<subgt;m</subgt;为单臂聚乙二醇链段。利用包含该填料的亲和层析柱进行细胞外囊泡提取时，具有高效、快速以及通量高等优势，同时获得的细胞外囊泡纯度高。

技术研发人员：于海伦,李振韬,姚正一
受保护的技术使用者：亿航（苏州）生物医药有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/6/30