一种Os-Rh纳米酶、其制备方法及其在检测草甘膦中的应用

本发明涉及一种os-rh纳米酶、其制备方法及其在检测草甘膦中的应用，属于农药残留、食品安全检测的。

背景技术：

1、长期食用含有农药残留的农产品会对人体健康造成很大的危害，如胃痛、呕吐、头痛等，严重的话甚至可能导致帕金森氏症、癌症、和遗传疾病等。例如，草甘膦，作为一种广谱、高效、非选择性的有机磷除草剂，研究表明其具有一定的生殖毒性、致畸性、诱变性，可通过呼吸和接触进入人体，从而对人体健康构成威胁。因此，为了减少食品中的农药残留对人类健康的影响，有必要加强对其的检测。

2、传统的检测农药的方法主要有气相色谱法(gc)，高效液相色谱法(hplc)，气相色谱-质谱联用法(gc-ms)以及液相色谱-质谱联用法(lc-ms)，这些方法虽然灵敏度高，但程序复杂、需要大型设备、成本高和需要专业操作人员等。此外，表面增强拉曼光谱法、荧光法，电化学法等也已被用于农药残留的检测。但它们也存在一些缺点，例如需要复杂的预处理过程、稳定性和重复性差等。因此，有必要开发一种更简便、快捷的替代方法。

3、比色法因其简便快捷，结果易于确定如可直接通过裸眼观察得到结果，而在近年来受到越来越多的关注。直到现在，比色法仍是许多食品质量检验的国家标准方法。近年来，纳米酶因其制备简单、稳定性高、催化性能优异、成本低等优点成为天然酶的潜在替代品而用于农药残留检测。然而，目前大多数基于纳米酶的农药检测方法主要集中在与天然酶，如乙酰胆碱酯酶(ache)、胆碱氧化酶(chox)、酸性磷酸酶(acp)等形成级联反应体系上。它们的检测机制是通过农药抑制天然酶的活性来破坏级联反应的过程，从而使检测体系的颜色发生明显的变化，进而实现检测的目的。例如，song及其团队制备了一种具有高过氧化物酶模拟活性的ce-n-c单原子纳米酶，并将其与ache一起构建级联反应体系，从而实现了对氧化乐果、甲胺磷、克百威和硫丹的便携检测。zuo等成功设计了一种由具有优异过氧化物酶模拟活性的cu-n-c纳米酶、ache和chox组建的比色传感器阵列。在该传感器阵列中，有机磷农药可通过抑制ache的活性来减少体系中h2o2的产生，从而阻碍tmb的氧化来实现对它们的比色检测。再如，tan及其同事构建了一种基于fe-n/c单原子纳米酶(具有氧化酶模拟活性)-acp级联反应体系的新型高灵敏度比色平台用于马拉硫磷的检测。在该平台中，马拉硫磷通过抑制acp活性，从而限制体系中抗坏血酸(aa)的产生，进而恢复纳米酶对tmb的氧化活性来实现对其的灵敏检测。

4、目前，直接利用纳米酶来检测农药的研究目前还不多见，只有少数的报道。例如，huang等合成了一种具有杰出过氧化物酶模拟活性的cuceta纳米花，并通过草甘膦能有效抑制cuceta的过氧化物酶模拟活性这一特性实现了对草甘膦的直接比色检测。wu等人同样也利用草甘膦能有效抑制co3o4纳米片的过氧化物酶模拟活性这一能力开发了用于农产品中草甘膦快速检测的纸基平台。相比于与天然酶联合构建级联催化体系，直接用纳米酶对农药进行检测具有显而易见的优势，例如简单、便捷、成本低、稳定性高(不受天然酶稳定性、活性的影响)等。因此，开发更多可用于农药直接检测的纳米酶，进而开发更多的农药直接比色检测方法具有较大的研究和实际意义。

技术实现思路

1、本发明的目的一个在于提供一种新型的os-rh纳米酶(锇-铑纳米酶)，本发明的另一个目的在于提供基于os-rh纳米酶的草甘膦双模式比色检测平台。该双模式检测平台能在较宽的线性浓度范围(溶液平台为50～1000μg/l，纸张平台为200～1000μg/l)内实现对草甘膦的高灵敏度检测，溶液平台的检测限为28.37μg/l，纸张平台的检测限为400μg/l(裸眼)/123.25μg/l(灰度值)。将其用于实际样品检测时也表现出良好的可靠性和准确性，加标回收率在85.47％～96.51％范围内，rsd在0.98％～4.96％范围内。该发明所构建的基于os-rh纳米酶的草甘膦双模式比色检测平台可用于化工、环境、食品和生化检测等领域，具有较高的应用价值和良好的市场前景。

2、本发明的第三个目的是提供上述基于os-rh纳米酶的草甘膦双模式比色检测平台在食品安全检测中的应用。

3、为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

4、一种os-rh纳米酶，其是将k2oscl6、rhcl3·3h2o和甘氨酸的水溶液混合，预热后，加入抗坏血酸进行还原孵育，之后用透析袋在去离子水中透析即获得os-rh纳米酶。

5、如上所述的os-rh纳米酶，优选地，所述预热的温度为50～70℃，还原孵育的温度为50～70℃，透析袋的分子量大小为500d。

6、如上所述的os-rh纳米酶，优选地，所述k2oscl6在水溶液中的终浓度为2～5mm，rhcl3·3h2o在水溶液中的终浓度为1～4mm，甘氨酸在水溶液中的终浓度为60～120mm；抗坏血酸在水溶液中的终浓度为0.1～0.3m。

7、进一步最优选地，所述k2oscl6在水溶液中的终浓度为2mm，rhcl3·3h2o在水溶液中的终浓度为1mm，甘氨酸在水溶液中的终浓度为81mm；抗坏血酸在水溶液中的终浓度为0.1364m。

8、如上所述的os-rh纳米酶，优选地，所述混合采用涡旋混合，涡旋混合时间为5～20min，预热的时间为5～20min，孵育的时间为1～5h，透析的时间为8～40h。进一步地最优选地，涡旋混合时间为10min，预热的时间为5min，孵育的时间为2h，透析的时间为24h。

9、如上os-rh纳米酶，具有过氧化物酶模拟活性，能催化h2o2产生羟基自由基(ho·)氧化tmb，可用于仿过氧化物酶方面的应用。

10、如上所述的os-rh纳米酶在作为或制备仿过氧化物酶中的应用。

11、如上所述的os-rh纳米酶在制备检测草甘膦检测试剂中的应用。

12、如上所述的检测试剂包括检测草甘膦的检测溶剂，或检测草甘膦的试纸。

13、一种检测草甘膦的试纸，其为将os-rh纳米酶溶液包被在试纸上。

14、一种基于os-rh纳米酶检测草甘膦的方法，其包括如下步骤：

15、s1、将如上所述的os-rh纳米酶溶液分别和不同浓度的草甘膦溶液即标准品添加到96孔板中混合反应后，同时将待测样品与os-rh纳米酶溶液也加入96孔板中，并将不含草甘膦的空白溶液与os-rh纳米酶溶液也加入96孔板中作为空白对照；

16、s2、在上述各孔中加入反应底物溶液反应；

17、s3、测定各孔反应后在650nm的紫外吸收光谱；

18、s4、按公式计算各标准品的抑制率，以标准品浓度为横坐标，以标准品的抑制率为纵坐标绘制标准曲线，其中a0是空白对照组在650nm处的吸光度值，a1为添加草甘膦的标准品在650nm处的吸光度值；

19、s5、将待测样品的抑制率代入标准曲线获得待测样品中草甘膦的浓度。

20、如上所述的方法，优选地，在步骤s1中，混合时间为15min；在步骤s2中，所述反应底物溶液为tmb和h2o2溶液，其用量为200μl，浓度为2.0mm tmb和10mm h2o2；反应时间为10min。

21、一种基于os-rh纳米酶检测草甘膦的纸张比色法，其包括如下步骤：

22、s1、在含有如上所述的os-rh纳米酶的检测试纸上分别滴加不同浓度的草甘膦标准品；同时将不含草甘膦的溶液作为空白对照，待测溶液同时进行检测；

23、s2、放置一段时间后；在试纸上滴加反应底物溶液进行反应；

24、s3、用手机对反应后的试纸拍照，并通过软件得到试纸的灰度值；

25、s4、按公式计算各标准品的抑制率，以标准品中草甘膦的浓度为横坐标，对应该浓度下的抑制率为纵坐标，绘制抑制标准曲线；其中g0表示试纸在未添加草甘膦和反应底物溶液时的空白溶液的灰度值，g1表示试纸在添加草甘膦和反应底物溶液时的灰度值；

26、s5、将待测样品的抑制率代入绘制标准曲线获得待测样品中草甘膦的浓度。

27、如上所述的纸张比色法优选地，所述放置时间为15min，反应底物溶液为含有2.91mm tmb和10mm h2o2溶液；反应时间为8min。

28、纸张比色法可采用肉眼观察，当颜色有发生明显变化时，可定性判定待测样品中有草甘膦，当试纸颜色为无色时就说明待测样品中草甘膦的浓度大于1200μg/l。

29、(三)有益效果

30、本发明的有益效果是：

31、本发明首次成功制备了稳定性好、催化活性高的新型os-rh纳米酶，该纳米酶具有高过氧化物酶模拟活性，能催化h2o2产生ho·氧化tmb。将制备所得纳米酶用于农药草甘膦的双模式比色检测时表现出较宽的线性检测范围和优异的检测灵敏度。在溶液检测平台中，线性检测范围为50～1000μg/l，检测限为28.37μg/l；在纸检测平台中，线性检测范围为200～1000μg/l，裸眼检测限为400μg/l，灰度值检测限为123.25μg/l。将其用于实际样品检测也表现出令人满意的可靠性和准确性，加标回收率在85.47％～96.51％范围内，相对标准偏差(rsd)在0.98％～4.96％范围内。

32、本发明提供的检测草甘膦的试纸，可通过肉眼即可获得检测结果，并不需要专业的人员或专业的设备即可获得草甘膦的定性检测结果，更简便、快捷。

33、本发明所制备的os-rh纳米酶具有高性能的过氧化物酶的特性，可用于化工、环境、食品和生化检测等领域，具有较高的应用价值和良好的市场前景。