专利名称：烟草细胞培养法生产烟碱的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，具体地说是一种烟草细胞培养法生产烟碱。
在长期的进化过程中，为了占据一定的生态位，植物获得了通过次生代谢而产生各种次生代谢物质的能力。人类对植物次生代谢物质的利用有着悠久的历史，当今对植物次生物质的研究更是方兴未艾。但植物次生代谢物质的产量受植物产量和次生物质含量的限制，有些次生物质在自然界的含量甚微，从而局限了植物次生物质的广泛应用。随着在生物技术方面取得的长足进步，人们把目光聚集在了如何利用生物技术以获得植物次生物质的研究上。为此与之有关的科学家们开始了不懈的研究和努力，经过近几十年的探索发现通过植物细胞的大规模培养可以实现植物次生代谢物质有效生产。
通过植物细胞的大规模培养生产植物次生代谢物质较从天然植物提取及人工仿生合成具有其独到的优点(一)不破坏自然资源；(二)不受地域季节、土壤、病虫害等自然因素限制；(三)与化工合成相比，工艺及设备简单、节约能源、产业投资少，生产过程几乎没有环境污染，对工人安全性高；(四)与从自然植物提取相比，生产周期短、细胞个体差异小、生长人工控制、代谢过程可合理调整，有利于降低成本、提高产率；(五)对于某些天然物质经修饰后药效更好的物质，也可通过此技术获得结构复杂的修饰物前体；(六)对于分泌到胞外培养液中的活性物质，生产则更为方便。在此方面，研究及应用非常之多。我国罗士韦采用液体悬浮培养人参细胞，产率可日增一倍，而培养物总人参皂甙含量高达10.5％，超过栽培人参的含量(9.6％)，每立方米培养液可获干参13.98公斤。目前此技术已进入中试阶段。日本Mitsui公司通过对紫草细胞培养生产尚无法人工合成的紫草素，培养细胞的产率为天然细胞产率1000倍，现在日本紫草来源主要是细胞组织培养。另外雷公藤等许多植物次生代谢产物在生产上均已取得较大的成绩，有的培养规模可达上万吨。这些实验及实践证明，亲本植株能合成的次生代谢物质都可以通过植物细胞的培养来生产，因而被认为是一条利用生物技术生产次生代谢物质(如药物、天然色素、香料、天然调味品等)的新的有效途径。
烟草属茄科(Sdanaceae)烟属(Nicotiana)，起源于美洲，烟属的许多品种含有对人体神经系统产生独特作用的烟碱成份，最早记载为美洲印第安人用于宗教仪式和用作医药及生活嗜品(公元650年)。目前烟草分布几乎遍及世界各地，主式和用作医药及生活嗜品(公元650年)。目前烟草分布几乎遍及世界各地，主要用来制造卷烟，作为人们的嗜品，而成为世界及我国农业的主要经济作物之一。我国的烟草种植面积及其总产量均居世界首位。据统计，其种植面积占国土耕地0.7％以上，每年为国家创造出可观的经济价值。
烟草中的烟碱含有以尼古丁(nicotine)为主的吡啶衍生物，目前已报道的有12种之多，但含量最多(约占该类物质总量90％以上)的是尼古丁(C10H14N2)，另外还有两种相对含量较多的去甲烟碱(C9H12N2)和新烟碱(C10H14N2)，而其它类的生物碱因含量甚微而很少被考虑。由于尼古丁为烟碱的主要成份，所以一般所说的烟碱指的是尼古丁，而“生物烟碱”指的是该类物质多种成份的混合物。 在我国，早在清朝道光年间就有用烟草防治水稻螟虫的记载。现在直接用香烟蒂或其浸液防治家庭花卉常见害虫的方法，已经为民间所广泛采用。现代科学研究表明，烟草中的烟碱可有效地用于农业害虫防治，其属于神经毒剂，是一广谱性杀虫剂，对害虫具有较强的内吸、触杀和薰蒸等作用，能够防治多种作物蚜虫，同时对螨类和多种鳞翅目幼虫也具有较高的防治效果。目前，已有利用烟草开发的植物性农药产品应用于农业生产。
目前烟碱的生产仅限于常规的化学合成与从天然烟草中提取二种可能的途径，但此两种途径具有其自身不可避免的缺点和局限。
常规的化学合成，可通过精细化工生产出单一组份的尼古丁，具有化工生产不可避免的高耗能、环境污染、三废处理等一系列问题。而且单一组份的尼古丁用于杀虫剂又极易产生抗药性。曾风靡一时的烟碱衍生物杀虫剂吡虫啉正是因此而有被农药市场所淘汰的趋势。如果分别合成生物烟碱中的各种有效成分，再按一定比例混配，虽也可制成仿生物烟碱，但生产工艺十分复杂，成本将成倍增加，显然是不现实的。
正由于上述原因，目前的所有烟碱生产厂家均采取从天然植物中提取的途径来生产，还未见任何通过化工途径生产的报道。从天然植物中提取生产生物烟碱的方法具有其明显的缺点和局限(一)由于原料全部来自于农业供给，因而在不同程度上受到季节、气候、水土、地域及烟草的种植品种、生长状况等多种因素的制约；(二)原料的获取必定以使用大量的耕地面积做为代价；(三)有多数厂家原料采用卷烟厂的下脚料，但由于原料中烟碱含量低而投入多、产出少、成本高而营销不佳；(四)从植物烟草中提取，一般采取先用无机强碱置换，再用硫酸吸收的工艺，其产品为硫酸烟碱，生产农药时只能加工成水剂，因而严重限制了其使用范围与药效，使其在实际生产中不能得到充分的应用，(五)提取过程中使用的硫酸对生产设备损坏严重，往往每年要更换一次设备，更加增大了投入与产出的比值。
如果能够使生物烟碱的生产摆脱对农业生产的依赖，避免从天然烟草中提取这一过程的局限，同时又保持其产品的生物源特性，占用相比于大田种植极小的土地及空间，实现对烟碱集约型的工厂化生物生产，对促进烟碱类生物源物质在医药、农药等领域的开发与应用，将会具有重大的现实意义。
本发明的目的在于针对上述问题，利用植物细胞的大规模培养技术，通过烟草细胞的大规模培养法生产烟碱。
本发明的主要内容如下一种烟草细胞系，其特征在于1．以烟草种子为材料，用75％的医用乙醇浸泡30秒，随后转移至0.1％氯化汞水溶液中进行表面消毒，播种于高温灭菌过的MS基本培养基上，在温度为25±1℃下光照培养，两周后得烟草无菌苗。
2．以所获无菌苗的根、茎、叶等器官为外植体，用表1所述的生长培养基固体培养，培养温度25±1℃，经6周培养，即可在外植体的切口部位形成烟草愈伤组织。3．对所得到的愈伤组织用表1所述的生长培养基进行液体悬浮震荡培养，培养温度25±1℃，无光照，每25天继代一次，继代培养10-30次，获得烟草细胞系。
表1为本发明所用的一步生长培养基和二步生产培养基配方表1 一步生长培养基和二步生产培养基配方表
图1为本发明的工艺流程图以下以实施例形式详细叙述本发明的烟草细胞二步法培养生产烟碱的工艺流程(不限于本实施例)实施例170升的植物细胞培养反应器烟草细胞二步法培养生产烟碱的方法1．摇床上三角瓶细胞种子的准备(1)按本发明的生长培养基配方组成(见表1)，配制生长培养基。用pH计测定pH值，并用1N的HCl及1N的NaOH调节培养基pH值在5.0-6.0范围内。然后分装于250ml的三角瓶中，每瓶70-80ml。用封口膜封口后，进行高压消毒，压力为1.0-1.2Kg/cm2，时间为15-25分钟。
(2)以黄花烟草(Nicotiana rustica)细胞系为种源，在超净工作台中接种于以上准备好液体生长培养基中进行培养扩增，接种量为5％-10％(w/v)。接种后的培养瓶放入培养室中的摇床上，培养条件为温度25±1℃，无光照，摇床转速120转/分钟，每15天继代一次，直至扩增到所需的接种量7升为止。
2．70升植物细胞培养反应器的系统灭菌及培养基的准备(1)对培养反应器的管路及空气过滤器进行蒸汽消毒消毒蒸汽压力为1.2-1.4Kg/cm2，时间20-30分钟。蒸汽消毒结束，立即用1.5-2.0Kg/cm2的空气吹干管路及空气过滤器中的冷凝水，通常需要20-30分钟，关闭管路末端阀门以保证管路中的气体正压。气体正压。
(2)空消对培养反应器的培养罐和补料罐进行蒸汽消毒，消毒蒸汽压力为1.2-1.4Kg/cm2，时间30-40分钟。蒸汽消毒结束，待罐体压力降至0.5Kg/cm2时打开培养罐和补料罐的进气阀，调节罐体出气阀，以保证罐体中气体压力维持在0.3-0.5Kg/cm2的范围内。
(3)实消待培养罐和补料罐的温度降至70℃以下后，关闭罐体出气阀，打开培养罐和补料罐的加料口，向培养罐中加入生长培养基母液及蒸馏水至35-40升，向补料罐中加入生产培养基(见表1)母液及蒸馏水至15-20升，调节培养基pH值在5.0-6.0范围内，关闭培养罐和补料罐的加料口及进气阀。通以0.2Kg/cm2的水蒸气，待罐体压力升至0.5Kg/cm2时打开培养罐和补料罐的出气阀，放气5-10分钟，随后微开二者的出气阀。待罐内压力升至1.2-1.3Kg/cm2时，调节水蒸气进气阀和培养罐和补料罐的出气阀以保证罐体中蒸气压力维持在1.2-1.3Kg/cm2的范围内，进行高温实消。25-30分钟后关闭水蒸气进气阀，打开冷凝水手动阀冷却罐体，待罐体压力降至0.5Kg/cm2时打开培养罐和补料罐的出气阀，调节罐体出气阀，以保证罐体中气体压力维持在0.3-0.5Kg/cm2的范围内。
(4)空白培养一周，取罐内培养液进行镜检验证系统灭菌效果。
(5)接种将无菌水平送风平台安装于细胞培养反应器的培养罐罐顶后方(接种口位于罐顶)，无菌水平送风20-30分钟后，关闭培养罐出气阀，将培养罐进气阀开至最大，点燃接种口火圈，打开接种口盖，将准备好的盛有细胞种源的三角瓶瓶口火焰灭菌，之后通过燃烧着火圈的接种口将细胞种源快速倒入培养罐中，迅速盖上接种口盖并旋紧，最后调节培养罐进气阀及出气阀，保证罐体中气体压力维持在0.3-0.5Kg/cm2的范围内。
(6)生长培养及监测按本发明的培养条件，温度25±1℃，无光照，系统自动控制进行培养，生长培养25天，达到生物量指数末期，取样监测P/V值达到75％以上即完成一步生长培养。
(7)生产培养及监测以带有细胞过滤装置的排料管路排尽生长培养基，随后将补料罐中已灭过菌的的生产培养基经无菌管路压差补入细胞培养反应器中，进行生产培养，按本发明的培养条件，温度28±1℃，无光照，系统自动控制进行培养，生长培养17-20天，取样监测培养物烟碱含量达到0.2％以上即可完成二步生产培养。(8)将培养物以没有细胞过滤装置的排料管路排出，进行烟碱的提取。
本发明较已有技术相比具有如下优点
(一)高效，害虫不易产生抗药性；(二)对人、畜、天敌安全性较高；(三)易于被环境所降解，残留低。(四)低成本，节约大量耕地。
实施例2在实验室小试中，按本发明的生长培养基配方组成，配制生长培养基，蔗糖浓度20克/升，调节培养基pH值在5.0-6.0范围内。然后分装于250ml的三角瓶中，每瓶70-80ml。用封口膜封口后，进行高压消毒，压力为1.0-1.2Kg/cm2，时间为15-25分钟。以黄花烟草(Nicotiana rustica)细胞系为种源，在超净工作台中接种于以上准备好液体生长培养基中进行培养扩增，接种量为5％-10％(w/v)。接种后的培养瓶放入培养室中的摇床上，培养条件为温度25±1℃，无光照，摇床转速120转/分钟，培养20天后每瓶细胞鲜重可达45克，将其转至本发明的生长培养基中(配制过程同生长培养基)，培养条件，温度28±1℃，无光照，培养15天后每瓶细胞鲜重可达50克左右(P/V值达到55％)，干重5克左右，培养物按ISO2881规定的方法(水蒸气蒸馏一紫外分光光度法)测定其烟碱含量可达0.14克左右，烟碱干重含量可达2.8％，略高或接近于大田种植烟草的烟碱含量。
实施例3在70升植物细胞培养反应器中试中，经过二步法的培养，生长培养时间为25天，生产培养时间17-20天，均较实验室小试略长，但最终的烟碱含量却与实验室小试相仿，细胞烟碱干重含量可达2.8％。
实施例4经过对本发明所得的生物烟碱的蚜虫生物杀虫活性的测定，其杀虫效果与从天然烟草中提取的烟碱效果相当。
表2本发明防治蚜虫田间药效试验结果调查表2000年7月
权利要求
1.一种烟草细胞系，其特征在于(1)以烟草种子为材料，用75％的医用乙醇浸泡30秒，随后转移至0.1％氯化汞水溶液中进行表面消毒，播种于高温灭菌过的MS基本培养基上，在温度为25±1℃下光照培养，两周后得烟草无菌苗；(2)以所获无菌苗的根、茎、叶等器官为外植体，用下述的生长培养基固体培养，培养温度25±1℃，经6周培养，即可在外植体的切口部位形成烟草愈伤组织；(3)对所得到的愈伤组织用下述的生长培养基进行液体悬浮震荡培养，培养温度25±1℃，无光照，每25天继代一次，继代培养10-30次，获得烟草细胞系；其中生长培养基组成成分
2．一种烟草的细胞系，其特征在于所用的原始材料为黄花烟草。
3．一种烟草的细胞培养法生产烟碱，包括接种、生长培养、生产培养及监测步骤，其特征在于所用一步生长培养基和二步生产培养基为
全文摘要
本发明涉及一种烟草细胞培养法生产烟碱,属于生物工程领域。本发明以烟草种子为原始材料,获得烟草无菌实生苗外植物,对外植体进行诱导培养,建立并筛选出了适合通过二步细胞培养法生产烟碱的细胞悬浮体系及其相应的生长、生产培养基配方。该方法有培养周期短、产率高、对环境无污染等特点。
文档编号C12N5/04GK1283691SQ0012155
公开日2001年2月14日 申请日期2000年8月11日 优先权日2000年8月11日
发明者张兴, 曹阳, 董建新 申请人:西北农业大学无公害农药研究服务中心