猪繁殖障碍综合症诊断性基因芯片及其用途的制作方法

专利名称：猪繁殖障碍综合症诊断性基因芯片及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于诊断猪繁殖障碍综合症的诊断性基因芯片，以及利用所述诊断性基因芯片的制备方法以及用于检测传染病的用途。
背景技术：
近年来，我国畜牧业获得了高速的发展。长期以来，妨碍畜牧业发展和影响养殖业生产的主要问题是所述家禽和/或家畜罹患疫病的威胁，特别是鸡和猪罹患传染病的威胁。由于采用了集约化的饲养方式，鸡、猪的交易流通加快，使得猪和鸡的传染病变得更为复杂，常常表现为多种致病病原混合感染，造成疾病诊断上的困难，防治难度也大大相应增加。据报道，在调查的27种鸡的传染病中，混合感染两种或两种以上的传染病，占病例总数的65.1％，其中以传染性法氏囊病的合并感染最多，常常同时并发鸡新城疫，有时也合并大肠杆菌、传染性喉气管炎等病。还有报道，1995年初北京部分规模化养猪场仔猪大量死亡，死亡率为63.21％，十日龄仔猪的死亡率为100％，就是由于猪传染性胃肠炎、流行性腹泻和轮状病毒合并感染而致。
目前，对于上述家禽和/或家畜常见疫病的检测存在诸多困难。对家禽和/或家畜，特别是猪和鸡传染病的诊断目前虽然有一些方法，如病毒分离法、血凝(HA)法、血凝抑制(HI)法、琼脂扩散法和ELISA法等，但上述传统检测方法存在较多缺陷。一方面，由于待测家畜一般都已接种了所述疾病的疫苗，所以不能用检测抗体的血清学进行诊断。而常用病毒分离的方法，一般需要一到两周的时间才出结果。还有检测病毒的ELISA法、荧光抗体法等都比较复杂，需要时间一般要三天，特异性和敏感性不如基因芯片。至于PCR法是比较敏感，但易于污染造成假阳性，特别是RT-PCR难以操作，不易推广。上述所有方法每次只能检测一种病原，费时费力，不利于同时大批量检测复合致病病原的感染。
生物芯片技术是近年来在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术，它主要是通过微加工技术和微电子技术在固相芯片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、DNA及其他多种生物成份的准确、快速、大量信息的检测。常用的生物芯片分为三大类即基因芯片，蛋白质芯片和芯片实验室。生物芯片的主要特点是高通量，微型化和自动化。
本发明人首次将上述生物芯片技术应用于家禽和/或家畜，特别是鸡和猪的传染病检测领域，制备了能通过一次检测诊断多种病原的诊断性基因芯片，从而有效地解决了现有疫病诊断技术不能一次试验同时检测多种病原的问题，实现了所需样品量少、灵敏、特异、快速、费用低廉的家禽和/或家畜，特别是猪和/或鸡的传染病检测。
发明概述本发明的一个方面涉及一种用于诊断家禽和/或家畜疾病的基因芯片，其选自1)猪常见传染病诊断基因芯片，用于诊断猪瘟、口蹄疫、伪狂犬病、和/或猪繁殖和呼吸综合征；2)猪病毒病诊断基因芯片，用于诊断猪瘟、口蹄疫、伪狂犬病、猪传染性胃肠炎、猪繁殖和呼吸综合征、猪流感、猪细小病毒病、猪呼吸道冠状病毒病、猪轮状病毒病、猪流行性乙型脑炎；3)猪传染性腹泻病诊断基因芯片，用于检测猪大肠杆菌病、猪痢疾、猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、轮状病毒病；4)猪繁殖障碍综合症基因诊断芯片，用于检测狂犬病、细小病毒病、猪流行性乙型脑炎、猪繁殖和呼吸综合征；5)鸡常见传染病诊断基因芯片，用于检测鸡新城疫、禽流感、鸡马立克氏病、鸡传染性法氏囊病、鸡传染性支气管炎、鸡传染性喉气管炎、禽霍乱、鸡沙门氏菌病、大肠杆菌病；6)鸡病毒病诊断基因芯片，用于诊断病毒病鸡新城疫、禽流感、鸡传染性支气管炎、鸡传染性法氏囊病、鸡传染性喉气管炎、鸡马立克氏病、减蛋综合症、禽网状内皮组织增生症、鸡脑脊髓炎、鸡传染性贫血症；7)鸡呼吸道传染病诊断基因芯片，用于诊断鸡呼吸道传染病，鸡新城疫疫、禽流感、鸡传染性支气管炎、鸡传染性喉气管炎、鸡毒支原体、滑液支原体。
8)动物细菌检测基因芯片，用于测定相应的致病病原。
本发明的另一个方面，涉及一种本发明所述基因芯片用于检测家畜和/或家禽疫病的方法，包括如下步骤1)依照待测个体和疾病类型，选用至少一种本发明所述的基因芯片；2)标记待测样品，3)在适于与所选基因芯片进行杂交的条件下，加入经标记的待测样品并使之反应足够的时间；和4)检测杂交反应的结果。
发明详述根据目前我国对畜牧业影响最大的猪、鸡的传染病发生情况，本发明设计了用于检测多种致病病原的诊断用基因芯片，其中所述诊断用基因芯片上具有用于鉴定特定致病病原的DNA片段，其被固定在适于检测反应的固相载体上。
本发明中所述固相载体可选用本领域周知的那些，只要所述载体与所述反应物相容，不会影响检测结果。优选的，本发明所述固相载体为硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚苯乙烯、载玻片等。
本发明所述诊断用基因芯片可包含在一个诊断试剂盒中，其中还包括用于诊断反应的相应试剂、缓冲液以及说明书。
本发明的一个方面，公开了一种由猪瘟病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒、和/或猪繁殖和呼吸综合征病毒病原基因特征性片段构成的猪常见传染病诊断基因芯片，用于诊断猪瘟(Classical Swine Fever(CSF)或Hog Cholera(HC))、口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease(FMD))、伪狂犬病(Pseudorabies(PR)或Aujeszky’s Disease)、猪繁殖和呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome PRRS)，其中采用如下所述病原基因的特征性片段猪瘟病毒(CSFV)的cDNA片段(参见M.Harding等人，1994年J.Clin.Microbiol.，第31卷10期第2600-2602页，SEQ ID NO1)。所述猪瘟病毒特征性片段能够检测出美国的Baker、BAI株，德国的Glentorf、Osterode、V622株，法国的Alfort、Bas-rhin株，英国的Classical株，加拿大的Windsor株，荷兰的Henken株，比利时的1821株，马来西亚的VRI株，巴西的EVI株。而其他病毒和致细胞病变和不致细胞病变的牛病毒腹泻病毒(BVDV)及边界病毒(BDV)呈阴性；口蹄疫病毒(FMDV)的cDNA片段(参见，M.C.Hfner等人，1993年J.Virol.Methods第42卷第53-62页，SEQ ID NO2)，所述特征性片段能检测出FMDV的O、A、C、SAT 1、SAT 2、SAT 3和Asia1型各毒株，而其他病毒和猪水泡病病毒(SVDV)及牛肠道病毒(BEV-1和BEV-2)呈阴性；伪狂犬病病毒(PRV)的特征性DNA片段(参见，H.Hasebe等人，1993年Vet.Microbiol.第34卷第221-231页，SEQ ID NO3)，其用于检测如Becker、Iowa、Shope、4892、5894、Bartha、Bukarest等株PRV，而其他的各种病毒呈阴性；猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)的特征性cDNA片段(参见，S.A.Gilbert等人，1997年J.Clin.Microbiol.第35卷第264-267页，SEQID NO4)，用于检测Minnesota MN-1b、Quebec LHVA3、AlbertanPRRS B-9、H-5、U-28、European LV等株PRRS，而其他的各种病毒呈阴性。
在本发明的一个实施方案中，所述固相载体为硝酸纤维素。
本发明的又一方面，公开了一种由猪瘟病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪繁殖和呼吸综合征病毒、猪流感病毒、猪细小病毒、猪呼吸道冠状病毒、猪轮状病毒、猪流行性乙型脑炎病毒病原基因特征性片段构成的猪病毒病诊断基因芯片，其用于诊断猪瘟、口蹄疫、伪狂犬病、猪传染性胃肠炎(Transmissible Gastroenteritis TGE)、猪繁殖和呼吸综合征、猪流感(Swine Influenza SI)、猪细小病毒病(Porcine Parvovirus PP)、猪呼吸道冠状病毒病(Porcine RespiratoryCoronavirus PRC)、猪轮状病毒病(Porcine Rotavirus PRT)、猪流行性乙型脑炎(Japanese Encephalitis JE)，其中采用如下所述的病原基因的特征性片段猪瘟病毒特征性片段(同前，SEQ ID NO1)；口蹄疫病毒特征性片段(同前，SEQ ID NO2)；伪狂犬病病毒特征性片段(同前，SEQ IDNO3)；猪传染性胃肠炎病毒特征性cDNA片段(参见，1994年J.Clin.Microbiol.，第32卷第1809-1812页，E.M.Vaughn等人，SEQ IDNO6)，它能检测出CHV等毒株，而其他与TGEV很接近的猪呼吸道冠状病毒(PRCV)的病毒呈阴性；猪繁殖和呼吸综合征病毒特征性片段(同前，SEQ ID NO4)；猪流感病毒(SIV)特征性cDNA片段(参见，1994年，Am.J.Vet.Res.，第55卷第952-956页，E.Schorr等人，SEQ ID NO5)，它能检测出A/Sw/IN/1726/88、A/Sw/WI/1915/88等毒株，而其他的各种病毒呈阴性；猪细小病毒(PPV)特征性DNA片段(参见，1994年，Am.J.Vet.Res.，第55卷第344-347页，C.M.Gradil等人SEQ ID NO8)，它能检测出NADL-8等毒株，而其他的各种病毒呈阴性；猪呼吸道冠状病毒(PRCV)特征性cDNA片段(参见，1994年，J.Clin.Microbiol.，第32卷第1678-1812页，E.M.Vaughn等人，SEQ IDNO7)，它能检测出ISU-1、1894、LEEP等毒株，而猪传染性胃肠炎病毒和其他的各种病毒呈阴性；猪轮状病毒(PRTV)特征性cDNA片段(参见，1994年，J.Clin.Microbiol.，第32卷第1333-1337页，V.Gouvea等人，SEQ ID NO9)，它能检测出OSU、Gottfried等毒株，而其他的各种病毒呈阴性；猪流行性乙型脑炎病毒(JEV)特征性cDNA片段(参见，2000年，中国兽医学报，第20卷第10-14页，孙明等人，SEQ ID NO10)，它能检测出A2、JEV活疫苗等毒株，而其他的各种病毒呈阴性。
本发明所述芯片可用于检测大多数感染猪的病毒，在检测有无混合感染、继发感染方面有独特的用途，还可适用于疫病普查。
本发明的又一方面，公开了由猪大肠杆菌、猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒病原基因特征性片段构成的猪传染性腹泻病诊断基因芯片，其用于检测猪大肠杆菌病(Colibacillosis)、猪痢疾(SwineDysentery SD)、猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻(Porcine EpidemicDiarrhoea PED)、轮状病毒病，其中采用如下所述病原基因特征性片段猪大肠杆菌特征性片段(参见，1991年，J.Bacteril.，第173卷697-702页，Weiburg W.G等人，SEQ ID NO26)；猪痢疾蛇形螺旋体特征性片段(参见，1991年，J.Bacteril.第173卷697-702页，Weiburg W.G等人，SEQ ID NO27)；猪流行性腹泻病毒(PEDV)特征性cDNA片段(参见，1999年，J.VetMed.Sci.，第61卷第827-830页，S.Kubota等人，SEQ ID NO11)，其能检测出PEDV CV777、Korean等毒株，而与之相近的TGEV和血凝性脑脊髓炎病毒(HEV)及其他的各种病毒呈阴性；猪轮状病毒特征性片段(同前，SEQ ID NO9)。
由于在猪发生的腹泻中病因比较复杂，单靠临床症状不能确诊，要用已有的诊断方法做这几个病诊断三周也完不成，而用本发明所述基因芯片一天即可完成诊断。
本发明又一方面，公开了由伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪流行性乙型脑炎病毒、猪繁殖和呼吸综合征病毒病原基因特征性片段构成的猪繁殖障碍综合症基因诊断芯片，用于检测狂犬病、细小病毒病、猪流行性乙型脑炎、猪繁殖和呼吸综合征，其中采用如下所述病原基因特征性片段伪狂犬病病毒特征性片段(同前，参见SEQ ID NO3)；猪细小病毒特征性片段(同前，参见SEQ ID NO8)；猪流行性乙型脑炎病毒特征性片段(同前，参见SEQ ID NO10)；猪繁殖和呼吸综合征病毒特征性片段(同前，参见SEQ ID NO4)。
由于上述病原是引起怀孕母猪流产、死胎的主要病原，应用本发明所述基因芯片可较快查明具体由一种或几种病毒引起的相关疫病。
本发明又一方面，公开了由鸡新城疫病毒、禽流感病毒、鸡马立克氏病病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎(Infectious Laryngotracheitis ILT)病毒、禽霍乱杆菌、鸡沙门氏菌、大肠杆菌病病原基因特征性片段构成的鸡常见传染病诊断基因芯片，用于检测鸡新城疫(Newcastle Disease ND)、禽流感(Avian Influenza AI)、鸡马立克氏病(Marek’s Disease MD)、鸡传染性法氏囊病(Infectious bursalDisease IBD)、鸡传染性支气管炎(Infectious Bronchitis IB)、鸡传染性喉气管炎、禽霍乱(Avian Pasteurellosis)、鸡沙门氏菌病(Salmonelosis)、大肠杆菌病(Avian Colibacillosis)，其中采用了如下所述的病原基因特征性片段鸡新城疫病毒(NDV)特征性cDNA片段(参见，1993年，Avian Dis.，第37卷第724-730页，Jarecki-Black.J.C等人，SEQ ID NO12)，它能检测出NDV的HE2、、HE3、、HE11、、B1、、I系、IV系等毒株，而对禽流感病毒(AIV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)及其他的各种病毒呈阴性；禽流感病毒特征性cDNA片段(参见，2000年，J.Vet.Med.B，第47卷第295-301页，E.Starick等人，SEQ ID NO13)，它能检测出H1-H13型禽流感病毒(AIV)，而鸡新城疫病毒(NDV)、传染性法氏囔病毒(IBDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)及其他的各种病毒呈阴性；鸡马立克氏病病毒(MDV)的特征性DNA片段(参见，1995年，中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第六次学术研讨会论文集，第261-264页，卢春等人，SEQ ID NO14)，它能检测出MDV 1的京-1、MD11/75等毒株，而MDV2、MDV3、SB-1、FC126株及其他的各种病毒呈阴性；鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)的特征性cDNA片段(参见，2000年，Acta virologica，第44卷第259-263页，R.S.Kataria等人，SEQ IDNO15)，它能检测出IBDV的WB1/93、JK1/96、CH1/97、UP1/97、KT1/98等毒株，其他的各种病毒呈阴性，同时疫苗株Georgia、Im+、Lukert等在严格的杂交条件下也呈现阴性；鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的特征性cDNA片段(参见，2000年，中国预防兽医学报，第22卷第64-66页，王泽霖等人，SEQ ID NO16)，它能检测出IBV的H120、M41、Conn、Gray、Holte、T、118、宜、上、HK、云、N等12株毒株，NDV、IBDV、EDS-76V等病毒和其他的各种病毒呈阴性；鸡传染性喉气管炎(ILTV)的特征性DNA片段(参见，1996年，Avian Dis.，第40卷第56-62页，F.Abbas等人，SEQ ID NO17)，它能检测出ILTV的88-1453、86-1169、Laryngo-Vac ILTV、88-1059、LT-ivax ILTV等5株毒株，IBRV、FHV、EH1、EH2、PRV、BHV等病毒和其他的各种病毒呈阴性；禽霍乱杆菌特征性DNA(参见，1991年，J.Bacteril.，第173卷697-702页，Weiburg W.G等人，SEQ ID NO24)；鸡沙门氏菌特征性DNA片段(参见，1992年，Mol.Cell Probes，第6卷第271-275页，Rahn K.等人，SEQ ID NO25)，它能检测出99.4％的沙门氏菌，其他的各种非沙门氏菌属15种33株细菌发生非特异反应，但均不与标记的invA基因探针杂交。
大肠杆菌病细菌的DNA(参见，1991年，J.Bacteril.，第173卷697-702页，Weiburg W.G等人，16s rRNA的通用引物，SEQ ID NO26)。
由于现在采用高密度、大规模、集中饲养的方法养鸡，因此鸡的传染病特别易于发生，可以说任何一家养鸡场不用疫苗预防传染病就无法生存。而且由于发病种类十分复杂，主要病原引起疫病不断变化，还可能混合感染和继发感染，这就给疫病的及时诊断和防治带来了困难。采用本发明所述基因芯片，能够快速、高效、特异、灵敏地及时对复杂致病病原作出诊断。
本发明又一方面，公开了一种由鸡新城疫病毒、禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡马立克氏病病毒、减蛋综合症病毒、禽网状内皮组织增生症病毒、鸡脑脊髓炎病毒、鸡传染性贫血症病毒病原基因特征性片段构成的鸡病毒病诊断基因芯片，用于诊断病毒病鸡新城疫、禽流感、鸡传染性支气管炎、鸡传染性法氏囊病、鸡传染性喉气管炎、鸡马立克氏病、减蛋综合症(EggDrop Syndrom-1976 EDS-76)、禽网状内皮组织增生症(AvianReticuloendotheliosis)、鸡脑脊髓炎(Avian Encephalomyelitis AE)、鸡传染性贫血症(Chicken Infectious Anemia CIA)，其中采用如下所述的特征性片段；鸡新城疫病毒特征性片段(同前，SEQ ID NO12)；禽流感病毒特征性片段(同前，SEQ ID NO13)；鸡传染性支气管炎病毒特征性片段(同前，SEQ ID NO16)；鸡传染性法氏囊病病毒特征性片段(同前，SEQ ID NO15)；鸡传染性喉气管炎病毒特征性片段(同前，SEQ ID NO17)；鸡马立克氏病病毒特征性片段(同前，SEQ ID NO14)；减蛋综合症病毒(EDS-76V)特征性DNA片段(参见，1995年，中国畜牧兽医学会95年全国禽病分子生物学研讨会论文集，第116-125页，张兹均等人，SEQ ID NO18)，它能检测出珠海、上海、南京、石家庄、长春等分离株，NDV、IBV、ILTV、IBDV、FPV等病毒和其他的各种病毒呈阴性；禽网状内皮组织增生症病毒(REV)的特征性cDNA片段(参见，1993年，Avian Pathology，第22卷543-554页，Aly，M.M.等人，SEQID NO19)，它能检测出RE病毒，其他的各种病毒呈阴性；鸡脑脊髓炎病毒(AEV)的特征性cDNA片段(参见，1999年，AvianDis.，第43卷第219-226页，D.Todd等人，SEQ ID NO20)，它能检测出AEV的各种毒株，其他的各种病毒呈阴性；鸡传染性贫血症病毒(CIAV)的特征性DNA片段(参见，1992年，J.Clin.Microbiol.，第30卷第1661-1666页，D.Todd等人，SEQ ID NO21)，它能检测出GIFU-1、TK5803、1/80、1/91、EF 88/78/276、87/10/44、87/11/52、89/3711、89/3713、IMP704、NI CAV-1、NI CAV-2、EF 90-1等13株毒株，其他的各种病毒呈阴性。
本发明所述芯片基本包括了引起鸡病的大部分病毒，做普查用十分合适。
本发明又一方面，公开了一种由鸡新城疫病毒、禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡毒支原体、滑液支原体病原基因特征性片段构成鸡的呼吸道传染病诊断基因芯片，用于诊断鸡新城疫疫、禽流感、鸡传染性支气管炎、鸡传染性喉气管炎、鸡毒支原体、滑液支原体，其中采用如下所述病原基因特征性片段鸡新城疫病毒特征性片段(同前，SEQ ID NO12)；禽流感病毒特征性片段(同前，SEQ ID NO13)；鸡传染性支气管炎病毒特征性片段(同前，SEQ ID NO16)；鸡传染性喉气管炎病毒特征性片段(同前，SEQ ID NO17)；鸡毒支原体(MG)的特征性DNA片段(参见，1991年，Avian Dis.，第35卷第62-69页，Elmiro R.Nascimento等人，SEQ ID NO22)，它能检测出F-K810、F-F2F10、AAA、Fg38、F(g99)、GM607、S6(208)、S6(C4P8)、PG31、A5969、GM747、K2101、K2101(36P)、R、V503、F.Conn等16株支原体，其他的各种支原体呈阴性；滑液支原体(MS)的特征性DNA片段(参见，1996年，Avian Dis.，第40卷第218-222页，R.M.Silveira等人，SEQ ID NO23)，它能检测出MS支原体，其他的各种支原体呈阴性；本发明又一方面，公开了一种由空肠弯杆菌、猪布鲁氏菌、支气管败血博代氏菌、胸膜肺炎放线杆菌、金黄色葡萄球菌、猪链球菌、猪丹毒杆菌、猪棒状杆菌病原基因特征性片段构成的动物细菌检测基因芯片，用于测定相应的致病病原，其中采用如下所述的特征性片段空肠弯杆菌特征性DNA片段(参见，1991年J.Bacteril.，第173卷697-702页，Weiburg W.G.等人，SEQ ID NO28)；猪布鲁氏菌特征性DNA片段(参见，1991年J.Bacteril.，第173卷697-702页，Weiburg W.G.等人，SEQ ID NO29)；支气管败血博代氏菌特征性DNA片段(参见，1991年J.Bacteril.，第173卷697-702页，Weiburg W.G.等人，SEQ ID NO30)；胸膜肺炎放线杆菌特征性DNA片段(参见，1991年J.Bacteril.，第173卷697-702页，Weiburg W.G.等人，SEQ ID NO31)；金黄色葡萄球菌特征性DNA片段(参见，1991年J.Bacteril.，第173卷697-702页，Weiburg W.G.等人，SEQ ID NO32)；猪链球菌特征性DNA片段(参见，1991年J.Bacteril.，第173卷697-702页，Weiburg W.G.等人，SEQ ID NO33)；猪丹毒杆菌特征性DNA片段(参见，1991年J.Bacteril.，第173卷697-702页，Weiburg W.G.等人，SEQ ID NO34)；猪棒状杆菌特征性DNA片段(参见，1991年J.Bacteril.，第173卷697-702页，Weiburg W.G.等人，SEQ ID NO35)。
采用上述基因芯片用16s rRNA保守序列作引物的PCR检测的特异性和敏感性均为100％，而生化分析和细菌培养的敏感性分别为86.4％和22.7％。
本发明又一方面涉及一种用于检测家畜和/或家禽疫病的方法，包括如下步骤1)依照待测个体和疾病类型，选用至少一种本发明所述的基因芯片；2)标记待测样品，3)在适于与所选基因芯片进行杂交的条件下，加入经标记的待测样品并使之反应足够的时间；和4)检测杂交反应的结果。
本领域技术人员知晓，在上述检测传染病的方法中需要对待测样品进行标记。根据所选固相载体的不同，选用不同的标记以及相应的检测方法。
在本发明的一个实施方案中，采用硝酸纤维素膜作为固相载体，向其上固定具有本发明所选种类致病病原特征性片段，制备诊断用基因芯片，同时对待测样品以生物素进行标记。本发明中，优选的生物素为光敏生物素和生物素-dUTP。
本领域技术人员知晓，可以采用6-C光敏生物素标记方法比较简单，它经可见光激发对DNA、RNA进行标记(参见兽医微生物学1998年中国农业科学院哈尔滨兽医研究所编著中国农业出版社出版691页)。
对于应用荧光素和生物素-dUTP标记待测样品通常有如下几种方法1)用多聚寡核苷(dT)引物反转录时掺入荧光素(cy3-dUTP)或生物素-dUTP(参见，分子克隆实验指南中文第三版2002年J.萨姆布鲁克等箸黄培堂等译753-757页)，这种方法适用于从3’端序列组成的阵列；2)聚6(聚9)随机引物反转录时掺入荧光素(cy3-dUTP)或生物素-dUTP(参见，分子克隆实验指南中文第三版2002年J.萨姆布鲁克等箸黄培堂等译750-753页)；3)用上述引物反转录时不掺入荧光素或生物素，生成cDNA后再用缺口平移法掺入荧光素或生物素(参见，兽医微生物学1998年中国农业科学院哈尔滨兽医研究所编著中国农业出版社出版690页)。
在本发明的又一实施方案中，采用经氨基硅烷修饰的载玻片作为固相载体，向其上固定具有本发明所选种类致病病原特征性片段，再经水化和用紫外线照射固定，得到诊断用基因芯片。同时以荧光素标记待测样品的核酸，用荧光检测杂交结果。
在本发明中，待测样品核酸的抽提可采用异硫腈酸胍盐稳定法，用分光光度计对RNA定量。为了完成cDNA的标记，至少需要100ug的总的RNA。
本发明所述诊断用基因芯片在诊断相应疫病时采用了严格的杂交反应条件。依据本发明所选择的条件，可以实现使大量杂交反应中的大多数反应物处于最佳状况中，从而使尽可能多的配对物都不遗漏，即假阴性尽可能少，有错配的杂交降低至最低，即假阳性尽可能的少。
在本发明的一个具体实施方案中，用于所述猪常见传染病诊断的基因芯片上固定的待测病原基因特征性片段的平均多核苷酸序列长度为294个碱基，所述基因芯片和待测样品的杂交条件为对于经标记的待测样品(100ng/ml DNA或RNA)，选择在约41℃条件下杂交5小时，使用甲酰胺浓度为40％。
在本发明的一个具体实施方案中，用于所述猪病毒病的诊断之基因芯片上固定的待测病原基因特征性片段的平均多核苷酸序列长度为617个碱基，所述基因芯片和待测样品的杂交条件为对于经标记的待测样品(200ng/ml DNA或RNA)，选择在约43℃条件下杂交10小时，使用甲酰胺浓度为50％。
在本发明的一个具体实施方案中，用于所述猪传染性腹泻病的诊断之基因芯片上固定的待测病原基因特征性片段的平均多核苷酸序列长度为484个碱基，所述基因芯片和待测样品的杂交条件为对于经标记的待测样品(150ng/ml DNA或RNA)，选择在约42℃条件下杂交8小时，使用甲酰胺浓度为45％。
在本发明的一个具体实施方案中，用于所述猪繁殖障碍综合征的诊断之基因芯片上固定的待测病原基因特征性片段的平均多核苷酸序列长度为251个碱基，所述基因芯片和待测样品的杂交条件为对于经标记的待测样品(100ng/ml DNA或RNA)，选择在约41℃条件下杂交4小时，使用甲酰胺浓度为40％。
在本发明的一个具体实施方案中，用于所述鸡常见传染病的诊断之基因芯片上固定的待测病原基因特征性片段的平均多核苷酸序列长度为439个碱基，所述基因芯片和待测样品的杂交条件为对于经标记的待测样品(150ng/ml DNA或RNA)，选择在约42℃条件下杂交7小时，使用甲酰胺浓度为45％。
在本发明的一个具体实施方案中，用于所述鸡病毒病的诊断之基因芯片上固定的待测病原基因特征性片段的平均多核苷酸序列长度为459个碱基，所述基因芯片和待测样品的杂交条件为对于经标记的待测样品(150ng/ml DNA或RNA)，选择在约42℃条件下杂交6小时，使用甲酰胺浓度为45％。
在本发明的一个具体实施方案中，用于所述鸡呼吸道传染病的诊断之基因芯片上固定的待测病原基因特征性片段的平均多核苷酸序列长度为310个碱基，所述基因芯片和待测样品的杂交条件为对于经标记的待测样品(150ng/ml DNA或RNA)，选择在约43℃条件下杂交7小时，使用甲酰胺浓度为45％。
在本发明的一个具体实施方案中，用于所述动物细菌检测之基因芯片上固定的待测病原基因特征性片段的平均多核苷酸序列长度为294个碱基，所述基因芯片和待测样品的杂交条件为对于经标记的待测样品(100ng/ml DNA)，选择在约41℃条件下杂交5小时，使用甲酰胺浓度为40％。
在本发明中，采用本领域周知的检测方法检测杂交结果。
在本发明的一个实施方案中，对载玻片作固相支持物同时应用荧光素标记的杂交结果，采用激光聚焦扫描仪(型号Scan Array 3000 GSTLumonics Inc制造，)扫读，得到CY3图象文件，通过圈点确定杂交范围，过滤背景噪声，提取杂交的荧光信号强度值，用预先定的内参照基因对CY3的原始提取信号进行均衡和修正，用ImaGene3.0软件分析CY3荧光信号的强度和比值。
具体的，用以下两个条件作为判定杂交阳性的标准。CY3阳性点的荧光信号平均值超过阴性点信号的3倍，比值范围在2.7-3.3；阴性荧光信号值＜800，CY3阳性荧光信号值减去阴性荧光信号值后＞400。
在本发明的又一具体实施方案中，对硝酸纤维素膜作固相支持物同时应用生物素标记的杂交结果，采用亲和素-碱性磷酸酶方法检测系统(参见，兽医微生物学1998年中国农业科学院哈尔滨兽医研究所编著中国农业出版社出版694页)检测，显色反应在可见光下进行观测，紫色斑点即为阳性反应。任选的，可使用数码像机记录，用计算机软件对所述杂交结果进行分析。
实施例实施例1基因芯片制备的通用策略关于本发明所述基因芯片的制备，可采用如下详述的通用策略(一)基于载玻片作为固相支持物的基因芯片1.载玻片处理取载玻片数片，置于2mol/L NaOH的70％乙醇溶液中浸泡2小时，取出后用水荡洗数次，110℃烘干并冷却至室温，将载玻片置于1％的3-氨丙基三乙氧基硅烷95％丙酮溶液中浸泡2分钟，取出用丙酮洗10次，110℃烘30分并冷却至室温备用。
2.点样依据需要制备的本发明的基因芯片的具体类型，将所述基因芯片中所选择的病原基因特征性DNA片段各取17μl，加入20×SSC缓冲液3ul混匀，转移至96孔板中，将板置于pixsys7500 DNAMicroarray system(cartesian Technologies Inc；制造)的点样平台上，以3×10排列在处理好的载玻片上制作基因芯片。每份基因芯片中均至少包括一个阳性对照，和一个阴性对照。
将点好的阵列置湿盒中水化5分钟，取出置100℃平台上30秒，然后面朝下置于紫外透射仪上，以功率0.5mW/cm2波长230nm紫外光照射18分钟固定。备用。
(二)基于硝酸纤维素膜作为固相支持物的基因芯片1.硝酸纤维素膜的处理取硝酸纤维素膜，置于2×SSC溶液(20×SSC＝NaCl 175.5g 3Mol/L，柠檬酸钠C6H5O7Na 2H2O 88.2g 0.3Mol/L，加水溶解，调H至7.0，加水稀释成1L，滤清，此液稀释10倍即得2×SSC)，湿润均匀，放在滤纸上，夹在两块玻璃板中，37℃烘干，即可点样。
2.点样依据需要制备的本发明的基因芯片的具体类型，将所述基因芯片中所选择的病原基因特征性DNA片段各取17μl，加入20×SSC缓冲液3ul混匀，以3×3的阵列格式点在硝酸纤维素膜上，将点好的阵列放在滤纸上，夹在两块玻璃板中，80℃烘烤2小时，制作基因芯片。每份基因芯片中均至少包括一个阳性对照，和一个阴性对照。
实施例2本发明所述基因芯片检测待测样品的通用策略(一)采用生物素标记样品及其检测1.待测样品的标记依照所检测对象的不同，选择具体的待测样本，依照如下方法提取核酸样品，并对所得待测样品核酸进行生物素标记i)按RNA提取方法(参见分子克隆实验指南中文第三版2002年J.萨姆布鲁克等箸黄培堂等译518-522页)；对待测样品的核酸进行提取，以提取的核酸作模板，采用RT-PCR方法进行扩增标记，在混合液(80ul)中应用随机引物(产品号D3801公司TaKaRa)，dNTP(dTTP少加0.5ul)，另加入0.5ul的1mmol/L的Biotin-dUTP进行标记，扩增产物用PCR纯化试剂盒(产品号D301，公司TaKaRa)纯化，产物最终溶解在适量的5×SSC，0.2％SDS溶液中，终浓度为50mg/L。
ii)光敏生物素标记按RNA提取方法(参见分子克隆实验指南中文第三版2002年J.萨姆布鲁克等箸黄培堂等译518-522页)；对待测样品总RNA进行提取，以提取的核酸作模板，在混合液(100ul)中依照(兽医微生物学1998年中国农业科学院哈尔滨兽医研究所编著中国农业出版社出版691页)中所述的方法，将需标记的核酸溶液加入离心管中，加入等量的1μg/μl光敏生物素(产品号2133222，公司EZ-link)溶液，充分混匀；光照射25-30分钟；完毕后，加灭菌水至总体积为100μl，加入100μl仲丁醇，旋涡混合，3000转/分离心1分钟，小心吸去上层丁醇相。再如上述加入与溶液等量的丁醇提取一次，吸去丁醇；在此混合液中加入5μl 3mol/L醋酸钠(NaOOCCH32.46g/10ml)充分混合。加100μl冷无水乙醇，置-70℃分钟或-20℃过夜，4℃离心15分钟。弃上清。用80％冷乙醇洗一次，沉淀抽空干燥；沉淀溶于0.1mMol/LEDTA(C10H14N2O8Na44H2O，45.2mg/L)-20℃冷冻保存，或冻干后4℃保存，用紫外法测定标记核酸含量，备用。
2.基因芯片与待测样品的杂交配制以下溶液1)3％BSA封闭液3gBSA溶于70ml水中，以浓盐酸调PH至3.0。煮沸20分钟后至室温。用10mM NaOH调PH至7.5，加入10ml下述缓冲液(1M Tris-HCl PH7.5；加入MgCl2190mg，Triton X-100 0.05mlNaCl5.8g，溶解，加水到100ml)。
2)50×Denhardt’s溶液1g Ficoll 400聚蔗糖，1g PVP40，1g B溶于水，配成100ml。
3)小牛胸腺DNA的制备100mg/10ml水浸泡软，搅拌，用无针头注射器吸入，装上针头推出，反复几次至DNA长链断裂，溶液变稀。
4)1M PBS/LNaCl 18g KCl 0.2g Na2HPO41.44g KH2PO40.24g加蒸馏水800ml，用HCl调到PH7.4，加水补足到1000ml。
5)100mM/L EDTA37.2g EDTA溶于1000ml水中。
6)临用前按每cm2用80ul的量配制预杂交和杂交液。如用5×10cm2需用4ml预杂交液和杂交液。配制如下预杂交液4ml杂交液4ml试剂 用量 用量甲酰胺 2.0ml1.8ml20×SSC1.0ml1.0ml50×Denhartd’s0.4ml80ul小牛胸腺DNA*0.2ml80ul光标样品核酸**80-400ng1M PBS，PH6.4 0.2ml80ul100mM EDTA 0.2ml20％硫酸葡聚糖钠1.0ml*用前煮沸10分钟变性，速置冰水中冷却；**煮沸变性10分钟冷却再加入预杂交将点有DNA阵列的膜放入杂交盘圆孔中，加入预杂交液，盖上盖玻片，于42℃中预杂交1-2小时。
杂交弃去预杂交液，按量加入杂交液和标记好的样品核酸，盖上盖玻片，根据所选的基因芯片，按照发明详述部分披露的具体杂交条件，将膜转移到另外盛有0.1×SSC溶液的孔中洗膜3-4次，准备显色。
3.杂交结果的检测1)对于生物素标记的样品，显色①用3％BSA封闭液42℃封闭2-4小时；②吸去封闭液，加入4mlAV-AP酶联液(缓冲液100mM Tris-HClpH7.5，1.0M NaCl，2mM MgCl2，0.05％(v/v)TritonX-100；4ml缓冲液加入亲和素-碱磷酸酶(AV-AP)8-16U(1U/ul)，在室温下避光轻轻振荡反应15分钟。
③将膜片移到盛有洗涤液(Tris 1.21g NaCl 5.8g MgCl219mg TritonX-100 0.05ml加80ml水，用HCl调PH至7.5，加水至100ml)的孔中洗涤4次。
④将膜片移到盛有底物溶液(100mM Tris-HCl pH9.5，100mMNaCl，5mM MgCl2)、BCIP(10mgBCIP溶于200ul DMF中)、NBT(15mgNBT溶200ul 70％的DMF中)的孔中，避光放置几分钟至1小时，直至出显兰紫色斑点，再用水终止反应。
⑤观察记录或用数码像机记录，用计算机软件进行分析。
(二)采用荧光素标记样品及其检测1.待测样品的标记按RNA提取方法(参见分子克隆实验指南中文第三版2002年J.萨姆布鲁克等箸黄培堂等译518-522页)对待测样品总RNA进行提取，以提取的核酸作模板，采用RT-PCR方法进行扩增标记，在(体积为80ul)混合液中应用随机引物(产品号D3801公司TaKaRa)，dNTP(dTTP少加0.5ul)，另加入0.5ul的1mmol/L的Cy3-dUTP进行标记，扩增产物用PCR纯化试剂盒(产品号D301公司TaKaRa)纯化，产物最终溶解在适量的5×SSC，0.2％SDS溶液中，终浓度为50mg/L。
2.基因芯片与待测样品的杂交取标记好的待测样品溶液，加至预先经100℃煮沸30秒变性DNA阵列上，盖上盖玻片置于湿盒中，根据所选的基因芯片，按照说明书详述部分具体披露的杂交条件进行杂交，然后置2×SSC、0.1％SDS溶液中洗5分钟，0.1×SSC、0.1％SDS溶液中洗5分钟，0.1×SSC溶液中荡洗数遍晾干。
3.杂交结果检测将杂交完毕晾干的DNA阵列用Scan Array 3000(GST LumonicsInc制造)激光共聚焦扫描仪在适当条件下扫描检测其杂交信号。
实施例3本发明所述基因芯片检测结果采用本发明所述基因芯片，分别对100例病猪的样品进行检测，结果如下在100个样品中，检测出病毒CSFV的有17例，FMDV有6例，SIV有4例，PRV有23例，PRRSV有13例，TGEV有7例，PPV4有7例，PRCV有6例，PRTV有14例，JEV有3例。其中3例TGEV和PRTV混合感染，2例PRCV和SIV混合感染，5例CSFV和PRV混合感染，14例PRV和PPV混合感染。
上述检测结果，与现有技术之病毒分离法、ELISA法，检测上述病毒符合率为96％。
实施例4采用本发明所述基因芯片，分别对每种病100例病鸡的样品进行检测，并与现有技术中的血凝抑制法(HI)、病毒分离法(VI)、PCR法进行比较，结果如下表1所示。
表1
从上表可看出基因芯片检测敏感性高于HI、AI，比PCR略低，但PCR一次只能一种病原，而基因芯片一次能检出多种病原。
序列表<110>山东澳兰生物工程研究院<120>猪繁殖障碍综合症诊断性基因芯片及其用途<130>IDC020045<160>35<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>508<212>DNA<213>Classical swine fever<400>1gctcctggtt ggtaacctcg ggaaatcttg ggacggaggt gggagatttg gaacaccttg 60gctgggtgct tagagggcct gctgtttgca agaaggttac cgaacatgag aaatgcacca120catctataat ggataaattg actgcttttt tcggtgttat gccaaggggc accacaccta180gagcccctgt gagattcccc acttccctct taaagataag aagggggtta gaaactggct240gggcgtacac acaccaaggt ggcattagtt cagtggacca tgtcacttgt gggaaagact300tgctggtatg tgacactatg ggccggacaa gggtcgtttg ccaatcaaat aataagatga360cagacgagtc cgagtacgga gttaaaactg actccggatg cccggaagga gctaggtgtt420atgtgttcaa cccagaggca gttaacatat cagggactaa aggagccatg gtccacttac480agaagacttc acctgtgtga cagcatca 508<210>2<211>197<212>DNA<213>foot-and-mouth disease<400>2gaagggccca gggttggact caacattttg gacctcatgc agattccatc acacactttg 60
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1.一种用于诊断猪繁殖障碍综合症的基因芯片，其中包括固定在固相载体上的与待检致病病原种类相对应的待测致病病原特征性DNA和/或cDNA片段，其中采用的特征性片段由伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪流行性乙型脑炎病毒、猪繁殖和呼吸综合征病毒病原基因特征性片段组成，其分别相应于SEQ ID NO3、8、10、和4的序列。
2.权利要求1所述的基因芯片，其中所述固相载体选自硝酸纤维素膜、尼龙膜。
3.一种用于检测伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪流行性乙型脑炎病毒、猪繁殖和呼吸综合征病毒病原的方法，包括如下步骤1)选用权利要求1所述的基因芯片；2)标记待测样品；3)在适于与所选基因芯片进行杂交的条件下，加入经标记的待测样品并使之反应足够的时间；和4)检测杂交反应的结果。
4.权利要求3所述的方法，其中待测样品的标记采用生物素。
5.权利要求4所述的方法，其中所述生物素选自光敏生物素和生物素-dUTP。
6.权利要求3所述的方法，其中对于固定有待测病原特征性片段的基因芯片与经标记的待测样品之杂交条件为对于100ng/mlDNA或RNA，其平均多核苷酸序列长度为251个碱基，在约41℃条件下杂交4小时，使用甲酰胺浓度为40％。
全文摘要
本发明涉及用于诊断猪繁殖障碍综合症的基因芯片，以及利用所述诊断性基因芯片的制备方法以及用于检测传染病的用途。
文档编号C12Q1/68GK1616680SQ20041007890
公开日2005年5月18日 申请日期2002年12月12日 优先权日2002年12月12日
发明者吴时友, 尹燕博 申请人:山东澳兰生物工程研究院