专利名称：：一种新的基于lc/ms-it-tof的中药注射剂复杂成分分析方法
技术领域：
：本发明属于制药领域，涉及中药注射剂的成分分析与质量控制，特别是涉及脉络宁注射液的复杂成分分析方法。技术背景中药注射剂是当代中药剂型的突破性创新，具有生物利用度高、作用迅速等特点，能较好地发挥中药治疗急病重症的作用，在临床实践中显示出良好的、甚至化学药物无法达到的治疗效果。中药注射剂的研究和发展，对于我国中医药事业的发展有着极其重要的意义。但由于中药的成分极为复杂，且长期以来受基础研究不够深入的影响，目前绝大多数中药注射剂的成分组成并不是很清楚，在建立质控标准时，一部分品种仅采用紫外分光光度法测定其中某类成分的总含量，分析方法专属性差；而另一部分品种也只是对个别指标性成分或有效成分进行定量测定。很显然，这种质控方法不符合中药多组份多靶点效应的作用特点，质量控制标准不能切实反应中药注射剂的安全性、有效性，导致中药注射剂在质量、临床疗效和使用安全性方面存在很多问题，以致部分医务工作者对使用中药注射剂心存疑虑。质量标准要求低是目前中药注射剂的突出问题。由于临床使用的中药注射剂中大部分产品是上世纪70年代至80年代初研究开发的品种，受当时历史条件的限制，物质基础研究薄弱，检测手段落后，质量标准要求低。后来虽经整顿和提高，一些品种确实建立了较高的质量标准，但是大部分品种的质量标准仍然要求过低。2000年，原国家药品监督管理局颁发了《加强中药注射剂质量管理》，提出中药注射剂要建立指纹图谱检测标准。2000年8月颁发了《中药指纹图谱研究技术指导原则(试行)》。中药指纹图谱是中药注射剂质量标准重要组成部分，能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。但由于中药注射剂成分复杂，且很多是未知成分，而中药指纹图谱只是进行相似度比较，很少对其化学成分进行结构鉴定，"知其然而不知其所以然"，以现行中药指纹图谱技术所建立中药注射剂质量控制标准，并不能切实反映中药注射剂的安全性和有效性。阐明中药注射剂的主要化学成分构成是今后研究发展的必然趋势和要求。近年来，国内外均开始重视中药成分的结构鉴定与物质基础研究，所运用的分析技术手段主要包括HPLC-UV和多种液/气质联用技术等。但总体来说，目前的研究方法还存在一些不足(1)多数研究只是针对某一药材的某一主要组分群(如水溶性酚类成分)或是某一药材的主要成分，而不是着眼于全方。(2)多数研究只是对有标准对照品的化学成分进行选择性鉴定，而不是总体鉴定，对缺少标准品的化学成分，难以得出比较确定的鉴定结果。(3)目前多数液/气质联用技术难以同时获得多级碎裂结构信息和精确质量测定(精确到0.0001Da)。(4)目前尚缺乏一种高灵敏度、高分辨的具有普遍适用性的中药复杂成分分析与结构鉴定方法。高效液相一离子阱飞行时间质谱仪(LC/MS-IT-T0F)是岛津公司最新推出的高端质谱仪，是目前唯一的连接离子阱和飞行时间质谱的串级质谱技术，同时具备了高分辨率、高质量精确度、高速检测等特点，能够提供丰富、精确的化合物结构信息，对于中药复杂成分分析与结构鉴定具有突出的优势。鉴于此，本发明应用LC/MS-IT-TOF的高分辨率、高质量精确度、高速检测技术建立了一种快速分析中药注射剂复杂成分的方法，对于中药注射剂的质量控制具有重要的意义和普遍适用性。
发明内容本发明的目的是提供一种新的基于LC/MS-IT-T0F高分辨率、高质量精确度、高速检测技术的中药注射剂复杂成分分析与结构鉴定方法，通过如下步骤完成1、采用一定方法对中药注射剂进行全成分提取既要尽可能多的提取主要成分，又要尽量去除辅料干扰，根据中药注射液自身特性选择适宜的提取方法。提取方法通常包括液液萃取、固相萃取、过滤等，其中液液萃取溶剂包括正丁醇、乙酸乙酯、乙醚、氯仿、苯、正己烷、环己烷等，固相萃取可以根据实际情况选择不同填料的固相小柱，过滤则根据实际情况选择不同型号、孔径的滤膜、滤纸。2、应用LC/MS-IT-T0F,在一定色谱质谱条件下，进行正负离子全扫描得到总离子流色谱图本发明中应用的LC/MS-IT-TOF是岛津公司最新推出的高端质谱仪，是目前唯一的连接离子阱和飞行时间质谱的串级质谱技术，同时具备了高分辨率、高质量精确度、高速检测等优点，从而实现既可以做多级质谱，又能达到高质量精度的强大功能，但本发明并不限于岛津公司生产的LC/MS-IT-T0F质谱仪。在一个样品的进样过程中可以同时获得正、负离子模式的信息，只需要0.1秒就可以完成MS'在正、负离子模式间的自动切换并扫描以及MS2正、负离子模式的相互之间切换并扫描。根据中药注射液自身特性选择色谱(包括色谱柱的长度、内径、填料，柱温，流速，流动相组成，洗脱梯度等)、质谱条件(仪器的各设定参数)，全扫描(SCAN)得到其在正、负离子模式下的总离子流色谱图。3、从总离子流色谱图中寻找、确定具有适宜强度的主要离子峰，即主要成分LC/MS-IT-T0F能够利用经压縮的离子注入方式(CCI技术)尽可能地捕集到经LC洗脱的全部色谱峰。根据实际情况，确定从总离子流中提取具有适宜强度和保留时间的的离子作为主要目标成分，并进行下一步的多级碎裂。4、通过碰撞诱导解离(CID)，得到各主要成分的多级质谱(MSn)数据上一步得到的各主要成分的分子离子可以作为二级碎裂的先导离子，而二级碎裂中的高强度主要离子亦可以作为三级碎裂的先导离子，以此类推，逐级碎裂。在本发明中，三级碎裂的碎片离子信息就足以完成成分分析，尽管LC/MS-IT-T0F能够完成十级碎裂。通过碰撞诱导解离，可以得到主要成分离子的碎裂途径、分子离子和碎片离子的精确分子量等多级质谱信息，且每级的MSn质谱图都能同时做到高分辨率、高质量精确度和高灵敏度。5、基于精确分子量，在一定误差范围内预测分子离子和碎片离子的化学式-LC/MS-IT-T0F是目前唯一能保证每级MS高质量精确度的质谱仪器，整个仪器配备了完全的内部温度控制功能(包括飞行管)，从而确保高稳定性的离子飞行距离和离子加速电压，这就意味着更多级的MS分析中可以获得非常好的质量稳定性。应用LC/MSsolution工作站中的FormulaPredictor软件，可以基于精确分子量(精确到0.0001Da)，在一定误差范围内(0—lOppm)预测分子离子和碎片离子的化学式。6、通过数据库搜索，得到各预测化学式的所有可能结构，即待选结构应用互联网(例如Google(http://www.google,com)、ChemExper(http:〃ww.chemexper.com))或者CA(美国化学索引)等光盘数据库，以各预测化学式为关键词进行搜索，便可得到其所有可能结构，即待选结构。7、从待选结构中挑选出能够产生所有相应碎片离子的结构，即确证结构根据第4步得到的多级质谱信息，在所有待选结构中逐一寻找能够产生所有相应碎片离子的结构，不能产生的待选结构被排除，符合要求的待选结构即为要找的结构。本发明具有以下优点1、对中药复方注射剂进行全成分分析，所得结果符合中药的整体作用特点；2、不依赖于标准品，应用多级质谱碎裂信息和精确质量测定即可进行复杂成分(包括已知和未知成分)分析与结构鉴定；3、本发明所使用的LC/MS-IT-TOF是目前唯一的连接离子阱和飞行时间质谱的串级质谱技术，同时具备了高分辨率、高质量精确度、高速检测等特点，从而实现既可以做多级质谱，又能达到高质量精度的强大功能。它具有以下优点(1)每级的MS-都能保证高质量精确度；(2)每级的MS"质谱图都能同时做到高分辨率、高质量精确度和高灵敏度；(3)极好的质量稳定性；(4)高速切换于正、负离子模式之间，且确保高质量准确度；(5)自动地MS/MS分析功能，在测定过程中可以自动切换从MS到MS"的测定；(6)自动进行MS运转情况的校正，并进行MS轴的最优化校正。4、本发明快速可行，一次进样分析(通常可在lh内完成)即可获得丰富的化学成分结构信息，同时本发明具有普遍适用性的特点，不局限于特定中药或特定类别中药成分的分析。图h脉络宁注射液在负离子模式下的总离子流色谱图。图2:脉络宁注射液代表性成分(第41号峰)的多级碎裂(MSn)图。(a)—级质谱图；(b)质荷比为389.1061的离子的二级质谱图；(c)二级质谱中质荷比为345.1119的离子的三级质谱图；(d)二级质谱中质荷比为209.0443的离子的三级质谱图。图3:脉络宁注射液第41号峰黄夹竹桃苦苷(theveside)的断裂途径。具体实施方式实施例l:脉络宁注射液复杂成分分析方法a:对脉络宁注射液进行全成分提取将市售脉络宁注射液(No.200611032，南京金陵药业股份有限公司生产)用超纯水稀释IO倍后，酸化，5倍量水饱和正丁醇提取，取有机层挥干，流动相溶解待分析。b:应用LC/MS-IT-TOF，全扫描得到脉络宁注射液的总离子流色谱图仪器LC/MS-IT-TOF(岛津，日本)。色谱参数如下柱型，SynergiC18Hydro-RP80A，250mmX4.6mmi.d.，4pm(Phenomenex，USA);柱温，35。C;进样量，5pl;流速，0.8ml/min;流动相组成，水(含0.025%甲酸，A)和甲醇(B);洗脱梯度，0-15min:8-12%(B)、15-40min:12-60%(B)、40-50niin:60%(B)、50-55min:60-8%(B)、55-65min:8%(B)。质谱参数如下离子化模式(Ionizationmode),ESI(-);喷雾气体流速(Nebulizinggasflowrate),1.5L/min;干燥气压力(Dryinggaspressure),0.1Mpa;应用电压(Appliedvoltage),-3.5KV;CDL电压(CDLvoltage),Constantmode;CDL温度(CDLtemperature),200°C;分析型(Analysismode),MSmeasurement;测定范围(Measurementrange),AutoMS/MSmode(MS:m/z100-1500;MSn:m/z50-1500);离子累积时间(Ionaccumulationtime),30msec。在以上条件下，全扫描得到脉络宁注射液在负离子模式下的总离子流色谱图，见图l。C:从总离子流色谱图中寻找、确定具有适宜强度的主要离子峰，即主要成分在图1中共找到66个离子峰(Intensity〉800,000)作为脉络宁注射液的主要成分，其精确分子量([M-H]—)、保留时间见表l。表l.脉络宁注射液复杂成分分析<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>3828.8/33.1/33.6367.0992dnH20C)9(3or4or5)-OFeruloylquinicacid39a29.9373.1146C16H22O10Ketologanicacid39b29.9373.1146Gi6H22O10Gardoside39c29.9373.1146Ci6H22OmGeniposidicacid40a29.2/28375.1309C16H24O10Loganicacid40b29.2/28375.1309G16H24O10Mussaenosidicacid4130.2389.1061Ci6H22OuTheveside4236.1/36.4389.1228C20H22O83,3',4',5,5',7-Hexahydroxyflavanone;(2R，3R)-form,Hexa-Meether4335.2/32.1403,1267C17H24OuTheviridoside4441,6/43.4/43,7409.1515G20H26O9(3or4or5)-0-Caffeoylquinicacid;(E)-form,Butylester4536.5429.1398C19H26OuRegalosideG4640.8431.0931C2iH2()O10Cosmosiin4738.4447.0947C21H20OnLuteolin7-glucoside4824,1461.1671G20H30O12Decaffeoylacteoside4946.4461.2103G22H22O11Thermopsoside5045.4467.2141G20H36O12EbracteatosideC5135.2/32.1471,1111G27H20O8Unknow52a44/47.7475.1831C2iH320i2KanokosideA52b30.8475.1831C21H32O12CistanosideE53a44.3475.2627C27H40O7LucidenicacidG53b44,3475.2627C27H40O7lAicidenicacidH53c44.3475.2627C27H40O7LucidenicacidC5439.8479.2135C21H36O12Secolonitoside55a44.6507.2980C28H44O825-HydroxyatrotosteroneB55b44.6507.2980C28H4408AtrotosteroneC5630.1/36.7/37.1/39.3515.1172C25H24O12(1,3or1,4or1,5or3，4or3,5or4，5)-Di-O陽caffeoylquinicacid5744.3521.2673C28H42Os)29-Norsengosterone5840.1525.3014C28H46O9Sarcostin3-cymaroside5927.0531.1200G25H24O13TrilobatinD6040.1541.2957C31H42O8FevicordinA6146.7/53.0571.1789C29H32O123,5-Di-O-caffeoylquinicacid;Butylester6240.1593,2869C27H46OuDictamnosideG6338.1623.1986C29H36O"Acteoside6441.0637.2056G30H38O15CistanosideC6543.5651.2232C31H40O15CistanosideD6639.4783.2645C36H48O19AngorosideCGlc:葡萄糖。cl:通过碰撞诱导解离(CID)，得到各主要离子峰的多级质谱(MSn)数据在图1中，各成分的脱氢离子([M-HD可以作为二级碎裂的先导离子，而二级碎裂中的高强度主要离子亦可以作为三级碎裂的先导离子，以此类推，逐级碎裂。在本发明中，三级碎裂的碎片离子信息就足以完成成分分析，尽管LC/MS-IT-T0F能够完成十级碎裂。这66种成分的数据海量，因此仅以第41号成分作为例子具体说明。如图2(a)所示，第41号主要成分脱氢离子([M-H]—)的精确分子量为389.1061，可以作为其2级碎裂的先导离子。在图2(b)中，主要离子的精确分子量为345.1119和209.0443，可以作为其3级碎裂的先导离子。由此便得到了各主要成分的多级碎裂数据。e:基于精确分子量，在一定误差范围内预测分子离子和碎片离子的化学式应用LC/MS-IT-T0F(岛津，日本)的LC/MSsolution工作站中的FormulaPredictor软件，可以基于精确分子量(精确到0.0001Da)，在一定误差范围内(0—10ppm)预测分子离子和碎片离子的化学式。第41号成分的化学式预测见表2。表2.基于精确分子量的第41号成分化学式预测来源实测0n/z)化学式"预测(m/z)误差(mDa)误差(卯m)DBEbMS'389.1061389.10842.35.916.0389.1025-3.6-9.2515.0C30H14O389.0966-9.5-24.4124.0MS2371.0936C23H16。5371.0919-1.7-4.5816.0C16H20O10371.09784.211.327.0MS2345.1119C22H18O4345.11270.82.3214.0C15H22O9345.11866.719.415.0C11H22O12345.1033-8.6-24.921.0MS2209.0443C10HmO5209.04500.73.356.0MS2183.0664C9H12O4183.0657-0.7-3.824.0MS2179.0557C6H1206179.0556-0.1-0.561.0MS2165.0565C9H10O3165.0552-1.3-7.885.0MS2143.0364C6H8(D4143.0344-2.0-13.983.0MS2139.0043139.0031-1.2-8.635.0MS2121.0333C7H602121.0290-4.3-35.535.0MS3(345.1119)MS3(345.1119)179.0593165.0591C6H12O6C9H10O3179.0556165.0552-3.7-3.9-20.66-23.631.05.0MS3(209.0443)191.0350Ci。H804191.0344-0.6-3.147.0MS3(209.0443)MS3(209.0443)165.0572139.0043C9H10C>3C6H404165.0552139扁1-2.0-1.2-12.12-8.635.05.0M七学式预测(原子取值范围)C;H;0。b双键和环的等价值。f:通过数据库搜索，得到各预测化学式的所有可能结构，即待选结构应用互联网(例如-Google(http:〃画.google,com)、ChemExper(http:〃ww.chemexper.com))或者CA(美国化学索引)，以各预测化学式为关键词进行搜索，便可得到其所有可能结构。如表3所示，共找到第41号成分的可能结构19种。表3.第41号成分的可能结构(m/z:389.1061)序号化学式"可能结构1Allose;p-D-Pyranose-form，Penta-Ac2Altrose;a-D-Pyranose-form,Penta陽Ac3Eustomoside4Forsythide5C16H22OuFructose;D墨form，1，3，4，5，6-Penta-Ac6C16H22O11Kingiside;Parentacid7Ci6H22OuMonotropein8Ci6H22OuOleoside9Ci6H22Oul，2，3，4，6-Penta-0-acetylgalactose101，2，3，4，6隱Penta-0-acetylglucose11Scandoside12Ci6H22OuScandoside;6-Epimer13C16H22O11Sorbose;L-form，Penta-Ac14Ci6H22OuTalose;a-D-Pyranose陽form,Penta-Ac15Ci6H22OuTheveside16C23Hi806Celabaquinone171-[7-(2,4-Dihydroxy-6墨methylbenzoyl)陽8-hydroxynaphtho[1，8-bc〗pyran-2-yl]-2-propanone18G23H18O62,3-Dihydroxy-3-phenylpropanoicacid;(2RS，3RS)-form，Dibenzoyl19C23H18O6Isocelabaquinone预测化学式C3。H"0的相应结构不存在。g:从待选结构中挑选出能够产生所有相应碎片离子的结构，即确证结构第41号成分被鉴定为黄夹竹桃苦苷(theveside)，其精确分子量([M-HD为389.1061。碎片离子(m/z)371.0936、345.1119、209.0443、183.0664、165.0565分别由母离子失去H20、C02、Glc线O、Glc&C02、Glc&C02&H20形成。碎片离子(m/z)179.0557和143.0364被鉴定为葡萄糖和脱水葡萄糖。第41号成分黄夹竹桃苦苷(theveside)的断裂途径见图3。如表1所示，共分析出其中63种成分的结构，说明本发明具有极高的可行性。因为没有找到合适(可以产生实测的碎片离子)的待选结构，3种成分的结构没有被分析出，但得到其精确分子量和多级碎裂离子信息。序号下面的角标(a或b)表示没有相同母核但具有相同精确分子量的同分异构体结构。但由于质谱分析自身的局限性，在缺乏相应标准品的前提下，本发明对于同分异构体不能判别，如第56号成分可能是1,3或1，4或1,5或3,4或3，5或4,5-二氧咖啡酰奎尼酸。权利要求1、一种新的基于LC/MS-IT-TOF的中药注射剂复杂成分分析方法，其特征在于由如下几个步骤组成a采用一定方法对中药注射剂进行全成分提取；b应用高分辨、高灵敏度的LC/MS-IT-TOF，在一定色谱质谱条件下，进行正负离子全扫描(scan)得到中药注射剂的总离子流色谱图(TIC)；c从总离子流色谱图中寻找、确定具有适宜强度(根据需要确定强度标准)的主要离子峰，即主要成分；d通过碰撞诱导解离(CID)，得到各主要成分的多级质谱(MSn)数据，包括主要成分离子的碎裂途径、分子离子和碎片离子的精确分子量等信息；e基于精确分子量(精确到0.0001Da)，在一定误差范围内(0-100ppm或0-50mDa)预测分子离子和碎片离子的化学式；f通过数据库搜索，得到符合各预测化学式的所有可能结构，即待选结构；g从待选结构中挑选出能够产生所有相应碎片离子的结构，即确证结构。2、如权利要求1所述的中药注射剂，其特征在于中药材经提取、纯化后制成的供注入体内(穴位、皮下、肌肉、静脉注射及静脉滴注等)的溶液、乳状液及供临用前配制成溶液的粉末或浓溶液的无菌制剂。本发明以脉络宁注射液为例进行具体说明，脉络宁注射液是在著名医方"四妙勇安汤"的基础上，由金银花、玄参、牛膝、石斛四味药材制备而成的中药复方注射剂。3、如权利要求la所述的提取方法，其特征在于包括液液萃取、固相萃取、过滤等，其中液液萃取溶剂包括正丁醇、乙酸乙酯、乙醚、氯仿、苯、正己烷、环己烷等，固相萃取包括各种型号的固相小柱，过滤包括各种型号的滤膜、滤纸。4、如权利要求lb所述的LC/MS-IT-TOF,其特征在于由日本岛津公司生产，或由其它公司生产的IT-MS"和TOF-MS组合应用而成。其色谱条件的特征在于色谱柱，柱长100—300mm,内径2-16mm,填料粒度2—7pm;柱温，10—70°C;进样量，l一50(il;流速，0.01—1.50ml/min;流动相组成，水(含酸或碱)和有机溶剂(甲醇、乙腈等)；进行梯度洗脱或等度洗脱。其质谱条件的特征在于所使用仪器各参数所允许的设定范围。全文摘要本发明属于制药领域，涉及中药注射剂的成分分析与质量控制。本发明提供了一种新的基于LC/MS-IT-TOF的中药注射剂复杂成分分析方法，步骤如下1.采用一定方法从中药注射剂中提取全成分；2.应用LC/MS-IT-TOF，在一定色谱质谱条件下，进行正负离子全扫描得到总离子流色谱图(TIC)；3.从TIC中寻找、确定具有适宜强度的主要离子峰，即主要成分；4.通过碰撞诱导解离得到各主要成分的多级质谱数据；5.基于精确分子量，在一定误差范围内预测分子离子和碎片离子的化学式；6.通过数据库搜索得到各预测化学式的所有可能结构，即待选结构；7.从待选结构中挑选出能够产生所有相应碎片离子的结构，即确证结构。文档编号G01N30/00GK101153866SQ20071013339公开日2008年4月2日申请日期2007年10月19日优先权日2007年10月19日发明者楠崔,王广基,郝海平申请人:中国药科大学