专利名称：一种微生物柴油的生物合成法的制作方法
技术领域：
本发明属于可再生能源生产和污水治理的生物工程领域.涉及一种新型生物柴油-微生物柴油的制备 技术，特指一种以微生物培养制备油脂，然后用脂肪酶催化微生物油脂交酯化反应，来制备生物柴油的新 方法.
二
背景技术：
生物柴油是一种脂肪酸甲酯类化合物，是由生物油脂通过转酯化反应生成的，属于一种新型的无污染 可再生能源.这种化合物的碳链长度为14 一 18,与普通矿物柴油平均15个碳链相近，其他物理性能也比 较接近，可作为燃料供发动机使用。在长期研究和使用中发现，生物柴油有着矿物柴油无法比拟的优良性 能(l)明显降低汽车尾气有害物质的排放，环保性能优良(2)能快速生物降解，有利于水资源和土壤的保 护；(3)具有优良的润滑性能，可以缓解低硫柴油所带来的燃油系统磨损问题(4)具有较高闪点，使用和储 存安全性优于矿物柴油；(5)不含硫、铅和芳烃等对身体有害的致癌物质；(6)是一种优良的可再生资源。由 于具有这些优良性能，近年来，生物柴油作为一种石油能源替代品已引起世界范围内的普遍关注。特别是 西方发达国家，出于对国家能源安全性和环保的考虑，对其进行了深入而广泛的研究，并建立起一批工业 规模的生产装置，使生物柴油的产量和使用范围扩大。从目前传统的生产工艺看，合成生物柴油所使用的 原料可分为植物和动物两大类。植物类主要有油菜籽、葵花籽，大豆等动物类主要有牛油脂和猪油脂等。 此外有些地区还采用使用过的烹调用油等。以目前生物柴油使用的原料分布看，欧洲主要是以油菜籽和葵 花籽为主，而美国则是以大豆为主。生物柴油原料的大致比例如下:油菜籽84%、葵花籽13%、大豆、棕搁 油和其他各占1%。我国主要是利用菜籽油、棉籽油、木油等植物油生产生物柴油。
生物柴油1988年诞生于欧洲，由德国聂尔公司发明，以菜籽油为原料提炼而成。其突出的环保性和 可再生性，引起了世界发达国家，尤其是资源贫乏国家的高度重视。1991年后欧洲开始工业规模生产。进 入21世纪后，欧洲生物柴油的产量迅速提高，2001年为78万吨，2002年达到106. 5万吨，2003年则上 升为142.8万吨(其产能巳达到205万吨)。2003年下半年，欧盟制定法规，允许其成员国降低包括生物柴 油在内的生物燃料消费税，这将进一步促进欧洲生物柴油的使用。欧盟计划于2010年使生物柴油产量达 到830万吨，在柴油市场中的份额达到5.75%，并规划于2020年达到20% 。在整个欧洲，生物柴油的生 产和使用主要集中在德国、法国、意大利、奥地利、英国等几个国家。纵观整个欧洲生物柴油的发展，德 国倍受关注。在该国所有的可再生资源中，生物柴油已占据了重要的地位。近几年，尤其是1999 — 2000 年原油价格的上涨，更进一步促使德国生物柴油产能快速提髙。1999年德国生物柴油的总产量为13万吨， 占整个欧盟总产量的15% 。 2001年产量达36万吨，2002年升至45万吨，到2003年又跃升到71. 5万吨， 占整个欧盟生物柴油产量的50% 。目前德国拥有1400多个生物柴油专用加油站，并计划使生物燃料替代 矿物燃料的比例，在2005年达到2%, 2006年达到2. 75%, 2010年达到5. 75% 。在欧洲，生产生物柴油所 使用的原料主要是油菜籽和葵花籽，也有少数国家采用废弃的烹调用油和动物脂肪。在使用方式上，各国 依据自己的实际情况而侧重点不同。如法国生物柴油主要是作为矿物柴油的润滑性添加剂，以5%的生物柴 油与矿物柴油调合，以提高柴油的润滑性；只有在排放要求极其严格的地区，才使用调合比例较高的生物 柴油作为柴油机的燃料。德国则使用100%的生物柴油作为公交车、出租车、校车以及建筑和农业机械等使 用的燃料。在意大利，45%的生物柴油作为加热用油，另4596作为低硫燃料的润滑性添加剂。瑞典则有80% 的生物柴油作为纯燃料使用，15%产品以2%的添加量作为柴油的润滑性添加剂使用。统计数据表明，在欧 洲，生物柴油作为车用燃料的行驶里程已超过5亿公里，应用相当广泛。欧洲主要生产国都有自己使用和 管理生物柴油的技术规范。例如德国的DINE51 606、意大利的CUNA、捷克的CSN 656507和奥地利的ON C 1191标准等。其中德国的DIN E51 606标准受到大多数国家的普遍认同。2001年欧盟为统一生物柴油的 质量，颁布了prEN 14214 :2001生物柴油技术规格，随后经过几年试用，于2003年颁布了正式的欧洲生
4物柴油技术规格EN 14214:2003。
美国利用长链脂肪酸甲酯作为生物燃料的研究工作起始于20世纪70年代末和80年代初。当时因原 油受欧佩克限制的结果，油脂燃料的研究在多个大学和研究机构迅速开展起来。但由于生物燃料的纯度不 能达到所要求的技术规范，加之生产成本昂贵等，当时的生物柴油仅在理论上被看作是传统矿物燃料的替 代品和添加剂。自1990年"空气清洁法"和1992年"能源政策法"颁布以来，美国加强了对降低空气污 染、保护环境和减少对外能源依赖性等问题的深人研究，生物柴油商品化的问题又重提议事日程。美国能 源部曾立项委托可再生能源国家实验室对生物柴油的生产、燃料特性、行车试验、法律法规、商业化情况、 以及经济性与环境因素等进行广泛而深人的调査，并设立基金开始以大豆油转化为生物柴油的技术研究和 市场研究等。目前生物柴油作为一种替代燃料已被美国能源发展委员会(DOP)、美国环保局(EPA)和美国材 料试验协会(ASTM)等三大机构所认可。美国生物柴油主要采用大豆油为原料、酸或碱催化的酯交换工艺生 产，现有4套工业装置，总产能达到30万吨/年，在普通柴油中的掺入量为10%—20%。 2003年美国生物 柴油的销售量为8万吨，比2002年提高了 67%,现有40个州使用生物柴油。预计到2011年美国生物柴油 产量可提高到115万吨，2016年达到330万吨。在美国，生物柴油主要用于拥有集中加油站的巴士公司和 卡车运输公司，联邦政府是生物柴油的最大用户。美国1992年通过的能源政策法规定，绝大多数的联邦、 州和公共部门的汽车队都必须有一定比例的车辆使用替代燃油。在使用方式上，美国与欧洲国家不同，是 以B20调合燃料为主(即20%生物柴油与80%矿物柴油调合)。生物柴油应用于环保要求高的城市的公共交 通、政府车队、海上娱乐船和地下采矿业等方面。在产品标准上，美国材料试验协会(ASTM)率先于1999 年颁布了 PS 121-1999,随后经过技术指标的修改，于2002年颁布了正式的生物柴油技术规格ASTM D6751-02， 2003年又对该标准进行修订，颁布了生物柴油技术规格ASTM D6751-03,作为矿物柴油调合组 分使用的生物柴油的技术标准。
近年来，随着我国逐步走上新型工业化道路和汽车工业的快速发展，能源消耗较大幅度增长，2003年 我国已成为仅次于美国的全球第二大石油消费国。同时我国又是油气资源相对匾乏的国家，要实现经济可 持续发展，必须大力节约石油资源以及开发替代能源。另外，随着工业化进程加快，社会汽车保有量增加 带来的尾气排放污染问题也引起普遍关注。控制污染，使用清洁燃料已成为今后一段时间内我国车用燃料 的研究与发展方向。生物柴油是解决这些问题可供考虑的措施之一。我国是一个植物资源相对丰富的国家， 拥有400多种产油量比较多的植物，并且分布范围较广。如油菜是我国目前产量最大的油料作物，其含油 率在30%—40%，主要分布在长江流域;棉花是我国主要的农作物，棉籽的含油率在17%—23%,主要产区 有15个省、市；油茶分布于我国南方的14个省，茶籽仁含油为43%—59%;油桐遍布我国的南方各省， 桐籽仁含油率为62%;乌柏籽含油率43. 3%—55. 5%，产于我国IO多个地区。同时我国还是一个食用油消 费大国，2000年我国食用油消费量为1200万吨，如果按消费总量的10%回收计算，则产生废油脂120万 吨。为此充分利用国内各种资源生产生物柴油，既可促进我国农业发展，也有利于环保事业。我国早在1981 年就己有利用菜籽油、棉籽油、木油等植物油生产生物柴油的试验研究工作。近年来，许多研究机构和研 究人员利用我国自有资源，不断研究生物柴油的生产技术，如采用菜籽油为原料，在NaOH催化剂的作用 下与乙醇发生酯化反应研制生物柴油；利用废弃食用油研制生物柴油；利用精棉籽油在KOH催化剂作用下 与甲醇反应生成生物柴油和甘油；以大豆油为原料制备生物柴油；用米糠油为原料，甲醇作酯化剂，在催 化剂的作用下制取生物柴油技术等国内都有研究。在工业化生产方面，海南正和生物能源公司，四川古杉 油脂化工公司和福建卓新能源发展公司已先后建立了年产l万吨规模的生产厂，主要以回收废油、野生油 料、植物油下脚料、地沟油和废猪油等为原料生产生物柴油。同时还有一些企业(如辽宁抚顺、西安兰天、 南京白鹭、江西巨邦化学公司、河南天冠集团等)正在进行产业化研究。据估算目前我国生物柴油的生产 能力为2万一4万吨左右。
虽然生物柴油作为燃料使用，可以替代矿物柴油，改善环境，降低排放，但目前国内外比较成熟的生 产技术中，其原料多为植物油料，造成产品价格昂贵。据报道，与常规柴油相比，生物柴油价格要贵一倍以上，目前已成为阻碍生物柴油大面积推广使用的重要问题。许多国家为了鼓励和吸引汽车用户使用，大 多采取了减免税收的政策。但要让生物柴油成本得到大幅降低，还取决于生产技术的改进和原料成本的降 低。
三
发明内容
本发明的目的在于提出一种以微生物油脂为原料通过脂肪酶催化的交酯化反应来生物柴油的新工艺。 其特征在于以农副产品加工废弃物和工业废水为主要原料来培养一种高产油脂的酵母，以及以此微生物油 脂为原料通过酶催化的油脂交酯化反应来生产生物柴油的新工艺。是同时涉及可再生能源生产和污水处理 的双效生物工程。本发明具有产品得率高，成本低，治理环境污染，开发新能源，减轻我国能源紧张等优 点。
所述微生物油脂的制备方法，包括如下步骤 1. 一种酵母菌的发酵工艺，其特征包括
(1) 原始菌种的活化酵母菌(Rhodotorula glutinis)来自ATCC(USA).将菌种接种到斜面培养基上，在 25°C培养四至五天.
(2) 液体培养将活化后的菌种接种于500ml的液体培养介质中培养，培养器皿为带磁力搅拌的1L培养 瓶，搅拌速度为120转/分，温度为28-30°C,时间为16-24小时.
(3) 扩大培养液体菌种以10%的比例接种到5L发酵罐中培养.通气量为1.0-1. 5L/min，搅拌400-500 转/分，pH为5. 5-6. 5,温度为30°C，时间为18-24小时.
(4) 一级发酵将扩火培养的菌种以10%的接种量加入到50-500L的发酵罐中，通气量为1. 0-1. 5L/min,搅 拌400-500转/分，pH为5.5-6.5,温度为此30°0,时间为18-24小时.用显微镜观察，无细菌污染，可 转入二级发酵.
(5) 二级发酵将一级发酵得到的菌种以10%的比例加入到500-5000L 二级发酵灌中，通气量为 1. 0-1. 5L/min，搅拌400-500转/分，pH为5. 5-6. 5,温度为此30。C,时间为18-24小时.经观察菌丝粗 壮健康无污染，可转入三级发酵.
(6) 三级发酵将二级发酵得到的菌种以10%的比例加入到5000-50000L三级发酵灌中，通气量为
1. 0-1. 5L/min，搅拌400-500转/分，pH为5. 5-6. 5,温度为此30。C，时间为18-24小时.经观察菌丝粗 壮健康无污染，可转入四级发酵
(7) 四级发酵将三级发酵得到的菌种以5-10%的比例加入到50000-500000L四级发酵灌中，培养液为产 脂培养介质.通气量为1. 5-2. OL/min，搅拌400-500转/分，pH为5. 5-6. 5,温度为此30。C,时间为四到 五天.发酵完成后经离心过滤收取菌丝体，
所述斜面培养基配方葡萄糖3-5%, NH4C1 0. 25-0. 35%,酵母提取液0. 15%,磷酸盐0. 3-0. 7%， MgS04 0. 15%, 琼脂2%,马铃薯汁10%.
所述液体培养基配方工业废水97. 5-98. 8%,酵母提取液0. 15%,尿素0. 5-1. 0%,磷酸盐0. 3-0. 7%， MgS04 0. 15%, CaC12 0. 005-0. 01%.
所述产脂培养基配方工业废水92. 5-95. 8%，糖蜜3-5%,酵母提取液0. 15-0. 3%,
尿素0. 3-0. 5%,磷酸盐0. 3-0. 7%, MgS04 0. 15%, CaC12 0. 005-0. 01%. 上述工业废水，特指热电厂或炸药厂排放的废水.
2. 微生物菌丝体的油脂抽提工艺，其特征包括(1) 将菌丝体在60-90°C下真空干燥15-20分钟.
(2) 将干菌丝体机械粉碎后用有机溶剂萃取。萃取剂为石油醚，萃取酸度在pH4.5-5.5,最佳配比为50g干 菌体/lL石油醚，萃取时间为8-16h,操作温度低于50'C。
(3) 有机溶剂通过蒸溜后回收循环使用.最大程度上减少环境污染.
所述微生物柴油的制备方法，特指一种利用脂肪酶转化油脂生产生物柴油的新工艺.其步骤为将微生物 油脂加入到反应釜中，并预热到30-40oC.加入微量乳化剂，搅拌5分钟，然后依此加入生物酶，水和短 链醇(醇脂摩尔比3-6:1),高速搅拌10-15分钟，反应混合物呈乳状液，保温反应5-24小时，油脂原料可 完全转化为生物柴油和副产物甘油.
所述油脂为微生物油脂，包括酵母油脂，海藻油脂，细菌油脂. 所述乳化剂为油酸甲酯，含量为0. 5%.
所述脂肪酶为植物脂肪酶和微生物脂肪酶.
所述植物脂肪酶为油类植物脂肪酶.
所述微生物脂肪酶为大肠杆菌基因重组脂肪酶蛋白质，包括LipozymeAl, LipozymeA2， LipozymeA3或它 们的混合物.
所述短链醇为甲醇或乙醇.
本发明的优点
本发明提出了一种新型生物柴油-微生物柴油的工业化生产方法，是目前最先进的生物柴油生产技术.由 于我国有效土地资源相对贫乏，利用粮食油料作物等植物资源来生产生物柴油不但价格高，而且不利于我 国的持续发展.
四具体实施例 实施例1.
1.油脂的微生物合成.
(1) 原始菌种的选育和活化将菌种酵母菌(Rhodotorula glutinis)接种到斜面培养基上，在25。C培养 四至五天.
(2) 液体培养将活化后的菌种接种于500ral的液体培养介质中培养，培养器皿为带磁力搅拌的1L培养 瓶，搅拌速度为120转/分，温度为28"C,时间为16-24小时.(3) 扩大培养液体菌种以1(^的比例接种到5L发酵罐中培养.通气量为1. 1L/min，搅拌440转/分，pH 为5. 5-5. 7,温度为30° C,时间为18-24小时.
(4) 一级发酵将扩大培养的菌种以1(^的接种量加入到50L的发酵罐中，通气量为1. lL/min，搅拌440 转/分，pH为5.5-5.7,温度为此30"C,时间为18-24小时.用显微镜观察，无细菌污染，可转入二级发 酵.
(5) 二级发酵将一级发酵得到的菌种以10%的比例加入到500L二级发酵灌中，通气量为1. 1L/min,搅 拌440转/分，pH为5.5-5.7,温度为此30。C，时间为18-24小时.经观察菌丝粗壮健康无污染，可转入 三级发酵.
(6) 三级发酵将二级发酵得到的菌种以1(^的比例加入到5000L三级发酵灌中，通气量为1. lL/min，搅 拌440转/分，pH为5.5-5.7，温度为此3(TC,时间为18-24小时.经观察菌丝粗壮健康无污染，可转入 四级发酵
(7) 四级发酵将三级发酵得到的菌种以5-l(^的比例加入到50000L四级发酵灌中，培养液为产脂培养介 质.通气量为1. 5L/min,搅拌4400转/分，pH为5. 5-5. 7,温度为此30°C,时间为四到五天.发酵完成 后经离心过滤收取菌丝体，
所述斜面培养基配方葡萄糖3-5%, NH4C1 0. 25-0. 35%，酵母提取液0. 15%,磷酸盐0. 3-0. 7%, MgS04 0. 15%, 琼脂2%,马铃薯汁10%.
所述液体培养基配方工业废水97. 5-98. 8%,酵母提取液0. 15%，尿素0. 5-1. 0%,磷酸盐0. 3-0. 796， MgS04 0. 15%, CaC12 0. 005—0. 01%.
所述产脂培养基配方工业废水92. 5-95. 8%,糖蜜3_5%，酵母提取液0. 15-0. 3%, 尿素O. 3-0.5%，磷酸盐O. 3-0.7%, MgS04 0. 15\ CaC12 0.005-0.01%. 上述工业废水，特指热电厂或炸药厂排放的废水.
2. 微生物菌丝体的油脂抽提
(1) 将菌丝体在65。C下真空干燥20分钟.
(2) 将干菌丝体机械粉碎后用有机溶剂萃取。萃取剂为石油醚，萃取酸度在pH 4. 6，配比为50g干菌体 /1L石油醚，萃取时间为9h，操作温度低于50'C。
(3) 萃取液蒸溜后即得纯油脂.
3. 微生物柴油的制备
将微生物油脂加入到反应釜中，并预热到30-40oC.加入微量乳化剂，搅拌5分钟，然后依此加入生物酶， 水和短链醇(醇脂摩尔比3:1)，高速搅拌10-15分沐反应混合物呈乳状液，保温反应5-24小时，油脂原 料可完全转化为生物柴油和副产物甘油.
实施例2.
油脂的微生物合成.
(1) 将菌种酵母菌(Rhodotorula glutinis)接种到斜面培养基上，在25。C培养四至五天.
(2) 液体培养将活化后的菌种接种于500ml的液体培养介质中培养，培养器皿为带磁力搅拌的1L培养 瓶，搅拌速度为125转/分，温度为29°(:,时间为16-24小时，
(3) 扩大培养液体菌种以1(^的比例接种到5L发酵罐中培养.通气量为1. 2 L/min，搅拌460转/分，pH 为5. 6-5. 8,温度为30"C，时间为18-24小时.
8(4) 一级发酵将扩大培养的菌种以1(^的接种量加入到250L的发酵罐中，通气量为1. 2L/min，搅拌460 转/分，pH为5.6-5.8,温度为此30。C,时间为18-24小时.用显微镜观察，无细菌污染，可转入二级发 酵.
(5) 二级发酵将一级发酵得到的菌种以1(^的比例加入到2500L二级发酵灌中，通气量为1.2L/min,搅 拌460转/分，pH为5.6-5.8,温度为此30。C，时间为18-24小时.经观察菌丝粗壮健康无污染，可转入 三级发酵.
(6) 三级发酵将二级发酵得到的菌种以l(m的比例加入到25000L三级发酵灌中，通气量为1. 2L/min,搅 拌460转/分，pH为5.6-5.8，温度为此30。C，时间为18-24小时.经观察菌丝粗壮健康无污染，可转入 四级发酵
(7) 四级发酵将三级发酵得到的菌种以5-l(^的比例加入到250000L四级发酵灌中，培养液为产脂培养 介质.通气量为1. 5L/min，搅拌460转/分，pH为5. 6-5. 8,温度为此30。C,时间为四到五天.发酵完成 后经离心过滤收取菌丝体，
所述斜面培养基配方葡萄糖3-5%, NH4C1 0. 25-0. 35%，酵母提取液0.15%,磷酸盐0. 3-0. 7%， MgS04 0. 15%, 琼脂2%，马铃薯汁10%.
所述液体培养基配方工业废水97. 5-98. 8%,酵母提取液0.15%,尿素0. 5-1.0%,磷酸盐0.3_0.7%, MgS04 0. 15%, CaC12 0. 005-0. 01%.
所述产脂培养基配方工业废水92. 5-95. 8%，糖蜜3-5%,酵母提取液0. 15-0. 3%, 尿素0. 3-0. 5%,磷酸盐0. 3-0. 7%， MgS04 0. 15%, CaC12 0. 005-0. 01%. 上述工业废水，特指热电厂或炸药厂排放的废水.
2. 微生物菌丝体的油脂抽提
(1) 将菌丝体在70。C下真空干燥18分钟.
(2) 将干菌丝体机械粉碎后用有机溶剂萃取。萃取剂为石油醚，萃取酸度在pH 4.9，配比为50g干菌体 /1L石油醚，萃取时间为llh,操作温度低于50'C。
(3) 萃取液蒸溜后即得纯油脂
3. 微生物柴油的制备
将微生物油脂加入到反应釜中，并预热到30-40oC.加入微量乳化剂，搅拌5分钟，然后依此加入生物酶， 水和短链醇(醇脂摩尔比4:1)，高速搅拌10-15分钟，反应混合物呈乳状液，保温反应5-24小时，油脂原 料可完全转化为生物柴油和副产物甘油.
实施例3.
油脂的微生物合成.
(1) 将菌种酵母菌(Rhodotorula glutinis)接种到斜面培养基上，在25。C培养四至五天.
(2) 液体培养将活化后的菌种接种于500ml的液体培养介质中培养，培养器皿为带磁力搅拌的1L培养 瓶，搅拌速度为130转/分，温度为30。C,时间为16-24小时.
(3) 扩大培养液体菌种以1TO的比例接种到5L发酵罐中培养.通气量为1.4L/min,搅拌400-500转/分， pH为6. 0-6. 2,温度为30°C，时间为18-24小时.
(4) 一级发酵将扩大培养的菌种以1(^的接种量加入到500L的发酵罐中，通气量为1. 4L/min，搅拌480 转/分，pH为6.0-6.2，温度为此30。C，时间为18-24小时.用显微镜观察，无细菌污染，可转入二级发酵.
(5) 二级发酵将一级发酵得到的菌种以l(m的比例加入到5000L二级发酵灌中，通气量为1.4L/min,搅 拌480转/分，pH为6.0-6.2,温度为此30。C，时间为18-24小时.经观察菌丝粗壮健康无污染，可转入 三级发酵.
(6) 三级发酵将二级发酵得到的菌种以109&的比例加入到50000L三级发酵灌中，通气量为1. 4L/min,搅 拌480转/分，pH为6.0-6.2，温度为此30。C，时间为18-24小时.经观察菌丝粗壮健康无污染，可转入 四级发酵
(7) 四级发酵将三级发酵得到的菌种以5-10%的比例加入到500000L四级发酵灌中，培养液为产脂培养 介质.通气量为1. 80L/min,搅拌480转/分，pH为6. 0-6. 2，温度为30°C,时间为四到五天.发酵完成 后经离心过滤收取菌丝体，
所述斜面培养基配方葡萄糖3-5%， NH4C1 0. 25-0. 35%,酵母提取液O. 15%,磷酸盐0.3_0.7%, MgS04 0. 15%, 琼脂2%,马铃薯汁10%.
所述液体培养基配方工业废水97. 5-98. 8%,酵母提取液0. 15%,尿素0. 5-1. 0%,磷酸盐0. 3-0. 7%, MgS04 0.15%, CaC12 0. 005-0. 01%.
所述产脂培养基配方工业废水92. 5-95. 8%,糖蜜3_5%，酵母提取液0. 15-0. 3%, 尿素0. 3-0. 5%,磷酸盐0. 3-0. 7%, MgS04 0. 15%, CaC12 0. 005-0. 01%. 上述工业废水，特指热电厂或炸药厂排放的废水.
2. 微生物菌丝体的油脂抽提
(1) 将菌丝体在75° C下真空干燥15分钟.
(2) 将干菌丝体机械粉碎后用有机溶剂萃取。萃取剂为石油醚，萃取酸度在pH 4.8，配比为50g干菌体 AL石油醚，萃取时间为10h,操作温度低于50'C。
(3) 萃取液蒸溜后即得纯油脂.
3. 微生物柴油的制备
将微生物油脂加入到反应釜中，并预热到30-40oC.加入微量乳化剂，搅拌5分钟，然后依此加入生物酶， 水和短链醇(醇脂摩尔比5:1),高速搅拌10-15分钟，反应混合物呈乳状液，保温反应5-24小时，油脂原 料可完全转化为生物柴油和副产物甘油。
权利要求
1. 一种微生物柴油的制备方法，其特征在于通过酵母菌发酵来合成油脂，然后通过萃取的方法来提取微生物菌丝体的油脂(油脂抽提工艺)，最后通过脂肪酶催化的转脂化反应来制备生物柴油.
2. 权利要求1所述酵母菌的发酵工艺，其步骤包括原始菌种的活化、液体培养、扩大培养、 一级发酵、二 级发酵、三级发酵、四级发酵.
3. 权利要求2所述原始菌种的活化，其特征为将菌种(Rhodotorula glutinis)接种到斜面培养基上，在25 °C培养四至五天.
4. 权利要求2所述液体培养，其特征为将活化后的菌种接种于500ml的液体培养介质中培养，培养器皿 为带磁力搅拌的1L培养瓶，搅拌速度为120转/分，温度为28-30°C，时间为16-24小时.
5. 权利要求2所述扩大培养，其特征为液体菌种以10%的比例接种到5L发酵罐中培养.通气量为 1.0-1.5L/min，搅拌400-500转/分，pH为5.5-6.5,温度为30。C,时间^J 18-24小时.
6. 权利要求2所述一级发酵，其特征为将扩大培养的菌种以10%的接种量加入到50-500L的发酵罐中, 通气量为1.0-1,5L/min,搅拌400-500转/分，pH为5.5-6.5，温度为30。C，时间为18-24小时.用显微镜观察， 无细菌污染，可转入二级发酵.
7. 权利要求2所述二级发酵，其特征为将一级发酵得到的菌种以10。/。的比例加入到500-5000L二级发酵 灌中，通气量为1.0-1.5L/min，搅拌400-500转/分，pH为5.5-6.5，温度为30°C,时间为18-24小时.经观察 菌丝粗壮健康无污染，可转入三级发酵.
8. 权利要求2所述三级发酵，其特征为将二级发酵得到的菌种以10。/。的比例加入到5000-50000L三级发 酵灌中，通气量为1.0-1.5L/min,搅拌400-500转/分,pH为5.5-6.5,温度为30°C,时间为18-24小时.经观 察菌丝粗壮健康无污染，可转入四级发酵
9. 权利要求2所述四级发酵，其特征为将三级发酵得到的菌种以5-10。/。的比例加入到50000-500000L四 级发酵灌中，培养液为产脂培养介质.通气量为1.5-2.0L/min，搅拌400-500转/分,pH为5.5-6.5,温度为30 °C，时间为四到五天.发酵完成后经离心过滤收取菌丝体，
10. 权利要求3所述斜面培养基配方，其特征为葡萄糖3-5%, NH4C10.25-0.35%,酵母提取液0.15%,磷酸 盐0.3-0.7%, MgS04 0.15%,琼脂2%,马铃薯汁10%.
11. 权利要求4所述液体培养基配方，其特征为工业废水97.5-98.8%,酵母提取液0.15%，尿素0.5-1.0%, 磷酸盐0.3-0.7%, MgS04 0.15%， CaCl2 0.005-0.010/。.
12. 权利要求5、 6、 7、 8所述发酵培养基配方，其特征为工业废水97.5-98.8%,酵母提取液0.15°/。，尿素 0.5-1.0%，磷酸盐0.3-0.7%， MgS04 0.150/o， CaCl2 0.005-0.01%.
13. 权利要求9所述产脂培养基配方，其特征为工业废水92.5-95.8%,糖蜜3-5°/。，酵母提取液0.15-0.3%, 尿素0.3-0.5%,磷酸盐0.3-0.7%, MgS04 0.15%, CaCl2 0.005-0.01%.
14. 权利要求13所述工业废水，特指热电厂或炸药厂排放的废水.
15. 权利要求1所述微生物菌丝体的油脂抽提工艺，其特征包括:(l)将菌丝体在60-90°C下真空干燥 15-20分钟.(2)将干菌丝体机械粉碎后用有机溶剂萃取。萃取剂为石油醚，萃取酸度在pH4.5-5，5，最佳配比 为50g千菌体/lL石油醚，萃取时间为8-16h,操作温度低于5(TC。 (3)有机溶剂通过蒸溜后回收循环使用. 最大程度上减少环境污染.
16. 权利要求1所述利用脂肪酶转化油脂生产生物柴油的工艺，其步骤为将微生物油脂加入到反应釜中， 并预热到30-40°C.加入微量乳化剂，搅拌5分钟，然后依此加入生物酶，水和短链醇(醇脂摩尔比3-6:1)， 高速搅拌10-15分钟，反应混合物呈乳状液，保温反应5-24小时，油脂原料可完全转化为生物柴油和副产 物甘油.
17. 根据权利要求16所述利用脂肪酶转化油脂生产生物柴油的工艺，其特征在于所述油脂为微生物油脂, 包括酵母油脂，海藻油脂，细菌油脂.
18. 根据权利要求16所述利用脂肪酶转化油脂生产生物柴油的工艺，其特征在于所述乳化剂油酸甲酯,含量为0.5%.
19. 根据权利要求16所述利用脂肪酶转化油脂生产生物柴油的工艺，其特征在于所述脂肪酶为植物脂肪 酶和微生物脂肪酶.
20. 根据权利要求19所述利用脂肪酶转化油脂生产生物柴油的工艺，其特征在于所述植物脂肪酶为油类 植物脂肪酶.
21. 根据权利要求19所述利用脂肪酶转化油脂生产生物柴油的工艺，其特征在于所述微生物脂肪酶为大 肠杆菌基因重组脂肪酶蛋白质，包括LipozymeAl, LipozymeA2， LipozymeA3或它们的混合物.
22. 根据权利要求16所述利用脂肪酶转化油脂生产生物柴油的工艺，其特征在于所述短链醇为甲醇或乙醇,。
全文摘要
本发明涉及一种新型生物柴油-微生物柴油的制备技术领域，特指一种以微生物培养制备油脂，然后用脂肪酶催化微生物油脂交酯化反应，来制备生物柴油的制备方法。本发明提出了一种以农副产品加工废弃物和工业废水为主要原料来培养一种高产油脂的酵母，以及以此微生物油脂为原料通过酶催化的油脂交酯化反应来生产生物柴油的新工艺。是同时涉及可再生能源生产和污水处理的双效生物工程。本发明具有产品得率高，成本低，治理环境污染，开发新能源，减轻我国能源紧张等优点。
文档编号C10G3/00GK101445741SQ20071017806
公开日2009年6月3日 申请日期2007年11月26日 优先权日2007年11月26日
发明者宋元达 申请人:北京有容建业科技发展有限责任公司