专利名称：培养水体中添加特殊成分物提高微藻细胞的油脂含量的制作方法
技术领域：
本发明属于微藻生物培养技术领域，具体是涉及一种在培养水体中，采用最佳化添加特殊成分物培养条件培养微藻，达到有效提高微藻细胞油脂含量的技术方法。
背景技术：
生物柴油(Biodiesel)即脂肪酸甲酯，是典型的“绿色能源”，它是各种以油料作物、工程微藻、动物油脂、餐饮业的废弃油脂等为原料，通过酯交换工艺制成的可代替石化柴油的再生性生物燃料，是一种可生物降解、无毒的可再生能源。生物柴油是生物质能的一种，作为一种清洁的低碳燃料，其含硫和含氮量均较低，同时灰分含量也很小，所以燃烧后SO2, NO和颗粒物排放量比化石燃料要小得多，是可再生能源中理想的清洁燃料之一。但是由于较高的原材料成本，生物柴油的价格远高于传统柴油，因此选取合适的、低成本的植物油脂资源来积极发展生物柴油产业，是今后的必然趋势。微藻具有分布广泛、生物量大、光 合作用效率高、环境适应能力强、生长周期短、繁殖快、产量高等突出特点，从微藻中萃取出的油脂通过酯交换反应可转化成脂肪酸甲酯，即生物柴油，因此，微藻是制备生产生物燃油潜在的良好材料。自1988年以来，国际上的发达国家如美国、德国、日本，到次发达的国家南非、巴西、韩国，以及发展中的国家印度、泰国等都先后开始投入资金，加大生物柴油研究开发的力度，将生物柴油作为传统柴油的替代品加以利用，并取得了较好的效果。大力发展生物柴油对国家经济的可持续发展、推进能源替代、减轻环境压力、环境保护以及控制城市大气污染等方面都具有重要的战略意义。不同于高等油料作物，微藻的生物化学成分容易随环境条件改变而发生变化。许多生长条件对微藻细胞脂质含量的积累都可以产生影响，如pH、氮元素的缺乏、光照强度、温度、盐度等培养的一般条件部会对积累有影响。在一般的生长条件下，微藻积累的油脂相对而言较少，而在环境胁迫条件下，油脂的积累则可能成倍地增长，因此探索微藻的最优产油培养条件显得尤为重要。影响微藻油脂含量的因素有很多，例如化学因素，主要表现在氮、磷、硅、硫酸盐等营养物质的可利用度方面。一般来说，氮缺乏最容易刺激微藻油脂尤其是三酰甘油的积累，许多实验已经证明了这一点。在硅藻中，硅元素成为其油脂代谢的关键影响因素。磷和硫酸盐的缺乏同样能导致大部分微藻积累油脂。温度和光照强度等物理因素也同样会影响微藻油脂的含量，当温度升高时，微藻饱和脂肪酸的含量增大；温度降低的时候，不饱和脂肪酸含量增大，但影响的程度依不同的微藻种类有很大的差异。在不同光强条件下，微藻的化学成分、色素含量以及光合反应活力都可能发生变化，一般而言，低光强能诱导极性油脂的合成，而高光强则能导致中性油脂的积累。微藻的生长过程包括延缓期、指数生长期、相对生长下降期、静止期与死亡期等五个阶段，每个阶段油脂的含量和成分都会有相当大的变化。一般来说，静止期是微藻油脂积累最多的阶段，也是饱和脂肪酸增加、不饱和脂肪酸减少的阶段。藻种的年龄对油脂和脂肪酸的积累也有影响。一般而言，老龄藻积累更多的油脂，因此微藻细胞处于不同的生长阶段时，会有不同的油脂累积能力。由于微藻油脂的含量随微藻种类的不同有较大差异，利用微藻制备生产生物燃油过程中，除了首先涉及到应筛选出具有较高的油脂含量的藻品系外，另一个关键重要的技术问题是必须解决如何通过调控培养条件，促进藻细胞油脂的生成和累积，达到培养的藻具有较高的油脂含量的效果，尤其是大水体情况下的调控培养。总的来说，应针对不同的微藻种类，开展有利于微藻细胞油脂生成和积累的相关研究，通过探讨单个或者多个影响因素作用效应，优化培养条件，使培养的微藻细胞油脂含量高。微藻细胞中的脂肪酸甘油酯的生物合成牵涉到许多不同的生物化学反应过程，这些生物化学反应过程的进行需要各种不同辅助因子的参与。因此，从微藻细胞生物合成油脂的关键性反应入手，需要考察各种不同关键性辅助因子可能通过生物化学反应途径，进而影响到微藻细胞脂肪酸甘油酯的生成和累积。通过在微藻培养体系中采用添加特殊成分物、增强关键性辅助因子的效应作用，提高微藻细胞油脂的生成和含量
发明内容
本发明所要解决的技术问题就是针对上面所述的背景技术，通过采用最佳化添加特殊成分物培养条件培养微藻，达到明显提高微藻细胞油脂含量的效果。属于微藻生物培养提高藻细胞油脂含量技术领域。通过设计7因子3水平的正交实验方案，同时运用ANOVA分析方法，考察主效应因子(磷酸钠、丙酮酸钠、柠檬酸钠、碳酸氢钠、泛酸钠、三氯化铁和生物素)对微绿球藻细胞油脂含量的影响，分析这些关键性因子对藻油脂含量影响程度大小的顺序。通过构建优化的藻油脂含量与添加特殊成分培养条件的相关响应面数学模型，确定出最佳化添加特殊成分培养条件。在最佳化添加特殊成分培养条件下，微藻细胞油脂含量可比无添加特殊成分培养的微藻细胞高62%以上，采用最佳化添加特殊成分培养条件培养微藻，可达到有效提高微藻细胞油脂含量。本发明采用的培养水体中添加特殊成分物提高微藻细胞的油脂含量的技术方法具有效果显著、操作实施简单可行等优点。目前尚缺少通过采用最佳化添加特殊成分培养条件培养微藻，有效促进微藻细胞油脂含量提高的相关研究和报道。本发明采用的研究材料和方法(I)微藻种类、培养及前处理本研究采用的微藻种类是微绿球藻。微藻细胞采用适宜的培养基成分、并按实验设计的方案条件进行培养。微藻细胞接种于三角烧瓶，营养盐并添加特殊成分物，在适宜的光照，温度，盐度条件下培养，每天摇动3-5次，至微藻细胞增殖到最大密度的稳定期，采收藻细胞，藻液离心浓缩，用蒸馏水洗涤、离心，去除微藻细胞盐分，湿藻细胞用冷冻干燥机处理后，制备成冷冻干燥藻粉作为萃取油脂之用。采用常规的酸热萃取法测定微藻细胞油脂含量，即称取一定量微藻干品，按每克干藻体加入一定浓度、体积量的盐酸，混和均匀，室温下静置处理一定的小时数，然后沸水浴处理适宜的时间，冷却后分别加入等体积的氯仿和甲醇，混匀摇动、充分萃取，离心后取上层液，旋转蒸发器上挥发除去溶剂后得到微藻油脂，称取微藻油脂重量。基于藻样品干重，微藻细胞油脂含量表达为mg. g—V，即藻油脂含量(％)=油脂重量/微藻干品重量。(2)微藻细胞调控培养的添加特殊成分物研究采用的添加特殊成分物为磷酸钠(Na3PO4. 12H20)、丙酮酸钠(CH3COCOONa)、碳酸氢钠(NaHCO3)、柠檬酸钠(Na3C6H5O7. 2H20)、泛酸钠(C9H16NaO5)、三氯化铁(FeCl3 *6H20)和生物素(Biotin，C10H16N2O3S)。(3)考察添加特殊成分物培养对微藻细胞油脂含量的影响通过设计7因子3水平的正交实验方案，同时运用ANOVA分析方法，考察主效应因子(磷酸钠、丙酮酸钠、柠檬酸钠、碳酸氢钠、泛酸钠、三氯化铁和生物素)对微绿球藻细胞油脂含量的影响，分析这些关键性因子对藻油脂含量影响程度大小的顺序。通过构建优化的藻油脂含量与添加特殊成分培养条件的相关响应面数学模型，确定出最佳化添加特殊成分培养条件。并从多个方面评价构建的数学模型的适配拟合性。(4)数学模型的构建经过尝试多种形式的变量响应性模式，最后确定出以采用多元二次回归模型(Quadratic model)的适配拟合效果最好，因而添加特殊成分物培养条件下获得的藻油脂含量实验数据采用下述的数学模型进行最小二乘法适配拟合，即模型的表达式为
权利要求
1.一种培养水体中添加特殊成分物提高微藻细胞的油脂含量的方法，其特征在于添加的特殊成分物是磷酸钠、丙酮酸钠、柠檬酸钠、碳酸氢钠、泛酸钠、三氯化铁和生物素。采用多因子多水平的正交实验方案，同时运用ANOVA分析方法，考察主效应因子(磷酸钠、丙酮酸钠、柠檬酸钠、碳酸氢钠、泛酸钠、三氯化铁和生物素)对微绿球藻细胞油脂含量的影响，分析这些关键性因子对藻油脂含量影响程度大小的顺序。通过构建优化的藻油脂含量与添加特殊成分培养条件的响应面数学模型，确定出最佳化添加特殊成分培养条件。在最佳化添加特殊成分培养条件下，使微藻细胞油脂含量达最高。
2.按照权利要求I所述的ー种培养水体中添加特殊成分物提高微藻细胞的油脂含量的方法，其特征是所述的用于提高微藻细胞的油脂含量的微藻可以是微绿球藻、小球藻、金藻、角毛藻、褐指藻等微藻，或是各种微藻的混合培养物。
3.按照权利要求I所述的ー种培养水体中添加特殊成分物提高微藻细胞的油脂含量的方法，其特征是所述的微藻培养水体中，加入一定量的磷酸钠。
4.按照权利要求I所述的ー种培养水体中添加特殊成分物提高微藻细胞的油脂含量的方法，其特征是所述的微藻培养水体中，加入一定量的丙酮酸钠。
5.按照权利要求I所述的ー种培养水体中添加特殊成分物提高微藻细胞的油脂含量的方法，其特征是所述的微藻培养水体中，加入一定量的柠檬酸钠。
6.按照权利要求I所述的ー种培养水体中添加特殊成分物提高微藻细胞的油脂含量的方法，其特征是所述的微藻培养水体中，加入一定量的碳酸氢钠。
7.按照权利要求I所述的ー种培养水体中添加特殊成分物提高微藻细胞的油脂含量的方法，其特征是所述的微藻培养水体中，加入一定量的泛酸钠。
8.按照权利要求I所述的ー种培养水体中添加特殊成分物提高微藻细胞的油脂含量的方法，其特征是所述的微藻培养水体中，加入一定量的三氯化鉄。
9.按照权利要求I所述的ー种培养水体中添加特殊成分物提高微藻细胞的油脂含量的方法，其特征是所述的微藻培养水体中，加入一定量的生物素。
全文摘要
本发明涉及一种在水体中添加特殊成分物培养微藻，提高藻细胞油脂含量的方法。属于微藻生物培养技术领域。具体操作实施过程为采用7因子3水平的正交实验方案，同时运用ANOVA分析方法，考察主效应因子(磷酸钠、丙酮酸钠、柠檬酸钠、碳酸氢钠、泛酸钠、三氯化铁和生物素)对微绿球藻细胞油脂含量的影响，分析这些关键性因子对藻油脂含量影响程度大小的顺序。通过构建优化的藻油脂含量与添加特殊成分培养条件的响应面数学模型，确定出最佳化添加特殊成分培养条件。在最佳化添加特殊成分培养条件下，微藻细胞油脂含量可比无添加特殊成分培养的微藻细胞高62％以上，采用最佳化添加特殊成分培养条件培养微藻，可达到有效提高微藻细胞油脂含量。
文档编号C12P7/64GK102776250SQ20111012301
公开日2012年11月14日 申请日期2011年5月11日 优先权日2011年5月11日
发明者林汝榕, 林祥志, 林翩然, 柯秀蓉, 蔡文旋, 邢炳鹏 申请人:国家海洋局第三海洋研究所