专利名称：具有双荧光标记的介孔二氧化硅纳米颗粒的制作方法
技术领域：
本发明涉及介孔二氧化硅纳米颗粒，具体涉及含有酸敏感的具有分子内酰胺环的罗丹明6G衍生物和异硫氰酸荧光素的双荧光标记的介孔二氧化硅纳米颗粒。
背景技术：
真核细胞内存在pH分布与细胞器特异相关这一特征，例如，细胞质是近乎中性的 (PH7.2)而溶酶体内则呈酸性(pH 6.0-4.0)。溶酶体内的酸性环境对于真核细胞的内吞、 自吞噬、细胞凋亡等生物学过程至关重要，在诸如细胞成熟、癌细胞扩散等过程中都能观察到溶酶体酸性改变这一现象，因此检测溶酶体内的PH对于科学研究有着重要意义。基于单个发光团的单荧光强度法在实际应用中有很多不足，例如加入量所造成的实验误差大；不可定量测量等。与此相比，比率荧光法则由于引入内参而避免了这些问题。即在某一个对 PH敏感的分子上，同时引入一个对pH不敏感的探针作为分子内参。目前已经有多种基于此方法的探针。例如，在荧光素上配对有罗丹明，量子点以及其他染料作为内参。目前已有报道含有分子内酰胺环的罗丹明衍生物在中性环境下没有荧光，而在酸性环境中由于分子内酰胺开环会生成具有强荧光的氨基罗丹明，这说明这类罗丹明衍生物是一种对PH有良好响应的染料。然而，基于这种染料的pH荧光比率探针还没有报道。介孔二氧化硅是一种具有良好生物兼容性和稳定性的纳米颗粒，可以利用细胞的内吞作用特异地聚集在溶酶体内。含有分子内酰胺环的罗丹明6G衍生物是一种随pH降低荧光强度显著升高染料，与之相反，荧光素是随着PH降低而荧光强度显著降低。有鉴于此，本发明提供一种具有双荧光标记的介孔二氧化硅纳米颗粒，利用分子内酰胺环的罗丹明6G衍生物和异硫氰酸荧光素对pH的不同响应，实现灵敏的pH比率测定。
发明内容
本发明提供一种具有双荧光标记的介孔二氧化硅纳米颗粒。利用罗丹明6G和异硫氰酸荧光素对PH的不同响应，实现灵敏的pH比率测定。为了实现上述目的，本发明的解决方案如下
具有双荧光标记的介孔二氧化硅纳米颗粒，它是由含有分子内酰胺环的罗丹明6G和异硫氰酸荧光素共同负载在二氧化硅上形成的介孔二氧化硅纳米颗粒。上述的具有双荧光标记的介孔二氧化硅纳米颗粒，，其制备方法包括
先由罗丹明6G在3-氨基丙基三乙氧基硅烷(简称APTS)中经过氨解得到含有分子内5-员内酰胺环的衍生物N-(罗丹明6G)-内酰胺-3-氨基丙基三乙氧基硅烷(简称 R6G-APTS)；再由异硫氰酸荧光素与(3-氨丙基)三乙氧基硅烷通过氨基反应生成异硫氰酸荧光素-3-氨基丙基三乙氧基硅烷(简称FITC-APTS)；最后，将N-(罗丹明6G)-内酰胺-3-氨基丙基三乙氧基硅烷(简称R6G-APTS)和异硫氰酸荧光素-3-氨基丙基三乙氧基硅烷(简称FITC-APTS)加入到由四乙氧基硅烷、十六烷基三甲基溴化铵(简称CTAB)和助剂组成的混合溶液中反应，除去杂质后制得产品(简称R6G-FITC-MSN)。以及，具有双荧光标记的介孔二氧化硅纳米颗粒作为检测细胞溶酶体内pH值的应用。R6G-APTS与FITC-APTS的合成路线表示如下
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本发明的具有双荧光标记的介孔二氧化硅纳米颗粒(R6G-FITC-MSN)的合成路线如图 1所示。罗丹明6G (R6G，以下简称R6G)在3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTS，以下简称 APTS)中氨基水解后反应生成无色、不发荧光的R6G-APTS。FITC和APTS的氨基反应生成FITC-APTS。将R6G-APTS和FITC-APTS放入四乙基原硅酸盐(TE0S，以下简称TE0S) 和十六烷基三甲基溴化铵中浓缩得到R6G-FITC-MSNs，经过除去CTAB和其他溶剂后得到R6G-FITC-MSNs纳米颗粒。通过透射电子显微镜(TEM)和扫描电子显微镜(SEM)显示 R6G-FITC-MSNs纳米颗粒呈多孔状，大小均一，平均直径约100纳米。对R6G-FITC-MSNS进行表征，表征结果如图2所示。在图2中，图A、图B、图C和图D分别表示为
A :R6G-FITC-MSN 在 pH 7. 5，7. O, 6. 5，6. O, 5. 5，5. O, 4. 5，4. O,和 3. 5 缓冲溶液中的荧光发射光谱(FITC的激发波长为488nm，R6G-amide的激发波长为530 nm)；横坐标为荧光发射波长，纵坐标的荧光发射强度；
B :R6G-FITC-MSN 在 pH 7. 5，7.0，6.5，6.0，5.5，5.0，4.5，4.0，和 3.5 缓冲溶液中的荧光发射光谱(FITC与R6G-amide的激发波长均为504 nm)；横坐标为荧光发射波长，纵坐标的荧光发射强度；
C 连接空心点而成的曲线为R6G-FITC-MSNs在双波长激发下的荧光发射强度比率的酸度滴定曲线(FITC的激发波长为488nm，R6G-amide的激发波长为530 nm)；连接实心点而成的曲线为R6G-FITC-MSNs在单波长激发下的荧光发射强度比率的酸度滴定曲线 (FITC与R6G-amide的激发波长均为504 nm)；横坐标为在550 nm与514 nm的荧光发射强度比率，纵坐标的缓冲溶液PH ；
4D R6G-FITC-MSN在水中对H+ (0.1 mM)的选择性，其它的干扰物质为H2A (5mM), HOCl (5mM)以及 Na+, K+，Ca2+，Co2+，Cu2+，Fe3+，Zn2+，Mg2+ 等离子(1 mM)(激发波长为533 nm)；横坐标为干扰分析物质，纵坐标为在553 nm的荧光发射强度)。在磷酸缓冲液环境中通过荧光放射光谱的方法检测R6G-FITC- MSNs对pH的响应，另外对含有分子内酰胺环的罗丹明6G衍生物(简称为R6G-内酰胺)和FITC分别在 533nm和488nm两个波长下进行激发检测二者对pH的响应(图2，A)。可以看到，当缓冲液 pH在5. 5至3. 5区间变化时，波长在552nm时激发出最高荧光强度(图2，A)。这个结果和 R6G在缓冲液pH为4时的检测结果一致，表明制备的R6G-FITC-MSNs纳米颗粒通过酸性介导的内酰胺开环而使之产生强烈的荧光。进一步表明，在PH从7. 0-3. 5的酸性区间从高到低变化时，R6G-FITC-MSNs中的、在细胞质中不发荧光的R6G-内酰胺是高度敏感的荧光报告单位。例如，PH4.0时发出的荧光强度比pH6.5强250倍。相反地，FITC(其最强激发波长为514nm)随着缓冲液的pH从5. 5提高到7. 5其荧光强度显著增强。FITC的pH荧光滴定光谱和其(PKa 6. 5)在碱性条件下的去质子化相一致。R6G-FITC-MSNs中的R6G-内酰胺在488nm单波长光激发条件下也表现出和FITC非常相似的PH响应比率，显示在FITC (供体)和罗丹明(受体)之间存在足够的荧光能量转移。R6G-内酰胺和FITC (I55tlnm/I514nm)的荧光强度比率通过双波长光或单波长光激发通过PH滴定检测。滴定曲线表明，在pH5. 5-3. 5区间，R6G-FITC-MSNs对pH的比率响应高度敏感(图2，C)，当pH从5变化到4时，其荧光强度增强了 10倍。R6G-FITC-MSNs这种对 PH变化超高灵敏度可归因于其独特的双荧光分子特性一R6G-内酰胺对酸性敏感而FITC 对碱性敏感。R6G-FITC-MSNs的pH最佳比率测定区间(Ph6. 5-3. 5)与溶酶体的pH区间 (pH6. 0-4. 0)重合，说明R6G-FITC-MSNs在监测活细胞溶酶体的酸性环境有很大的潜在应用前景。和氢离子一样，许多其他阳离子如钾离子、钙离子、镁离子等也广泛分布于细胞中。除此以外，在一定的刺激条件下，细胞会产生一些化学活性物质如次氯酸(H0C1)、 双氧水(H2O2)等。荧光素具有优异的选择性，经常被用来检测细胞内的pH。若要将 R6G-FITC-MSNs作为pH检测探针来使用，必须保证R6G-内酰胺对上述因素响应沉默。这方面的检测结果可见图2，D 其对各种阳离子(ImM)均不响应，也不会与(H2O2，HOCl, 5mM)发生反应而影响其对PH的敏感度。MSNs能够非常容易地被内吞到细胞中，导致溶酶体内细胞内吞粒子的聚集。为了检测到纳米微粒在细胞中的位置，R6G-FITC-MSNs被进行了聚乙二醇化修饰从而增加胶体的稳定性及最小化细胞试验的非特异性反应。细胞与纳米颗粒和Lyso Tracker Blue DND 22 anvitrogen公司出产的一种溶酶体染料)共染。氨基化的R6G信号(红色)可以清晰地被检测到与FITC染色部分(绿色)相似，这表明纳米颗粒上附着了用于溶酶体pH调节的内酰胺化R6G。共聚焦显微镜显示DND-22着色的图像(蓝色)与FITC信号相同。这证明了内酰胺化R6G-MSNs被内吞到细胞中，并且是通过特异位点运送到溶酶体中的。目前，FITC-葡聚糖被广泛用来检测细胞器内的酸性，其原理是荧光素在双波长光(458/497nm)激发下其发射荧光强度比与pH值响应。虽然其被广泛应用，但这种分析方法有很多缺陷，比如操作不方便以及灵敏度不高等。我们的检测系统以对酸敏感的、可在溶酶体内具备活性的内酰胺罗丹明作为PH报告单位，以荧光素作为内参荧光染料，克服了FITC-葡聚糖的上述缺陷。溶酶体的酸性通过利用单波长光激发荧光素/R6G-内酰胺荧光分子对进而通过比率法测定。荧光素作为最常用的荧光染料之一，和各种传统的流式细胞仪之间具有良好的兼容性。因此，在生物学的研究中，通过本发明检测系统可以很方便地高通量地进行溶酶体的酸性监测。总之，本发明描述了利用含有碱敏感的FITC荧光分子和酸敏感的罗丹明-内酰胺分子的介孔二氧化硅纳米颗粒通过比率法进行检测溶酶体的PH。相比于现有技术中的溶酶体PH探针，单波长可激发的R6G-FITC-MSN更灵敏，可以利用传统的流式细胞仪以及共聚焦显微镜通过比率法来方便地测定溶酶体的PH。溶酶体的酸化现象存在于多个细胞信号传导通路，囊胞性纤维症、哮喘等疾病都和它有关。R6G-MSN的酸性检测特性表明其对于这些疾病的早期诊断方面有广泛的应用前景。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步的详细描述，但附图和具体实施方式
不应理解为是对本发明进行的限定。图1是本发明具有双荧光标记的介孔二氧化硅纳米颗粒(R6G-FITC-MSN)的合成路线图。图2是本发明具有双荧光标记的介孔二氧化硅纳米颗粒(R6G-FITC-MSNs)的表征图。图3是本发明实施例6中比率法测定细胞中溶酶体酸性的分析图。图4是本发明实施例7中比率法测定细胞中溶酶体的酸性的标准曲线图。
具体实施例方式一种具有双荧光标记的介孔二氧化硅纳米颗粒，是由具有分子内酰胺环的罗丹明 6G衍生物和异硫氰酸荧光素共同负载在二氧化硅上形成的介孔二氧化硅纳米颗粒。一种具有双荧光标记的介孔二氧化硅纳米颗粒，其制备方法包括
a)将罗丹明6G与(3-氨丙基)三乙氧基硅烷在室温避光条件下振动混勻，直至罗丹明6G的荧光消失，得到R6G-APTS ；
b)异硫氰酸荧光素与(3-氨丙基)三乙氧基硅烷室温避光条件下振动混勻2小时，得到 FITC-APTS ；
c)将R6G-APTS和FITC-APTS用正硅酸乙酯混勻，再分别加入适量的去离子水、十六烷基三甲基溴化铵和氢氧化钠溶液，在水浴80°C加热条件下振动2小时混勻；然后将溶液离心分离，收集沉淀；再将沉淀用含1%HC1的乙醇处理并超声重新溶解5小时；重新溶解后的样品再通过离心、超声重新溶解，最后离心后得到具有双荧光标记的介孔二氧化硅纳米颗粒。下面结合实施例，具体描述具有双荧光标记的介孔二氧化硅纳米颗粒，及其制备和使用效果。
实施例1 :R6G-FITC-MSN的合成 DR6G-APTS 的合成
在一个带盖的管或瓶中将罗丹明6G (0.2 g)加入到10 ml APTS[ (3-氨丙基)三乙氧
6基硅烷]，室温避光条件下振动混勻，直至罗丹明6G的荧光消失，即可制备R6G-APTS ；
2)FITC-APTS 的合成
在一个带盖的管或瓶中将FITC (0.1 g)加入到5 ml APTS，室温避光条件下振动混勻 2小时，即可制备FITC-APTS ；
3)R6G-FITC-MSN 的合成
将 100 微升 R6G-APTS 和 100 微升 FITC-APTS 用 2. 3 ml 的 TEOS (tetraethyl orthosilicate)混勻，再加入装有240 ml 去离子水、0. 5 g CTAB (cetyltrimethylammonium bromide)、1. 75ml氢氧化钠(2 M)的干净三角瓶中，将三角瓶通过水浴调温至80摄氏度，并在此温度下振动2小时混勻，再在IOOOOrpm的离心条件下离心30分钟来收集沉淀(沉淀中主要成分即R6G-FITC-MSN，另外还含有未完全反应的CTAB 和其他反应物)。将沉淀用含1%HC1的乙醇处理并超声重溶5小时。重溶后的样品再通过离心、超声重溶、离心然后去掉上清(上清中包含有未完全反应的CTAB和其他反应物)，得到 R6G-FITC-MSN。
实施例2 双波长光激发下的R6G-FITC-MSN的比率法pH滴定用不同梯度PH的磷酸钠缓冲液将R6G-FITC-MSN配置成终浓度为1微克/毫升的溶液， 分别测定不同PH对应的488nm激发的荧光素激发光谱和533nm激发的罗丹明6G内酰胺激发光谱。如图2中的C图所示图中连接空心点而成的曲线为R6G-FITC-MSNs在双波长激发下的荧光发射强度比率的酸度滴定曲线(FITC的激发波长为488nm，R6G-amide的激发波长为530 nm)。在不同pH下罗丹明6G内酰胺所激发出的荧光随pH降低而升高，而 488nm激发的荧光素的荧光随着pH降低而降低。二者的荧光对pH响应不同，显示可以作为对PH敏感的荧光探针。实施例3 单波长光激发下的R6G-FITC-MSN的比率法pH滴定
用不同梯度PH的磷酸钠缓冲液将R6G-FITC-MSN配置成终浓度为1微克/毫升的溶液， 分别测定不同PH对应的488nm激发的荧光素激发光谱。如图2中的C图所示图中连接实心点而成的曲线为R6G-FITC-MSNs在单波长激发下的荧光发射强度比率的酸度滴定曲线(FITC与R6G-amide的激发波长均为504 nm)； 横坐标为在550 nm与514 nm的荧光发射强度比率，纵坐标的缓冲溶液pH。在不同pH下罗丹明6G内酰胺所激发出的荧光随pH降低而升高，而488nm激发的荧光素的荧光随着PH降低而降低。二者的荧光对pH响应不同，表明该荧光探针在单波长激发下仍然可以达到双波长激发的效果，更有利于该探针的实际应用。实施例4 共聚焦成像验证R6G-FITC-MSN纳米颗粒对pH的响应
L929细胞在含有0. 05 mg/ml的R6G-FITC-MSN的培养基中培养2个小时，去除培养液后洗两次，更换新培养基继续培养半个小时。对照组不做任何处理，实验组用含有50 nM BFA (Bafilomycin A, H-AIPase抑制剂，一种使得溶酶体pH从酸性变得中性的试剂)的培养液处理4个小时。接着用共聚焦荧光显微镜观察。发现BFA处理过的细胞内绿色荧光仍然存在，而红色荧光消失，说明FITC对pH没有明显响应，可以作为一个荧光内参；而R6G对 PH响应很好。实施例5 共聚焦成像验证R6G-FITC-MSN纳米颗粒对pH的响应L929细胞在含有0. 05 mg/ml的R6G-FITC-MSN的培养基中培养2个小时，去除培养液后洗两次，更换新培养基继续培养半个小时。对照组不做任何处理，实验组用含有50 nM BFA (Bafilomycin A, H-AIPase抑制剂，一种使得溶酶体pH从酸性变得中性的试剂)的培养液处理4个小时。接着用共聚焦荧光显微镜观察。发现BFA处理过的细胞内绿色荧光仍然存在，而红色荧光消失，说明FITC对pH没有明显响应，可以作为一个荧光内参；而R6G对 PH响应很好。实施例6 比率法测定细胞中溶酶体的酸性
L929细胞在含有0. 05 mg/ml的R6G-FITC-MSN的培养基中培养2个小时，去除培养液后洗两次，更换新培养基继续培养半个小时。再用含有50 nM BFA的培养液处理4个小时。 接着进行流式细胞仪分析，10000个细胞样本被分析。相关数据用WinMidi进行分析。如图 3所示纵坐标表示FITC所激发出来的荧光数值比上R6G激发所发射出来的荧光数值。FL2 表示Beckman流式细胞仪中555_575nm的通道，对应R6G所激发的荧光，FLl表示Beckman 流式细胞仪中525-M5nm的通道，对应FITC所激发的荧光。二者的比值显示，该探针可以在细胞内对PH变化响应良好，而且可以用常用的流式细胞仪的方法进行检测。图3中，CTRL 表示对照组，BafilomycinA表示为可以使得溶酶体pH从酸性到中性的一种试剂。实施例7 比率法测定细胞中溶酶体的酸性的标准曲线
L929细胞在含有0. 05 mg/ml的R6G-FITC-MSN的培养基中培养2个小时，去除培养液后洗两次，更换新培养基继续培养半个小时。再用含有尼日尼亚素(nigericin，一种可以使得膜内外PH相同的试剂)的不同pH值的磷酸盐缓冲液孵育10分钟。接着进行流式细胞仪分析，10000个细胞样本被分析。相关数据用WinMidi进行分析。如图4所示，纵坐标表示FITC所激发出来的荧光数值比上R6G激发所发射出来的荧光数值。FL2表示Beckman流式细胞仪中555-575nm的通道，FLl表示Beckman流式细胞仪中525_545nm的通道。二者的比值显示标准曲线线性拟合度良好，可以准确用来测量细胞内PH具体数值。可以理解，很多细节的变化是可能的，但这并不因此违背本发明的范围和精神，任何所属技术领域的普通技术人员对其所做的适当变化，皆应视为不脱离本发明专利的范
权利要求
1.具有双荧光标记的介孔二氧化硅纳米颗粒，其特征在于它是由含有分子内酰胺环的罗丹明6G和异硫氰酸荧光素共同负载在二氧化硅上形成的介孔二氧化硅纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的具有双荧光标记的介孔二氧化硅纳米颗粒，其特征在于，其制备方法包括先由罗丹明6G在3-氨基丙基三乙氧基硅烷中经过氨解得到含有分子内5-员内酰胺环的衍生物N-(罗丹明6G)-内酰胺-3-氨基丙基三乙氧基硅烷；再由异硫氰酸荧光素与 (3-氨丙基)三乙氧基硅烷通过氨基反应生成异硫氰酸荧光素-3-氨基丙基三乙氧基硅烷； 最后，将N-(罗丹明6G)-内酰胺-3-氨基丙基三乙氧基硅烷和异硫氰酸荧光素-3-氨基丙基三乙氧基硅烷加入到由四乙氧基硅烷、十六烷基三甲基溴化铵和助剂组成的混合溶液中反应，除去杂质后制得产品。
3.权利要求1所述的具有双荧光标记的介孔二氧化硅纳米颗粒作为检测细胞溶酶体内PH值的应用。
全文摘要
本发明公开一种具有双荧光标记的介孔二氧化硅纳米颗粒，它是由含有分子内酰胺环的罗丹明6G和异硫氰酸荧光素共同负载在二氧化硅上形成的介孔二氧化硅纳米颗粒。本发明还公开了具有双荧光标记的介孔二氧化硅纳米颗粒的制备方法，以及作为检测细胞溶酶体内pH值的应用。本发明利用含有碱敏感的FITC荧光分子和酸敏感的罗丹明-内酰胺分子的介孔二氧化硅纳米颗粒通过比率法进行检测溶酶体的pH，在囊胞性纤维症、哮喘等疾病的早期诊断方面有广泛的应用前景。
文档编号B82Y15/00GK102443389SQ20111026708
公开日2012年5月9日 申请日期2011年9月9日 优先权日2011年9月9日
发明者吴淑琪, 李 柱, 韩守法, 韩家淮 申请人:厦门大学