利用两种粒子的多功能生物材料接合体的制备方法及从中制得的多功能生物材料接合体的制作方法

利用两种粒子的多功能生物材料接合体的制备方法及从中制得的多功能生物材料接合体的制作方法
【专利摘要】本发明涉及多功能生物材料接合体的制备方法及利用该制备方法制备的多功能生物材料接合体，更详细地涉及，用作用于检测微生物等的生物传感器的多功能生物材料接合体的制备方法及利用该制备方法制备的多功能生物材料接合体。上述多功能生物材料接合体的制备方法包括：步骤（a），将蛋白质涂敷于具有磁性或荧光特性的第一纳米粒子；步骤（b），将具有金属特性的第二纳米粒子吸附于涂敷有蛋白质的上述第一纳米粒子来制备接合体；以及步骤（c），将生物材料吸附于上述接合体来制备多功能生物材料接合体。在本发明中，根据本发明的多功能生物材料接合体的制备方法利用两种粒子来能够防止纳米粒子沉淀并容易固定生物材料，且能够制备具有多功能的生物材料接合体。并且，利用上述方法制备的多功能生物材料接合体可用于检测微生物，可检测至101cfu浓度的微生物。
【专利说明】利用两种粒子的多功能生物材料接合体的制备方法及从中制得的多功能生物材料接合体
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及多功能生物材料接合体的制备方法及利用该制备方法制备的多功能生物材料接合体，更详细地涉及，用作用于检测微生物等的生物传感器的多功能生物材料接合体的制备方法及利用该制备方法制备的多功能生物材料接合体。
【背景技术】
[0002]结合有生物材料的纳米及微米粒子广泛使用于如食品、医疗、诊断、生命科学的各种领域中的生物感测、生物成像、分离等。举例说，在免疫传感领域中，为了实现基于抗原一抗体间的结合的对象物质检测，利用抗体磁性纳米粒子结合体及抗体一金纳米粒子(Yu-Hui Ba1.et al., Anal.135:1672-1679，2010)。
[0003]作为最影响抗原一抗体反应结合体形成的因素中一个是抗体固定化方法，已开发了各种固定化技术，且用于结合蛋白质的方法有多种。举例说，利用化学吸附与物理吸附的方法、利用作为与金进行特异性结合的氨基酸的半胱氨酸(cysteine)来使金纳米粒子与蛋白质相结合的方法、使在金纳米粒子生成组装单分子膜后利用单分子膜的官能团来与蛋白质以共价键合方式接合的方法、将抗生物素蛋白(avidin)吸附于金纳米粒子的表面后，与结合有生物素(biotin)的蛋白质相结合的方法(ZHANG zhiFeng et al., Sci china serB-Chem.50 (I): 127-134，2007)等。
[0004]但是，以往开发的固定化技术根据蛋白质的特性，如pH的固定化反应条件不同，纳米粒子的情况下存在不能均匀地分散而凝聚在一起的问题。
[0005]韩国登陆特许第0962286号公开用于检测食物中毒菌的磁芯金纳米粒子及其制备方法，以及利用上述纳米粒子的食物中毒检测方法，其特征在于，包括，制备包含磁性物质的磁芯的步骤；利用胺(amine)官能团来使上述磁芯的表面改性的步骤；以及在用上述胺(amine)官能团来表面改性的磁芯表面上形成金粒子层的步骤。
[0006]然而，其中存在如下的缺点，用胺官能团使磁芯的表面改性时发生的化学反应的再现性或有效性下降，且在溶液中发生凝聚现象。并且存在如下麻烦，用于形成金粒子层的反应时间长，且只有另行利用表面等离子体共振(SPR, Surface plasmon resonance)设备才能检测到食物中毒菌。
[0007]据此，本发明人为了解决上述问题而精心努力的结果确认到，将蛋白质涂敷于具有磁性或荧光特性的第一纳米粒子之后，将具有金属特性的第二纳米粒子吸附于上述第一纳米粒子来制备接合体，将生物材料吸附于接合体的情况下，不经过繁杂的改性过程也能够防止纳米粒子的沉淀并容易固定生物材料，并且利用涂敷于第一纳米粒子的蛋白质的特性和吸附于第二纳米粒子的生物材料的特性来多功能地检测或分离目的物质，由此完成了本发明。

【发明内容】
[0008]本发明的目的在于，提供能够多功能地检测或分离目的物质的生物材料接合体及其制备方法。
[0009]本发明的另一目的在于，提供能够在现场利用简单的方法来检测微生物的检测方法。
[0010]用于达成上述目的，本发明提供多功能生物材料接合体的制备方法，上述方法包括:步骤(a)，将蛋白质涂敷于具有磁性或荧光特性的第一纳米粒子；步骤(b)，将具有金属特性的第二纳米粒子吸附于涂敷有蛋白质的上述第一纳米粒子来制备接合体；以及步骤(C)，将生物材料吸附于上述接合体来制备多功能生物材料接合体。
[0011]并且，本发明提供多功能生物材料接合体，其特征在于，在具有磁性或荧光特性的第一纳米粒子涂敷有蛋白质，在上述蛋白质吸附有具有金属特性的第二纳米粒子，且在上述第二纳米粒子吸附有生物材料。
[0012]并且，本发明提供生物传感器，其特征在于，包含多功能生物材料接合体。
[0013]并且，本发明提供利用多功能生物材料接合体的微生物的高速检测方法，上述方法包括:步骤(a)，将多功能生物材料接合体及含有检测对象微生物的试样混合而反应，上述多功能生物材料接合体中，在具有磁性或荧光特性的第一纳米粒子涂敷有蛋白质，在上述蛋白质吸附有具有金属特性的第二纳米粒子，且在上述第二纳米粒子吸附有与检测对象微生物进行特异性结合的抗体；步骤(b)，使上述反应液依次通过微生物凝聚用膜及微生物捕获用过滤膜，来使未与微生物反应的多功能生物材料接合体透过，并选择性地分离出多功能生物材料接合体一微生物复合体；以及步骤(C)，测定在上述微生物捕获用过滤膜中捕获的多功能生物材料接合体一微生物复合体的有无或多功能生物材料接合体一微生物复合体的浓度。
【专利附图】

【附图说明】
[0014]图1为示出在制备根据本发明的磁性纳米粒子与金纳米粒子的复合体后，在上述复合体上固定抗体的方法的简图。
[0015]图2为使用以下两种抗体来分离IO5Cfu的金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的分离效率及测定上清液的活菌数的图表，上述两种抗体为不利用金纳米粒子来对抗体进行固定化的磁性纳米粒子(头孢甲肟)一抗一金黄色酿脓葡萄球菌单克隆抗体(MNP (CMX) -ant1-Staphylococcus aureus mAb)及利用金纳米粒子来对抗体进行固定化的磁性纳米粒子(头孢甲肟)一金纳米粒子一抗一金黄色酿脓葡萄球菌单克隆抗体(MNP(CMX)-AuNP-ant1-Staphylococcusaureus mAb)(对照组(A)、磁性纳米粒子一牛血清白蛋白(MNP-BSA) (B)、磁性纳米粒子一抗一金黄色酿脓葡萄球菌单克隆抗体(MNP-ant1-Staphylococcus aureus mAb) 10 μ g/ml (C)、涂敷有牛血清白蛋白的磁性纳米粒子一 5X金纳米粒子一抗一金黄色酿脓葡萄球菌单克隆抗体(MNP-5X AuNP-ant1-Staphylococcus aureus mAb) 10 μ g/ml (D) + 105cfu 金黄色酿胺葡萄球菌)。
[0016]图3为使用根据本发明一实施例的涂敷有牛血清白蛋白的磁性纳米粒子(头孢甲肟)-5X金纳米粒子一抗一金黄色酿脓葡萄球菌单克隆抗体来确认不同浓度的金黄色酿脓葡萄球菌对于接合体的固定化状态的结果(10°cfu (A)、5X IO4Cfu⑶、5X IO5Cfu(C)、5X IO6Cfu⑶+涂敷有牛血清白蛋白的磁性纳米粒子一5X金纳米粒子一抗一金黄色酿脓葡萄球菌单克隆抗体(MNP(CMX)-5XAuNP-ant1-Staphylococcus aureus mAb))。
[0017]图4为使用利用根据本发明的固定化方法来制备的接合体，通过接合体的金纳米粒子的扩增处理，确认不同浓度(图3)的金黄色酿脓葡萄球菌的固定化状态的结果(IO0Cfu(A)、5X IO4Cfu(B)、5X 105cfu(C)、5X IO6Cfu(D) + 涂敷有牛血清白蛋白的磁性纳米粒子一 5X金纳米粒子一抗一金黄色酿脓葡萄球菌单克隆抗体(MNP(CMX)-5XAuNP-ant1-Staphy lococcus aureus mAb))。
[0018]图5为使用根据本发明的一实施例的涂敷有牛血清白蛋白的磁性纳米粒子(对氨基水杨酸)-5X金纳米粒子一抗一金黄色酿脓葡萄球菌单克隆抗体(MNP(PAS)-5XAuNP-ant 1-Staphy lococcus aureus Ab)来以不同浓度测定金黄色酿脓葡萄球菌的结果(IO0Cfu (A) ,5 X IO4Cfu (B)、I X 105cfu (C) ,5 X 106cfu (D) ,5 X 106cfu (E) +涂敷有牛血清白蛋白的磁性纳米粒子(对氨基水杨酸)一 5 X金纳米粒子一抗一金黄色酿脓葡萄球菌单克隆抗体(MNP(PAS)-5XAuNP-ant1-Staphylococcus aureus mAb))。
[0019]图6为通过对图5进行银纳米粒子的扩增处理来以不同浓度测定金黄色酿脓葡萄球菌的结果(IO0Cfu (A) ,5 X IO4Cfu (B)、IxlO5Cfu (C) ,5 X 105cfu (D) ,5 X 106cfu (E) + 涂敷有牛血清白蛋白的磁性纳米粒子(对氨基水杨酸)一 5X金纳米粒子一抗一金黄色酿脓葡萄球菌单克隆抗体(MNP(PAS)-5XAuNP-ant1-Staphylococcus aureus mAb))。
[0020]图7为针对涂敷有牛血清白蛋白的磁性纳米粒子一 5X金纳米粒子一抗一金黄色酿胺葡萄球菌单克隆抗体(MNP(PAS)-5XAuNP-ant1-Staphylococcu saureus mAb),确认是否与其他菌类发生交叉反应的结果(10°细胞(A)、5X IO5Cfu沙门氏菌细胞(Salmonellacells) (B)、5X IO5Cfu 单核细胞增多性李司戎氏菌(Listeria monocytogenes cells) (C)、5X IO5Cfu金黄色葡萄球菌细胞(S.aureus cells) (D)、5X 105cfu大肠杆菌细胞(E.colicells) (E) +磁性纳米粒子(对氨基水杨酸)—5X金纳米粒子一抗一金黄色酿脓葡萄球菌单克隆抗体(MNP(PAS)-5XAuNP-ant1-Staphylococcus aureus mAb))。
[0021]图8为使用以下两种抗体来以不同浓度测定金黄色酿脓葡萄球菌的结果，上述两种抗体为不利用金纳米粒子来对抗体进行固定化的磁性纳米粒子(对氨基水杨酸)一抗一金黄色酿脓葡萄球菌单克隆抗体(MNP(PAS)-ant1-Staphylococcus aureus mAb)及利用金纳米粒子来对抗体进行固定化的涂敷有牛血清白蛋白的磁性纳米粒子(对氨基水杨酸)-金纳米粒子一抗一金黄色酿脓葡萄球菌单克隆抗体
[0022](MNP(PAS)-AuNP-ant1-Staphylococcus aureus mAb) (10°cfu (A、D)、5X 105cfu(B、E)、5X IO6Cfu (C、F) +磁性纳米粒子(对氨基水杨酸)一抗一金黄色酿脓葡萄球菌单克隆抗体(MNP(PAS)-ant1-Staphylococcus aureus mAb)、涂敷有牛血清白蛋白的磁性纳米粒子(对氨基水杨酸)-5X金纳米粒子一抗一金黄色酿脓葡萄球菌单克隆抗体(MNP(PAS)-5XAuNP-ant1-Staphylococcus aureus mAb))。
[0023]图9为通过对图8进行金纳米粒子的扩增处理来以不同浓度测定金黄色酿脓葡萄球菌的结果(10°cfu (A、D)、5X IO5Cfu (B、E)、5X 106cfu (C、F) +磁性纳米粒子(对氨基水杨酸)一抗一金黄色酿脓葡萄球菌单克隆抗体(MNP(PAS)-ant1-Staphylococcus aureusmAb)、涂敷有牛血清白蛋白的磁性纳米粒子(对氨基水杨酸)-5X金纳米粒子一抗一金黄色酿胺葡萄球菌单克隆抗体(MNP (PAS) -5x AuNP-ant 1-Staphy lococcus aureus mAb))。[0024]图10为根据本发明一实施例的使用以下两种抗体并通过荧光信号来测定不同浓度的C反应蛋白(CRP)的结果，上述两种抗体为涂敷有牛血清白蛋白的荧光乳胶微球一 5X银纳米粒子一抗一 C 一反应蛋白多克隆抗体(fluorescent latexbead-5 XAgNP-ant1-C-reactive protein pAb)及涂敷有牛血清白蛋白的突光乳胶微球一 5X金纳米粒子一抗一 C 一反应蛋白多克隆抗体(fluorescent latexbead_5x AuNP-ant1-C-reactive protein pAb)(涂敷有牛血清白蛋白的突光乳胶微球一 5X银纳米粒子一抗一 C 一反应蛋白多克隆抗体(fluorescent latex bead_5xAuNP-ant 1-C-reactive protein pAb)、涂敷有牛血清白蛋白的涂敷有牛血清白蛋白的突光乳胶微球一 5X金纳米粒子一抗一 C 一反应蛋白多克隆抗体(fluorescent latexbead-5XAuNP-ant1-C-reactive protein pAb) + 0 μ g/ml (A、D、A，、D，)、I μ g/ml (B、E、B’、E’)、10 μ g/ml (C、F、C’、F’)+金纳米粒子一抗一C —反应蛋白单克隆抗体(AuNP-ant1-C-reactive protein mAb)、银金纳米粒子一抗一 C 一反应蛋白多克隆抗体(AgNP-ant1-C-reactive protein mAb))。
[0025]图11为使用根据本发明一实施例的涂敷有牛血清白蛋白的荧光乳胶微球一 5X银纳米粒子一抗一 C 一反应蛋白多克隆抗体(fluorescent latex bead_5xAgNP-ant1-C-reactive protein pAb)来以不同浓度测定C反应蛋白的结果(涂敷有牛血清白蛋白的突光乳胶微球一 5X银纳米粒子一抗一 C 一反应蛋白多克隆抗体(fluorescentlatex bead-5 XAgNP-ant1-C-reactive protein pAb)+ 0 μ g/ml (A)、I μ g/ml (B)、10 μ g/ml (C) +金纳米粒子一抗一 C 一反应蛋白单克隆抗体(AuNP-ant1-C-reactive proteinmAb))。
[0026]图12为分别使用以下两种抗体来以不同浓度测定C反应蛋白的结果，上述两种抗体为利用根据本发明的固定化方法制备的涂敷有牛血清白蛋白的SOnm及90nm的磁性纳米粒子(Fe304、Fe304-Si02)—5X金纳米粒子一抗一C —反应蛋白单克隆抗体(MNP (Fe3O4, Fe3O4-Si02)-5XAuNP-ant1-C-reactive protein mAb) (0 (A、E)、lOng/ml (B、F)、lOOng/ml (C、G)、l μ g/ml (D、H)C反应蛋白+涂敷有牛血清白蛋白的80nm、90nm的磁性纳米粒子(Fe304、Fe3O4-SiO2)-5 X金纳米粒子一抗一C—反应蛋白单克隆抗体(MNP (Fe3O4, Fe3O4-SiO2) -5 XAuNP-ant1-C-reactive protein mAb)。
[0027]图13为使用以下抗体来对不同浓度HlNl菌进行荧光测定的结果，上述抗体为利用根据本发明的固定化方法来制备的涂敷有牛血清白蛋白的荧光乳胶微球一 5X银纳米粒子一抗一 Hl 单克隆抗体(fluorescent latex bead-5XAgNP-ant1-HlmAb)(涂敷有牛血清白蛋白的突光乳胶微球一 5X银纳米粒子一抗一 Hl单克隆抗体(fluorescent latexbead-5XAgNP-ant1-HlmAb) + 10°pfu (A)>IO1Pfu (B)> 102pfu (C)、103pfu (D) + 104pfu(E) +磁性纳米粒子(对氨基水杨酸)-Hl单克隆抗体(MNP (CMX)-HlmAb))。
[0028]图14为针对涂敷有牛血清白蛋白的荧光乳胶微球一 5X银纳米粒子一抗一 Hl单克隆抗体(fluorescent latex bead-5XAgNP-ant1-HlmAb),确认是否与相互不同的亚型病毒发生交叉反应的结果(涂敷有牛血清白蛋白的荧光乳胶微球一 5X银纳米粒子一抗一 Hl单克隆抗体(fluorescent latex bead-5XAgNP-ant1-HlmAb) + 10°pfu (A)> 103pfuHlNl(B)UO3pfuH3N2 (C)U03pfuH5N2 (D) +磁性纳米粒子(头孢甲肟)一 Hl单克隆抗体(MNP(CMX)-HlmAb))。[0029]图15为针对涂敷有牛血清白蛋白的荧光乳胶微球一 5X银纳米粒子一抗一 H5单克隆抗体(fluorescent latex bead-5XAgNP-anti_H5mAb),确认是否与相互不同的亚型病毒发生交叉反应的结果(涂敷有牛血清白蛋白的荧光乳胶微球一 5X银纳米粒子一抗一 Hl单克隆抗体(fluorescent latex bead-5XAgNP-ant1-HlmAb) + 10°pfu (A)> 103pfuHlNl(B)UO3pfuH3N2 (C)U03pfuH5N2 (D) +磁性纳米粒子(头孢甲肟)一 H5单克隆抗体(MNP(CMX)-H5mAb))。
[0030]图16为使用以下两种抗体来确认在血液的单核细胞(mononuclear cell)中的T细胞(T cell)的分离率的结果，上述两种抗体为不使用银纳米粒子来对抗体进行固定化的未染色乳胶微球一抗一人体⑶3抗体(undyed latex bead-ant1-human Q)3Ab)及使用银纳米粒子来对抗体进行固定化的天然乳胶微球一 5X银纳米粒子一抗一人体CD3抗体(undyed latex bead-5XAgNP-ant1-human CD3Ab)(对照组(A)、未染色乳胶微球一抗一人体⑶3 单抗体(undyed latex bead-ant1-human Q)3Ab) (B)、对照组(C)、涂敷有牛血清白蛋白的未染色乳胶微球一 5X银纳米粒子一抗一人体⑶3单抗体(undyed latexbead-5XAgNP-ant1-human CD3Ab) (D) +血液))。
[0031]图17为利用涂敷有辣根过氧化物酶(HRP)的金纳米粒子一金纳米粒子抗体接合体，结合横向流动分析(later-flow assay)条与化学发光法来分析肌I丐蛋白I (TroponinI)的结果。
【具体实施方式】
[0032]在本发明中，要确认能够制备如下的多功能生物材料接合体，在具有磁性或荧光特性的第一纳米粒子涂敷蛋白质后，吸附具有金属特性的第二纳米粒子来制备接合体，在该接合体重新吸附生物材料的情况下，生物材料不凝聚，固定效果好，并应用涂敷于第一纳米粒子的蛋白质及生物材料的特性来提高检测或分析能力。
[0033]在本发明中，在具有磁性或荧光特性的第一纳米粒子涂敷蛋白质后，在涂敷有蛋白质的第一纳米粒子吸附具有金属特性的第二纳米粒子来制备接合体之后，在接合体吸附生物材料，由此制备多功能生物材料接合体。
[0034]即，在本发明的一实施例中，制备涂敷有牛血清白蛋白的磁性纳米粒子(MNP)-金纳米粒子(gold nanoparticle, AuNP) 一抗体及涂敷有牛血清白蛋白的突光乳胶微球(fluorescent latex beads, LB) 一银纳米粒子(silver nanoparticle, AgNP)或金纳米粒子(gold nanoparticle, AuNP)一抗体的结果,确认到不仅抗体的固定化效率优秀，而且利用该物质的情况下，能够以优秀的灵敏度检测金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcu saureus)。
[0035]因此，一观点上，本发明涉及多功能生物材料接合体的制备方法，包括:步骤(a)，在具有磁性或荧光特性的第一纳米粒子涂敷蛋白质；步骤(b)，在涂敷有蛋白质的上述第一纳米粒子吸附具有金属特性的第二纳米粒子来制备接合体；以及步骤(C)，在上述接合体吸附生物材料来制备多功能生物材料接合体。
[0036]并且，在另一观点上，本发明涉及多功能生物材料接合体，在具有磁性或荧光特性的第一纳米粒子涂敷有蛋白质，在上述蛋白质吸附有具有金属特性的第二纳米粒子，且在上述第二纳米粒子吸附有生物材料。
[0037]在本发明中，上述第一纳米粒子可利用具有磁性或荧光特性的物质，可举例乳胶、磁、二氧化娃、量子点，金属纳米粒子等。
[0038]在本发明中，上述第二纳米粒子可利用具有金属特性的物质，可举例金、银、铜、钼等。优选地，上述第二纳米粒子利用易于吸附蛋白质的物质。
[0039]在此，“纳米粒子”是指大小为Inm至IOOnm左右的超微粒子。特别小的纳米粒子相对于一般的块状物质具有不同的特性。相对于以往的物质，纳米粒子具有显著增加的比表面积。由于这种高的比表面积，具有与以往物质不同的表面效果，粒子的大小越小，位于表面的分子数越增加。粒子的粒径成5nm，则构成粒子的分子中的50%将位于表面，粒子的大小成2nm，则其比例到达90%。由于位于表面的分子的比例相对高，因此与以往物质相比，纳米粒子表面能量对于结合能量比率更大。粒子的大小从20nm变小至Inm,表面能量对于结合能量比例则从5%增加至约30%。构成粒子的原子借助周边原子间的相互作用处于引力与反弹力形成平衡的能量稳定状态。但是位于表面的原子只存在借助内部原子的引力，因此处于高能量状态。因这种表面效果，纳米粒子具有在催化剂或催化剂的表面反应中出现的表面活性、熔点下降、低温烧结性等性质。
[0040]在本发明中，优选地，上述第一纳米粒子的粒子大小大于第二纳米粒子的粒子大小。
[0041]例如，上述第一纳米粒子大小为20?500nm,上述第二纳米粒子的大小为5?IOOnm0
[0042]第一纳米粒子的粒子大小大于第二纳米粒子的大小的的情况下，存在能够容易吸附纳米粒子的效果。
[0043]在本发明中，涂敷上述第一纳米粒子的蛋白质是利用吸附特性，无需经过改性过程地容易对要固定的生物材料进行固定化，可利用牛血清白蛋白(BSA)、过氧化物酶(peroxidase)、喊性憐酸酶(alkaline phosphatase)、葡糖氧化酶(glucose oxidase)、胆碱氧化酶(choline oxidase)、链霉亲和素(Streptavidin)、脱脂乳(skim milk)、血清、肽(peptide)等。
[0044]S卩，具有如下效果，如上所述，用蛋白质涂敷第一纳米粒子的情况下，利用能够易于吸附蛋白质的第二纳米粒子，只利用吸附方法使多功能生物材料接合。
[0045]本发明的特征在于，上述生物材料选自包含抗体、酶、脱氧核糖核酸(DNA)、适配体(aptamer)、妝核酸(PNA, peptide nucleic acids)及配体(ligand)的组。
[0046]在另一观点上，本发明涉及一种生物传感器，其特征在于，包含上述多功能生物材料接合体。
[0047]在本发明的另一实施例中，确认到将与微生物进行特异性结合的抗体用作生物物质来制备多功能生物材料接合体后，将其与微生物进行反应的情况下，能够高速检测微生物。
[0048]因此，在另一观点上，本发明涉及利用多功能生物材料接合体的微生物的高速检测方法，包括:步骤(a)，将多功能生物材料接合体及含有检测对象微生物的试样混合而反应，上述多功能生物材料接合体中，在具有磁性或荧光特性的第一纳米粒子涂敷有蛋白质，在上述蛋白质吸附有具有金属特性的第二纳米粒子，且在上述第二纳米粒子吸附有与检测对象微生物进行特异性结合的抗体；步骤(b)，使上述反应液依次通过微生物凝聚用膜及微生物捕获用过滤膜，来使未与微生物反应的多功能生物材料接合体透过，并选择性地分离出多功能生物材料接合体一微生物复合体；以及步骤(C)，测定在上述微生物捕获用过滤膜中捕获的多功能生物材料接合体一微生物复合体的有无或多功能生物材料接合体一微生物复合体的浓度。
[0049]在上述微生物高速检测方法中利用的凝聚用膜及微生物捕获用过滤膜、分离方法及测定方法，可利用本申请的发明人在先申请的公开特许10-2011-0058711中记载的膜及方法。
[0050]例如，上述微生物凝聚用膜的特征在于，选自包含聚二甲硅氧烷(P DMS，polydimethylsi 1xane )、具有粘结性的高分子及招胶、橡胶及乳胶以及丝网印刷用楽;料的组。优选地，上述微生物凝聚用膜可以是将如银浆或碳浆的丝网印刷用浆料以规定大小的孔的形状，并利用丝网印刷方法来涂敷于上述捕获用过滤膜来制备的膜。由此能够以一体型构成凝聚用膜和捕获用过滤膜，丝网印刷方法可利用本领域公知的方法。
[0051]作为一例，丝网印刷方法可为如下的方法，将由尼龙(Nylon)、聚酯(Polyester)或不锈钢等编织的丝网固定于木或铝等的框，并利用手工或光化学方法来在其上面制备板膜来遮盖除了必要的图像以外的部分，并在其里面放丝网印刷用浆料，利用称作橡胶滚轴(Squeegee)的勺子加压丝网内面地移动，则浆料通过没有板膜的部分的网来印刷于位于板下面的被印刷体上。
[0052]本发明的特征在于，上述捕获用过滤膜的细孔大小为IOOnm?10 μ m。固定有未与微生物结合的抗体的纳米粒子通过捕获用过滤膜，未与固定有抗体的纳米粒子结合的微生物即使被捕获用过滤膜过滤也不发送信号。因此，只有与固定有抗体的纳米粒子相结合的微生物呈现在捕获用过滤膜上固定有抗体的纳米粒子具有的固有颜色、荧光等。
[0053]在本发明的一实施例中使用了细孔大小为1.2μπι的捕获用过滤膜，但对于本领域的普通技术人员来说，细孔大小不局限于此是显而易见的，优选地，与固定有抗体的纳米粒子进行反应的微生物的捕获用过滤膜可使用选自IOOnm至10 μ m的细孔大小的捕获用过滤膜。
[0054]在本发明中，上述捕获用过滤膜可使用选自包含硝酸纤维素(nitiOcellulose)、聚碳酸酯(polycarbonate)、尼龙(nylon)、聚酯(polyester)、醋酸纤维素(celluloseacetate)、聚砜(poly sulfone)及聚乙烧砜(poly ethane sulfone)的组中的捕获用过滤膜。
[0055]本发明的特征在于，上述步骤(b)的选择性地进行分离的步骤利用真空、离心分离或吸收法。
[0056]换句话说，纳米粒子一抗体一微生物复合体经过凝聚用膜而被捕获用过滤膜过滤时，可利用真空，或者离心分离或者吸收于过滤膜的原理来进行选择性的分离。
[0057]在本发明中，上述步骤(C)的测定可利用电荷稱合器件摄相机((XD camera)或吸光度来进行测定。
[0058]实施例
[0059]以下，通过实施例对本发明进行更详细地说明。但是这些实施例只是用于例示本发明，本发明的范围不局限于此，这对于本领域普通技术人员而言是显而见的。
[0060]实施例1:磁性纳米粒子的抗体接合体及荧光微球的抗体接合体的制备
[0061]实施例1-1:磁性纳米粒子(MNP) —牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA) —涂敷有蛋白质的磁性纳米粒子(MNP) —金纳米粒子(gold nanoparticle, AuNP) —抗体
[0062]磁性纳米粒子(magnetic nanoparticle, MNP)溶液中添加牛血清白蛋白(BSA, bovine serum albumin)溶液(ρΗ7.4,溶解于 IOmM 的憐酸盐(Phosphate)缓冲溶液)，使得最终体积达到Iml来进行混合后，添加IOmM的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，N-hydroxysuccinnimide ;生物核心有限公司(Biacore Inc))与 2mM 的 二氯乙烧(EDC,ethylene dichloride ;生物核心有限公司(Biacore Inc)),放置30分钟。在上述溶液添加IOOmM的甘氨酸(glycin)溶液(pH7.4,溶解于IOmM的磷酸盐(Phosphate)缓冲溶液)0.1ml并放置30分钟后，各分注200 μ 1，在4°C温度下，以6000rpm转速进行20分钟离心分离后，去除上清液。接着，添加硼酸盐(borate)缓冲溶液(10mM，pH8.5) 0.2ml来混合之后，以6000rpm转速进行20分钟离心分离后，再次去除上清液。将上述过程再反复一次后，最终将0.1%的牛血清白蛋白(pH8.8,溶解于IOmM的碳酸氢钠(sodium bicarbonate)缓冲溶液)溶液添加到IOOnm的磁性纳米粒子一牛血清白蛋白0.4ml来制备涂敷有牛血清白蛋白的磁性纳米粒子。
[0063]上述磁性纳米粒子溶液使用基质(matrix)为羧甲基葡聚糖(Carboxymethyl-dextran)的IOOnm磁性纳米粒子溶液(头孢甲厢(CMX), 25mg/ml,凯米歇尔公司(Chemicell)) 100 μ 1、由聚丙烯酸(polyac rylic
[0064]acid)形成的IOOnm磁性纳米粒子溶液(对氨基水杨酸(PAS), 50mg/ml,凯米歇尔公司(Chemicell)) 60 μ l、80nm的磁性纳米粒子(Fe3O4，韩国浦项工科大学全尙敏教授提供)180μ g及90nm的磁性纳米粒子(Fe3O4-SiO2，韩国浦项工科大学全尙敏教授提供)430 μ go
[0065]进行上述离心分离后，在去除上清液的涂敷有牛血清白蛋白的磁性纳米粒子中添加浓缩5倍的IOnm金纳米粒子溶液(BB国际公司(BB International),硼酸盐(borate)缓冲溶液10mM，pH8.5) Iml来进行30分钟的吸附。
[0066]吸附有金纳米粒子的头孢甲肟与对氨基水杨酸的IOOnm磁性纳米粒子溶液中分别添加抗金黄色酿脓葡萄球菌单克隆抗体(ant1-S.aureus mAb, Abeam) 10 μ g,并在80nm的磁性纳米粒子(Fe3O4)与90nm磁性纳米粒子(Fe3O4-SiO2)溶液中添加抗C反应蛋白单克隆抗体(ant1-CRP mAb, Abeam) 10 μ g。
[0067]30分钟后，添加10%牛血清白蛋白(bovine serum albumin)溶液(ρΗ8.8,溶解于IOmM的碳酸氢钠(sodium bicarbonate)缓冲溶液)0.1ml,并放置30分钟。各分注200 μ I的上述溶液，在4°C温度下，以5500rpm转速进行20分钟离心分离后，去除上清液，再次添加0.1%牛血清白蛋白溶液0.2ml来混合后，以5000rpm转速进行20分钟离心分离后去除上清液。将上述过程再反复一次后，最终在IOOnm的磁性纳米粒子(头孢甲肟、对氨基水杨酸)一金纳米粒子一抗金黄色酿脓葡萄球菌单克隆抗体中添加0.4ml的0.1%的牛血清白蛋白(ρΗ8.8,溶解于IOmM的碳酸氢钠(sodium bicarbonate)缓冲溶液)溶液,在80nm和90nm的磁性纳米粒子(Fe3O4,Fe3O4-SiO2)-金纳米粒子-抗C反应蛋白单克隆抗体中添加0.1ml并混合后，利用0.45 μ m注射器式过滤器进行过滤后，放到冰箱保管。
[0068]实施例1-2:涂敷有蛋白质的突光或未染色乳胶微球(fluorescent latex beads,LB) 一银纳米粒子(silver nanoparticle, AgNP)或金纳米粒子(gold nanoparticle,AuNP ) 一抗体[0069]在4°C温度下，对用羟基进行表面改性的乳胶微球50 μ I以5000rpm的转速进行3分钟离心分离后，去除上清液。以与实施例1-1相同的方法对上述乳胶微球涂敷牛血清白蛋白。乳胶微球溶液使用2 μ m的突光乳胶微球(西格玛(sigma))和0.9 μ m乳胶微球(未染色，西格玛(sigma))。
[0070]在涂敷有上述牛血清白蛋白的2 μ m的荧光乳胶微球中分别添加Iml的浓缩5倍的20nm银纳米粒子溶液(BB国际公司，硼酸盐缓冲溶液IOmM, pH8.5)及IOnm金纳米粒子溶液(BB国际公司，硼酸盐缓冲溶液10mM，pH8.5)，进行30分钟吸附，并添加抗C反应蛋白多克隆抗体(ant1-CRP pAb，Abeam) 10 μ g，放置30分钟。将10 μ g的抗Hl单克隆抗体(ant1-HlmAb, LS-生物(LS-B10))和抗 H5 单克隆抗体(anti_H5mAb,艾博抗(Abcam))只添加到涂敷有上述银纳米粒子的荧光乳胶微球，并放置30分钟。
[0071]以与实施例1-1相同的方法制备借助上述牛血清白蛋白吸附有银或金纳米粒子的荧光乳胶微球溶液，在制备过程中，离心分离机以5000rpm的转速旋转10分钟，不用注射器式过滤器进行过滤，最终添加0.4ml的0.1%牛血清白蛋白(pH8.8，溶解于IOmM碳酸氢钠缓冲溶液)溶液，并放到冰箱保管。
[0072]实施例1-3:涂敷有辣根过氧化物酶(HRP, horeradish peroxidase)的金纳米粒子-金纳米粒子抗体接合体的制备
[0073]20nm金纳米粒子溶液(BB国际公司)Iml中添加硼酸盐缓冲溶液(0.1M，pH8.5)0.1ml及抗乙醒活性辣根过氧化物酶(aldehyde activated HRP,赛默(Thermo)) 10 μ g。经过30分钟后，在4°C温度下，以12000rpm转速进行15分钟离心分离后，去除上清液。重新进行上述离心分离后，添加15nm金纳米粒子溶液(BB国际公司)lml后,添加缓冲溶液(0.1M,pH8.5)0.1ml和肌I丐蛋白I (Troponin I)单克隆抗体(艾博康，检测抗体)10 μ g。经过I小时后，添加0.2ml的0.1%牛血清白蛋白(pH7.4，溶解于IOmM磷酸盐缓冲溶液)溶液并进行混合(5X),将金纳米粒子(gold nanoparticle, AuNP) 一抗体放到冰箱保管。
[0074]实施例2:金属纳米粒子的抗体接合体的制备
[0075]实施例2-1:金纳米粒子(gold nanoparticle, AuNP)-抗体的制备
[0076]在20nm金纳米粒子溶液(BB国际公司)lml中添加硼酸盐缓冲溶液(0.1Μ，ρΗ8.5)0.1ml和抗C反应蛋白单克隆抗体(作为稀释抗体的ant1-CRP mAb,艾博康)10 μ g。
[0077]经过30分钟后，添加10%牛血清白蛋白(bovine serum albumin)溶液(ρΗ8.8,溶解于IOmM碳酸氢钠缓冲溶液)0.1ml，放置30分钟。在4°C温度下，以IOOOOrpm转速对上述溶液进行20分钟离心分离后，去除上清液。添加0.2ml的0.1%牛血清白蛋白(pH8.8，溶解于IOmM碳酸氢钠缓冲溶液)溶液并混合后，以IOOOOrpm转速进行15分钟离心分离后，去除上清液。将上述过程再反复一次后,最终添加0.2ml的0.1%牛血清白蛋白(pH8.8，溶解于IOmM碳酸氢钠缓冲溶液)溶液并混合，将金纳米粒子(gold nanoparticle, AuNP)-抗体放到冰箱保管。
[0078]实施例2-2:银纳米粒子(silver nanoparticle, AgNP) 一抗体的制备
[0079]在20nm的银纳米粒子溶液(BB国际公司)Iml中添加硼酸盐缓冲溶液(0.1M，pH8.5) 0.1ml和抗C反应蛋白单克隆抗体(作为稀释抗体的ant1-CRP mAb,艾博康)10 μ g,并放置30分钟。
[0080]以与实施例2-1相同的方法制备固定有上述抗体的银纳米粒子溶液，并将银纳米粒子(silver nanoparticle, AgNP)-抗体放到冰箱保管。
[0081]实施例3:具有孔的聚二甲娃氧烧(PDMS, polydimethyl si 1xane)膜的制备
[0082]以10:1的比例混合聚二甲硅氧烷溶液(硅酮树脂(Sylgard) 184A，道康宁公司(Dow Corning),美国)和固化剂(娃酮树脂(Sylgard) 184B,道康宁公司Dow Corning),美国)，并倒入直径为150mm的平平的陪替氏培养皿(petri dish)。并利用真空泵来去除混合液中的气泡，并在60°C温度下固化24小时。之后，在常温下冷却固化的聚二甲硅氧烷膜后，利用直径为15m的穿孔器来穿六个孔。结果，确认到制造了具有孔的聚二甲硅氧烷膜。
[0083]比较例1:磁性纳米粒子(magnetic nanoparticle, MNP)-抗体接合体的制备
[0084]在用羟基进行表面改性的磁性纳米粒子溶液中添加IOmM磷酸盐缓冲溶液(磷酸盐缓冲溶液(PB, Phosphate buffer), pH7.4),使得最终体积达到Iml,并进行混合后,添加IOmM的N-轻基玻拍酸亚胺(NHS, N-hydroxy succinnimide ;生物核心有限公司(BiacoreInc))和2mM的二氯乙烷(EDC，生物核心有限公司)、10 μ g的抗体，并放置约2个小时。
[0085]上述磁性纳米粒子溶液使用基质(matrix)为羧甲基葡聚糖(CarboxymethyΙ-dextran)的IOOnm磁性纳米粒子溶液(头孢甲厢(CMX), 25mg/ml,凯米歇尔公司(Chemicell)) 100 μ 1、由聚丙烯酸(polyacrylic acid)形成的IOOnm磁性纳米粒子溶液(对氨基水杨酸(PAS), 50mg/ml,凯米歇尔公司(Chemicell)) 60 μ I,作为抗体添加抗金黄色酿脓葡萄球菌单克隆抗体(ant1-S.aureus mAb,艾博康)。抗Hl单克隆抗体(ant1-HlmAb，隆生生物科技有限公司(LS-BIO))和抗H5单克隆抗体(anti_H5mAb，艾博康)只添加到由羧甲基葡聚糖(Carboxymethyl-dextran)形成的IOOnm的磁性纳米粒子溶液中。
[0086]以与实施例1-1相同的方法制备固定有上述抗体的磁性纳米粒子溶液。
[0087]比较例2:未染色乳胶微球(latex beads, LB)-抗体接合体的制备
[0088]在4°C温度下，以5000rpm转速对用羟基进行表面改性的0.9 μ m乳胶微球(西格玛(sigma))50yl进行3分钟离心分离后，去除上清液。对上述乳胶微球添加IOmM的磷酸盐缓冲溶液(Phosphate buffer,PB,pH7.4),使得最终体积达到Iml,并进行混合后,添加IOmM的N-轻基琥拍酰亚胺(NHS, N-hydroxysuccinnimide ;生物核心有限公司(Biacore Inc))、2mM的二氯乙烧(EDC,生物核心有限公司)及10 μ g的抗人体⑶3抗体(ant1-human⑶3Ab,BD公司)，并放置2个小时。
[0089]利用与实施例1-2相同的方法制备固定有上述抗人体CD3抗体的乳胶微球溶液
[0090]实验例1:利用涂敷有牛血清白蛋白的磁性纳米粒子(MNP，基质:头孢甲肟)_金纳米粒子(AuNP)-抗体的金黄色酿脓葡萄球菌分析
[0091]实验例1-1:利用活菌数确认抗体的固定化效率
[0092]分别混合以下溶液并轻轻摇晃30分钟，上述溶液包含:利用实施例1-1的方法制备的磁性纳米粒子(头孢甲肟)-牛血清白蛋白、涂敷有牛血清白蛋白的磁性纳米粒子(头孢甲肟)-金纳米粒子-抗-金黄色酿脓葡萄球菌单克隆抗体(MNP (CMX) -AuNP-ant1-S.aureus mAb) 10 μ g/ml、利用比较例I的方法制备的磁性纳米粒子(头孢甲I亏)_抗-金黄色酿脓葡萄球菌单克隆抗体(MNP (CMX)-ant1-S.aureus mAb)接合体等各溶液40 μ I ;使金黄色酿脓葡萄球菌(S.Aureus)悬浮于磷酸盐缓冲溶液(PBS)的溶液10 μ I (105cfu);磷酸盐缓冲溶液(PBS)IOO μ I。经过30分钟后，添加磷酸盐缓冲溶液(PBS)IOO μ 1，并在常温下利用磁铁来从上述溶液分离磁性纳米粒子，如此分离约3分钟后，回收上清液及与各磁性纳米粒子接合体进行反应的金黄色酿脓葡萄球菌复合体。
[0093]回收的上清液和磁性纳米粒子接合体-金黄色酿脓葡萄球菌混合液按每100 μ I的量涂抹于陪替氏培养皿(petri dish)中的琼脂培养基(大豆胰蛋白胨肉汤(Trypticasesoy broth) (BD211825) 3%，琼脂粉末2%)，并在37°C温度下培养16?24小时。进行上述培养后，通过测定在培养基上形成的活菌数，确认磁性纳米粒子中利用金纳米粒子的抗体固定化方法的效果。
[0094]如图2所示，与将抗体直接固定到磁性纳米粒子的方法相比，利用涂敷有牛血清白蛋白的磁性纳米粒子(MNP)-金纳米粒子(gold nanoparticle, AuNP)-抗体接合体的情况下，确认到抗体固定化效率增加了约30%左右。
[0095]实验例1-2:金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcu saureus)分析
[0096]确认利用根据本发明的固定化方法来制备的磁性纳米粒子接合体的抗体被金纳米粒子而固定的状态。分别混合以下溶液并轻轻摇晃30分钟，上述溶液包含:使金黄色酿脓葡萄球菌(S.Aureus)悬浮于磷酸盐缓冲溶液(PBS)的溶液10 μ I (10°-5xl06cfu);利用实施例1-1的方法制备的涂敷有牛血清白蛋白的磁性纳米粒子(头孢甲肟)-金纳米粒子-抗-金黄色酿脓葡萄球菌单克隆抗体(MNP (CMX) -AuNP-ant1-S.aureus mAb)接合体溶液40 μ I以及磷酸盐缓冲溶液(PBS) 50 μ I。
[0097]上述溶液中添加磷酸盐缓冲溶液(PBS) 100 μ 1，并在常温下利用磁铁来分离磁性纳米粒子，如此分离约3分钟后，去除上清液，回收与涂敷有牛血清白蛋白的磁性纳米粒子(头孢甲肟)_金纳米粒子-抗-金黄色酿脓葡萄球菌单克隆抗体(MNP(CMX)-AuNP-ant1-S.aureus mAb)接合体进行反应的金黄色酿脓葡萄球菌(S.aureus)。
[0098]作为捕获用过滤膜使用了在孔的大小为1.2μπι的硝酸纤维素(NC，nitrocelluolose)膜(微孔过滤器，Millipore)上涂敷1%牛血清白蛋白溶液(溶解于磷酸盐缓冲溶液(PBS))后进行干燥而得的过滤膜。在具有支管的IOOml三角烧瓶安装的过滤器上置有上述硝酸纤维素膜，在硝酸纤维素膜上遮盖在实施例3中制备的聚二甲硅氧烷(PDMS)膜。通过烧瓶的支管，将真空状态破坏，并将与上述回收的涂敷有牛血清白蛋白的磁性纳米粒子(头孢甲肟)_金纳米粒子-抗-金黄色酿脓葡萄球菌单克隆抗体接合体进行反应的金黄色酿脓葡萄球菌混合溶液通过聚二甲硅氧烷膜的孔，来确认金黄色酿脓葡萄球菌的浓度。
[0099]其结果，如图3所示，确认到在IOtlCfu的金黄色酿脓葡萄球菌中，过滤用膜上未残留磁性纳米粒子(头孢甲肟)-金纳米粒子-抗-金黄色酿脓葡萄球菌单克隆抗体(MNP(CMX) -AuNP-ant1-S.aureus mAb)接合体,金黄色酿脓葡萄球菌的浓度越增加,残留在过滤用膜的涂敷有牛血清白蛋白的磁性纳米粒子(头孢甲肟)_金纳米粒子-抗-金黄色酿脓葡萄球菌单克隆抗体接合体的量增加。由此，只有与借助金纳米粒子固定抗体的磁性纳米粒子相结合的微生物残留在捕获用过滤膜，由此因纳米粒子具有的固有颜色，可通过肉眼测定菌的有无，且按不同浓度进行测定。
[0100]实验例1-3:通过金纳米粒子扩增处理的金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcusaureus)分析
[0101]使与实验例1-2的涂敷有牛血清白蛋白的磁性纳米粒子(头孢甲肟)-金纳米粒子-抗-金黄色酿脓葡萄球菌单克隆抗体(MNP (CMX) -AuNP-ant1-S.aureus
[0102]mAb)接合体进行反应的金黄色酿脓葡萄球菌复合体过滤的上述捕获用过滤膜中，滴入含有 5mM轻胺(hydroxyl amine)、25mM 四氯金酸(hydrogen tetrachloroaurateC III))的IOmM朽1檬酸缓冲溶液(citrate buffer, pH3.0),在常温下反应约15分钟。
[0103]其结果，如图4所示，确认到利用金还原溶液来还原金，因残留留在过滤膜的涂敷有牛血清白蛋白的磁性纳米粒子(头孢甲肟)_金纳米粒子-抗-金黄色酿脓葡萄球菌单克隆抗体接合体的深色化，能够提高测定不同浓度菌的灵敏度。
[0104]实验例2:利用涂敷有牛血清白蛋白的磁性纳米粒子(MNP, matrix:对氨基水杨酸)-金纳米粒子(AuNP)-抗体的金黄色酿脓葡萄球菌分析及与其他菌的交叉反应的确认
[0105]实验例2-1:金黄色酿脓葡萄球菌分析
[0106]使用通过实施例1-1的方法制备的基质为聚丙烯酸的涂敷有牛血清白蛋白的磁性纳米粒子(对氨基水杨酸)-金纳米粒子-抗-金黄色酿脓葡萄球菌单克隆抗体(MNP(PAS)-AuNP-ant1-S.aureus mAb)接合体，以与上述实验例1_2相同的步骤确认金黄色酿脓葡萄球菌的浓度。
[0107]其结果，如图5所示，在使用由聚丙烯酸形成的磁性纳米粒子(对氨基水杨酸)_金纳米粒子-抗-金黄色酿脓葡萄球菌单克隆抗体(MNP (PAS)-AuNP-ant1-S.aureus mAb)接合体的情况下，也表现与图3类似的倾向性，可根据固定有抗体的纳米粒子具有的固有的颜色而测定菌的有无，且按不同浓度进行测定。
[0108]实验例2-2:通过银纳米粒子扩增处理的金黄色酿脓葡萄球菌分析
[0109]以1:1的比例混合用于扩增银纳米粒子的溶液A (银盐，silver salt)和溶液B(氢醌引发剂，hydroquinone initiator)来制备混合溶液,将上述混合溶液滴至实验例2_1的捕获用过滤膜，在常温下反应约10分钟。其结果，如图6所示，通过银纳米粒子扩增处理，金黄色酿脓葡萄球菌的浓度越增加，因残留在过滤膜的涂敷有牛血清白蛋白的磁性纳米粒子(对氨基水杨酸)-金纳米粒子-抗-金黄色酿脓葡萄球菌单克隆抗体接合体的深色化，能够提高测定不同浓度菌的灵敏度。
[0110]实验例2-3:确认与其他菌的交叉反应
[0111]为了确认根据本发明的多功能生物材料接合体是否能够选择性地检测微生物，使用涂敷牛血清白蛋白的磁性纳米粒子(对氨基水杨酸)-金纳米粒子-抗-金黄色酿脓葡萄球菌单克隆抗体，并根据与上述实验例2-1相同的步骤，只改变菌的种类来进行实验。将总共为4种菌的沙门氏菌细胞(Salmonella typimurium)、单核细胞增多性李司戎氏菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌细胞(Staphylococcus aureus)及大肠杆菌细胞(Escherichia coli)与磁性纳米粒子(对氨基水杨酸)-金纳米粒子-抗-金黄色酿脓葡萄球菌单克隆抗体接合体反应后进行分析。
[0112]其结果,如图7所示,确认到在沙门氏菌细胞(Salmonella typimurium)、单核细胞增多性李司戎氏菌(Listeria monocytogenes)及大肠杆菌细胞(Escherichia coli)中没有出现涂敷有牛血清白蛋白的磁性纳米粒子(对氨基水杨酸)_金纳米粒子(MNP(PAS)-AuNP)，在金黄色葡萄球菌细胞(Staphylococcus aureus)中选择性地出现涂敷有牛血清白蛋白的磁性纳米粒子(对氨基水杨酸)-金纳米粒子(MNP (PAS) -AuNP)ο
[0113]实验例2-4:利用金黄色酿脓葡萄球菌比较抗体的固定化容量[0114]使用将抗金黄色酿脓葡萄球菌单克隆抗体(ant1-S.aureus mAb)直接固定到磁性纳米粒子(对氨基水杨酸)的接合体与在涂敷有牛血清白蛋白的磁性纳米粒子(磁性纳米粒子、对氨基水杨酸)-金纳米粒子(goldnanoparticle,AuNP)固定抗金黄色酿脓葡萄球菌单克隆抗体的接合体，并根据与上述实验例2-1相同的步骤，肉眼比较菌的不同浓度的测定。
[0115]如图8所示，与将抗体直接固定到磁性纳米粒子(对氨基水杨酸)的接合体相比，借助涂敷有牛血清白蛋白的磁性纳米粒子(磁性纳米粒子、对氨基水杨酸)_金纳米粒子(goldnanopart icle, AuNP )固定抗体的接合体，因金纳米粒子的红色而增加信号，如图9所示,能够通过银纳米粒子扩增处理得到更大的信号。
[0116]实验例3:利用涂敷有牛血清白蛋白的突光乳胶微球(latex beads, fluorescentyellow-green, LB)-银纳米粒子(silver nanoparticle, AgNP)或金纳米粒子(goldnanoparticle, AuNP)-抗体的C反应蛋白(CRP)测定
[0117]实施例3-1:通过荧光信号的C反应蛋白(CRP)测定
[0118]在利用实施例1-2的方法制备的涂敷有牛血清白蛋白的荧光乳胶微球(latexbeads 突光黄-突光绿，2 μ m LB)-银纳米粒子(silver nanoparticle, 20nm AgNP)-抗 C 反应蛋白多克隆抗体(ant1-CRP pAb)接合体和涂敷有牛血清白蛋白的突光乳胶微球(latexbeads, fluorescent yellow-green, 2 μ m LB)-金纳米粒子(gold nanoparticle, 20nmAuNP)-抗C反应蛋白多克隆抗体(ant1-CRP pAb)接合体I μ I中分别添加不同浓度Oyg/ml、I μ g/ml、10 μ g/ml的C反应蛋白和利用实施例2_1的方法制备的金纳米粒子(goldnanoparticle, 20nm AuNP)-抗C反应蛋白单克隆抗体(ant1-CRP mAb)接合体10 μ I或利用实施例2-2的方法制备的银纳米粒子(silver nanoparticle, 20nm AgNP)-抗C反应蛋白单克隆抗体接合体10μ I,用磷酸盐缓冲溶液(Phosphate buffered Saline, PBS, pH7.4)将最终体积达到200 μ 1，反应30分钟。
[0119]利用与实验例1-2相同的方法，将上述反应液依次通过凝聚用膜(PDMS)及
0.8 μ mm非对称超微米(MMM, asymetric super-micron membrane)过滤膜,并捕获在膜中，比较突光信号。
[0120]如图10所示，确认到，借助金纳米粒子-抗-C反应蛋白单克隆抗体(AuNP-ant1-CRP mAb)接合体，荧光信号的强度增加，尤其，与涂敷有牛血清白蛋白的乳胶微球(LB，2 μ m)-银纳米粒子-抗-C反应蛋白多克隆抗体接合体进行反应时，荧光信号的强度更高。由此，根据本发明的利用金纳米粒子或银纳米粒子的抗体固定化方法能够与粒子的种类无关地进行固定。
[0121]实验例3-2:利用流通孔(FTH, f1w-through-hoIe)膜的C反应蛋白测定
[0122]准备以正四角形模样剪切的吸收垫和具有三个孔的两面胶，在吸收垫上置有
0.8 μ mm非对称超微米(MMM, asymetric super-micron membrane)过滤膜，在其上面粘贴具有孔的两面胶，各孔中滴入涂敷有牛血清白蛋白的荧光乳胶微球(2 μ m)_银纳米粒子-抗-C反应蛋白多克隆抗体接合体各1μ I。上述孔中分别依次滴入0μ g/ml>l μ g/ml、10 μ g/ml的C反应蛋白抗原各10 μ I及金纳米粒子-抗_C反应蛋白单克隆抗体各5 μ I后，测定C反应蛋白的浓度。
[0123]如图11所示，确认到C反应蛋白的浓度越增加，残留在过滤膜的涂敷有牛血清白蛋白的荧光乳胶微球(2 μ m)_银纳米粒子-抗-C反应蛋白多克隆抗体接合体和-C反应蛋白金纳米粒子-抗-c反应蛋白单克隆抗体的复合体的量增加，由此，可根据荧光乳胶微球和金纳米粒子的固有颜色来测定不同浓度的C反应蛋白。
[0124]实验例3-3:利用免疫条(lateral flow assay,横向流动分析)的C反应蛋白测定
[0125]180sec 硝酸纤维素(NC, nitrocelluolose)膜上分别点滴(spotting)作为第二抗体(2nd Ab)的抗-小鼠免疫球蛋白G抗体(ant1-mouse IgG Ab,对照组,lmg/ml) 0.3 μ I及抗-C反应蛋白多克隆抗体(ant1-CRP pAb，lmg/ml) 0.3 μ 1，并在常温下干燥约20分钟。利用实施例1-1的方法制备的涂敷有牛血清白蛋白的80nm及90nm磁性纳米粒子(Fe3O4,Fe3O4-SiO2)-金纳米粒子-抗C反应蛋白单克隆抗体接合体10 μ I和相互不同浓度Ong/ml、10ng/ml、100ng/ml、l μ g/ml的C反应蛋白抗原以及1%的聚乙烯卩比咯烧酮(PVP)和表面活性剂(surfactantlOG),用无血清C反应蛋白(高纯)将最终体积达到100 μ I,在此混合液中浸泡上述条(strip),以使上述条(strip)的末端与混合液稍微接触。
[0126]混合液沿着条上升而发生免疫反应时，观察是否出现信号，由此能够确认磁性纳米粒子-金纳米粒子-抗体接合体的固定化状态。反应结束后，用磷酸盐缓冲溶液(Phosphate buffered Saline, PBS, pH7.4)清洗硝酸纤维素(NC, nitrocelluolose)。
[0127]如图12所示，在免疫条上，固定于硝酸纤维素(NC，nitix)Cellu0l0Se)膜的抗体和涂敷有抗原和蛋白质的磁性纳米粒子-金纳米粒子-抗体接合体进行免疫反应，由此能够与纳米粒子的种类无关地，根据接合体的纳米粒子的颜色确认是否出现红色信号。
[0128]实验例4:利用涂敷有牛血清白蛋白的荧光乳胶微球(latex beads,荧光红，LB)-银纳米粒子(silver nanoparticle,AgNP)-抗体的HlNl病毒分析及与其他亚型病毒的交叉反应确认
[0129]实验例4-1:通过荧光测定的HlNl分析
[0130]对利用实施例1-2的方法制备的涂敷有牛血清白蛋白的荧光乳胶微球(latexbeads,突光红,2 μ m LB)-银纳米粒子(silver nanoparticle, 20nm AgNP)-抗 Hl 病毒单克隆抗体(ant1-HlmAb)接合体I μ I和10°、IO1UO2'ΙΟ3、104、105pfu的HlNl病毒，用磷酸盐缓冲溶液将最终体积达到100μ 1，并进行20分钟的反应后，添加利用比较例I的方法制备的磁性纳米粒子(MNP,头孢甲厢)_抗Hl病毒单克隆抗体(ant1-HlmAb)接合体I μ I,进行20分钟反应。
[0131]在上述反应液中添加磷酸盐缓冲溶液100 μ 1，并在常温下利用磁铁来分离磁性纳米粒子,如此分离约3分钟后，去除上清液，并添加磷酸盐缓冲溶液100 μ 1，由此回收涂敷有牛血清白蛋白的荧光乳胶微球(2 μ m)-银纳米粒子-抗-Hl单克隆抗体接合体-HlNl病毒-MNP (CMX)-Hl单克隆抗体的复合体。上述过程再反复一次后，利用与实验例1-2相同的方法，使上述溶液通过0.8 μ mm非对称超微米(MMM, asymetric super-micron membrane)过滤膜，并捕获在膜中，确认荧光信号。
[0132]图13的(A)为示出病毒和不同浓度荧光信号的图像，(B)为将测定荧光信号强度的结果数值化的图表。
[0133]如图13所示，随着HlNl的浓度增加，荧光信号的强度增加，能够测定至最小lOpfu。可知，这是因为借助与病毒进行反应的银纳米粒子固定有抗体的荧光乳胶微球残留在捕获用过滤膜，由此能够通过微球的荧光来进行测定。
[0134]实验例4-2:确认相互不同的亚型病毒与涂敷有牛血清白蛋白的荧光乳胶微球(latex beads,突光红，2 μ m LB)-银纳米粒子(silver nanoparticle, 20nm
[0135]AgNP)-抗Hl病毒单克隆抗体(抗-Hl单克隆抗体)接合体进行交叉反应
[0136]为了确认根据本发明的多功能生物材料接合体是否能够选择性地检测病毒，对使用通过比较例I的方法制备的磁性纳米粒子(MNP，头孢甲肟)-抗Hl单克隆抗体(抗-Hl单克隆抗体)接合体I μ I和作为相互不同的亚型病毒的Η1Ν1、Η3Ν2、Η5Ν2的各103pfu病毒，分别利用磷酸盐缓冲溶液将最终体积达到100 μ 1，反应20分钟。在常温下利用磁铁来从上述反应液分离磁性纳米粒子，如此分离约3分钟后，去除上清液，并添加磷酸盐缓冲溶液100 μ I来使溶液悬浮。
[0137]各上述溶液中分别添加利用实施例1-2的方法制备的涂敷有牛血清白蛋白的荧光乳胶微球(latex beads,突光红,2 μ m LB)-银纳米粒子(silver nanoparticle, 20nmAgNP)-抗Hl病毒单克隆抗体(抗-Hl单克隆抗体)接合体I μ I,反应20分钟。在常温下利用磁铁来从上述反应液分离磁性纳米粒子，如此分离约3分钟后，去除上清液，并添加磷酸盐缓冲溶液100 μ 1，由此回收各个磁性纳米粒子(头孢甲肟)-Hl单克隆抗体接合体-病毒-涂敷有牛血清白蛋白的荧光乳胶微球(2 μ m)-银纳米粒子-抗-Hl单克隆抗体的复合体。上述过程再反复一次后，利用与实验例4-1相同的方法，使上述溶液通过0.8 μ m纤维素醋酸膜(Cellulo se Acetatemembrane)过滤膜,捕获在膜中，确认突光信号。
[0138]其结果，如图14所示，确认到在作为相互不同的亚型病毒的H3N2、H5N2中没有出现基于涂敷有牛血清白蛋白的荧光乳胶微球(2 μ m)-银纳米粒子-抗-Hl单克隆抗体的荧光信号，只在HlNl中选择性地出现涂敷有牛血清白蛋白的荧光乳胶微球(2 μ m)-银纳米粒子-抗-Hl单克隆抗体的荧光信号。
[0139]实验例4-3:确认相互不同的亚型病毒与涂敷有牛血清白蛋白的荧光乳胶微球(latex beads,突光红，2 μ m LB)-银纳米粒子(silver nanoparticle, 20nm AgNP)-抗 H5 病毒单克隆抗体(ant1-H5mAb)接合体的交叉反应
[0140]使用通过比较例I的方法制备的磁性纳米粒子(MNP，CMX)-抗H5单克隆抗体(ant1-H5mAb)接合体和利用实施例1_2的方法制备的涂敷有牛血清白蛋白的荧光乳胶微球(latex beads,突光红，2 μ m LB)-银纳米粒子(silver nanoparticle, 20nm AgNP)-抗 H5病毒单克隆抗体(ant1-H5mAb)接合体,利用与上述实验例4_2相同的方法来使作为相互不同的亚型病毒的H1N1、H3N2、H5N2反应后进行分析。
[0141]其结果，如图15所示，确认到在H1N1、H3N2中没有出现基于涂敷有牛血清白蛋白的荧光乳胶微球(2 μ m)-银纳米粒子-抗-H5单克隆抗体的荧光信号，只在H5N2中选择性地出现涂敷有牛血清白蛋白的荧光乳胶微球(2 μ m)-银纳米粒子-抗-H5单克隆抗体的荧
光信号。
[0142]实验例5:利用涂敷有牛血清白蛋白的乳胶微球(undyed latex beads, LB)-金纳米粒子(gold nanoparticle, AuNP)-抗体的 T 细胞(Tcell) (CD3)的分离
[0143]实验例5-1:利用T细胞的分离率来确认抗体的固定化效率
[0144]将利用比较例2和实施例1-2的方法制备的乳胶微球(undyed latex bead, 0.9 μ mLB)-抗人体⑶3抗体(ant1-human⑶3Ab)接合体和涂敷有牛血清白蛋白的乳胶微球(undyed lates bead, 0.9 μ m LB)-金纳米粒子(gold nanoparticle, 20nm AuNP)-抗 human⑶3抗体(ant1-human⑶3Ab)接合体溶液分别与血液混合,并在常温下放置20分钟。上述反应液中添加相同体积的2%胎牛血清-磷酸盐缓冲溶液(FBS-PBS)来搅拌均匀后，放在重密度介质(density medium,聚鹿糖(Ficoll))上，在常温下以2000rpm、分离(break off)条件，进行30分钟离心分离。离心分离后，回收位于聚蔗糖的重密度介质血浆界限部分的细胞，利用流式细胞仪(FACS)，确认T细胞(CD3)的存在与否及T细胞(CD3)的选择性分离率(去除)，由此确认乳胶微球中利用金纳米粒子的抗体固定化方法的效果。如图16所示，确认到与将抗体直接固定到乳胶微球的方法相比，利用涂敷有牛血清白蛋白的乳胶微球(LB)-金纳米粒子(gold nanoparticles, AuNP)-抗体接合体的情况下，T细胞(0)3)的分离(去除)有效性更高，由此确认到抗体固定化效率增加了。
[0145]实验例6:利用涂敷有辣根过氧化物酶(HRP)的金纳米粒子-金纳米粒子抗体接合体的肌I丐蛋白I (Troponin I)分析
[0146]利用分配器(Dispensor，泽塔(Zeta)公司)，以SmM的间距在硝酸纤维素膜上分别涂敷0.lmg/ml浓度的抗小鼠免疫球蛋白G (IgG)抗体(对照线，Control line)和肌隹丐蛋白I (Troponin I)抗体(实验线，Test line)。以3.8mM的间距剪切所涂敷的硝酸纤维素膜来制造条传感器(每传感器的抗体涂敷量=38ng/条)。为了按不同浓度测定肌钙蛋白I，将在上述实施例1?实施例3中制备的涂敷有辣根过氧化物酶(HRP)的金纳米粒子-金纳米粒子抗体接合体IX，在包含2%聚乙烯批咯烧酮(PVP, polyvinylpyrrolidone ;西格玛(sigma))和2%表面活性剂(SurfactatelOG,菲茨杰拉德(Fitzgerald))的人体血清(西格玛(sigma))溶液中以O?1000ng/ml的浓度混合肌I丐蛋白I (Troponin I)并放入96孔板(well plate)后，放入所制备的上述条传感器并反应10分钟。将结束反应的条重新放到分注磷酸盐缓冲溶液的96孔板，清洗20分钟。去除清洗完的条的试样垫(sample pad),并用溶解有2mM鲁米诺(Iuminol,西格玛(sigma)), 0.5mM的p-香豆酸(p-coumaricacid,西格玛(sigma))、2mM的过氧化氢(hydrogen peroxide)的0.1M的三轻甲基氨基甲烧盐酸盐(Tris-HCl，pH8.8)缓冲溶液20 μ I处理条后，利用高灵敏度化学发光仪(Chem1-Doc，美国伯乐(Bitj-RaCl)公司)测定化学发光信号120秒钟，将其结果表示在图17中。如图17的实验线所示，在肌钙蛋白I的0.1?1000ng/ml的浓度范围内，可确认随着肌钙蛋白I的浓度增加，信号也增加。
[0147]以上，对本
【发明内容】
的特定部分进行了详细的说明，本领域普通技术人员应当理解，这些具体技术只是优选的实施方式，本发明不局限于此。因此，本发明的实质性的范围应根据发明要求保护范围及它们的等同替代来定义。
[0148]产业上的可利用性
[0149]在本发明中，根据本发明的多功能生物材料接合体的制备方法利用两种粒子来能够防止纳米粒子的沉淀并容易固定生物材料，且能够制备具有多功能的生物材料接合体。并且，利用上述方法制备的多功能生物材料接合体可用于检测微生物，可检测至IO1Cfu浓度的微生物。
【权利要求】
1.一种多功能生物材料接合体的制备方法，其特征在于，包括: 步骤(a)，将蛋白质涂敷于具有磁性或荧光特性的第一纳米粒子； 步骤(b)，将具有金属特性的第二纳米粒子吸附于涂敷有蛋白质的上述第一纳米粒子来制备接合体；以及 步骤(C)，将生物材料吸附于上述接合体来制备多功能生物材料接合体。
2.根据权利要求1所述的多功能生物材料接合体的制备方法，其特征在于，上述第一纳米粒子选自包含乳胶、磁、二氧化硅、量子点及金属纳米粒子的组。
3.根据权利要求1所述的多功能生物材料接合体的制备方法，其特征在于，上述第二纳米粒子选自包含金、银、铜、钼及量子点的组。
4.根据权利要求1所述的多功能生物材料接合体的制备方法，其特征在于，上述第一纳米粒子的粒子大小大于第二纳米粒子的粒子大小。
5.根据权利要求1所述的多功能生物材料接合体的制备方法，其特征在于，用于涂敷上述第一纳米粒子的蛋白质选自包含牛血清白蛋白、过氧化物酶、葡糖氧化酶、胆碱氧化酶、碱性磷酸酶、链霉亲和素、脱脂乳、血清及肽的组。
6.根据权利要求 1所述的多功能生物材料接合体的制备方法，其特征在于，上述生物材料选自包含抗体、酶、脱氧核糖核酸、适配体、肽核酸及配体的组。
7.一种多功能生物材料接合体，其特征在于，在具有磁性或荧光特性的第一纳米粒子涂敷有蛋白质，在上述蛋白质吸附有具有金属特性的第二纳米粒子，且在上述第二纳米粒子吸附有生物材料。
8.根据权利要求7所述的多功能生物材料接合体,其特征在于,上述第一纳米粒子选自包含乳胶、磁、二氧化硅、量子点及金属纳米粒子的组。
9.根据权利要求7所述的多功能生物材料接合体,其特征在于,上述第二纳米粒子选自包含金、银、铜、钼及量子点的组。
10.根据权利要求7所述的多功能生物材料接合体,其特征在于,上述第一纳米粒子的粒子大小大于第二纳米粒子的粒子大小。
11.根据权利要求7所述的多功能生物材料接合体，其特征在于，用于涂敷上述第一纳米粒子的蛋白质选自包含牛血清白蛋白、过氧化物酶、葡糖氧化酶、胆碱氧化酶、碱性磷酸酶、链霉亲和素、脱脂乳、血清及肽的组。
12.根据权利要求7所述的多功能生物材料接合体，其特征在于，上述生物材料选自包含抗体、酶、脱氧核糖核酸、适配体、肽核酸及配体的组。
13.—种生物传感器，其特征在于，包含根据权利要求7所述的多功能生物材料接合体。
14.一种利用多功能生物材料接合体的微生物的高速检测方法，其特征在于，包括: 步骤(a)，将多功能生物材料接合体及含有检测对象微生物的试样混合而反应，上述多功能生物材料接合体中，在具有磁性或荧光特性的第一纳米粒子涂敷有蛋白质，在上述蛋白质吸附有具有金属特性的第二纳米粒子，且在上述第二纳米粒子吸附有与检测对象微生物进行特异性结合的抗体； 步骤(b)，使上述反应液依次通过微生物凝聚用膜及微生物捕获用过滤膜，来使未与微生物反应的多功能生物材料接合体透过，并选择性地分离出多功能生物材料接合体一微生物复合体；以及 步骤(C)，测定在上述微生物捕获用过滤膜中捕获的多功能生物材料接合体一微生物复合体的有无或多功能生物材料 接合体一微生物复合体的浓度。
【文档编号】B82Y15/00GK104011545SQ201280050559
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2012年10月12日 优先权日:2011年10月14日
【发明者】金珉坤, 成伦周, 卞妵英, 吴迎庆, 郑晓庵 申请人:光州科学技术院, 韩国生命工学硏究院