通过电纺形成缀合蛋白的制作方法
【专利摘要】通过制备包含多糖和蛋白质的水溶液、向该溶液施加高电压、在收集板上收集纤维而制备多糖-蛋白质纤维的方法。
【专利说明】通过电纺形成缀合蛋白
[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 本申请要求2012年4月4日提交的美国临时申请系列号61/619,996的优先权， 其全部内容特此通过参考引入。
[0003] 背景
[0004] 缀合蛋白，包括蛋白质_多糖缀合物，在许多加工食品的结构和稳定性中起到显 著作用。在加工食品工业中特别重要的一个反应是美拉德反应。美拉德反应是涉及氨基与 还原基团缩合的非酶促化学相互作用。该反应导致形成中间产物，其可随后聚合以形成褐 色的称为蛋白黑素的含氮化合物。
[0005] 美拉德反应有三个主要阶段。在第一阶段，糖胺形成，然后经历重排成为糖胺化合 物。在第二阶段，失去胺基并形成羰基中间体。所述羰基中间体经历脱水或裂变以形成高 度反应性的羰基化合物。在最终阶段，所述反应性羰基化合物与食品的其它成分反应以形 成蛋白黑素。
[0006] 美拉德反应的产物与正面属性如芳香、味道和颜色相关。但是，该反应也可导致降 低的营养价值、缩短的保存期以及形成导致变味的不良化合物。
[0007] 因此控制美拉德反应在开发具有改善的营养价值的食品中非常关键。先前产生蛋 白质缀合物的方式出于多种原因并不有效。例如，使用冻干过程联合加热的干温育法缓慢 且不能提供足够的产量。因而，需要更有效的方式来控制缀合蛋白的产生。
[0008] 概述
[0009] 本文所述的特征总体涉及使用电纺（electrospinning)来产生缀合蛋白的方法。 本文所述特征的一些方面涉及制备葡聚糖缀合乳清蛋白的方法。
[0010] 附图简述
[0011] 本文公开内容通过举例方式加以例示而不限于附图，在附图中类似的参考数字表 示相似的要素，其中：
[0012] 图1例示一例电纺装置，在其上可实施本文公开内容的多种特征。
[0013] 图2例示使用0. 5g/mL溶剂的葡聚糖（70kDa)的纤维上的珠粒。
[0014] 图3例示从0. 7g/mL溶剂的葡聚糖（70kDa)溶液制备的纤维。
[0015] 图4例示从0. 8g/mL溶剂的葡聚糖（70kDa)溶液制备的光滑纤维。
[0016] 图5例示从1. Og/mL的葡聚糖（40kDa)水溶液制备的净葡聚糖电纺纤维的LM图 像。
[0017] 图6例示从0. 6g/mL的葡聚糖（lOOkDa)水溶液制备的净葡聚糖电纺纤维的LM图 像。
[0018] 图7例示用不同葡聚糖以最小可电纺浓度制备的葡聚糖-乳清蛋白分离物混合物 的粘度。
[0019] 图8A-F。图8A-8C例示从多种葡聚糖大小制备的葡聚糖-乳清蛋白分离物电纺纤 维的扫描电镜（SEM)图像：8A :40kDa，8B :70kDa，和8C :100kDa。图8A、8B和8C中的纤维的 纤维直径分别显示于图8D、8E和8F。
[0020] 图9例示不同浓度的葡聚糖水溶液的应力-应变流变曲线。
[0021] 图10例示混合比对葡聚糖和乳清蛋白混合物的流动特性的影响作用。对于每种 混合物，总固体含量为0. 6g/mL。
[0022] 图 11A-H。图 11A-D例示从不同浓度（11A :0? 3g/mL溶剂，11B :0? 45g/mL溶剂，11C : 0. 6g/mL溶剂，和11D :0. 7g/mL溶剂）的葡聚糖溶液制备的电纺纤维的SEM图像。电纺条 件保持恒定于：电压=20kV，电纺距离=18cm，和溶液流速=12ii L/min。图11A-D中的纤 维的纤维直径分别显示于图11E-H。
[0023] 图12A-J。图12A-E例示从具有不同混合比（以重量计）的葡聚糖（lOOkDa)与乳 清蛋白分离物（12A:1:0, 12B:0. 8:0. 2, 12C:0. 75:0. 25 ;12D:0. 67:0. 33,和 12E:0. 5:0. 5) 的混合物制备的电纺纤维的SEM图像。所有混合物的浓度为0. 6g/mL溶剂，且电纺条件保 持恒定于：电压=20kV，电纺距离=18cm，和溶液流速=12ii L/min。图12A-E中的纤维的 纤维直径分别显示于图12F-J。
[0024] 图13A显示不同混合物比的葡聚糖粉末与乳清蛋白分离物粉末之间的混合物的 IR光谱。图13B显示乳清蛋白分离物含量与于1518和KKMenT 1的波数的峰吸光度之间的 比值之间的关系。
[0025] 图14显不于60°C和74% RH退火不同时间的电纺膜的外观。
[0026] 图15显示以下的IR光谱：a)粉末形式的WPI-葡聚糖；b)初纺（as-spun)WPI-葡 聚糖电纺膜；c) -f)分别于60°C和74% RH退火2、6、20和48小时后的WPI-葡聚糖电纺膜。
[0027] 图16例示退火时间对WPI-葡聚糖缀合物在2-巯基乙醇存在下的SDS-PAGE谱的 影响作用。泳道1 :WPI溶液；泳道2-8 :分别于60°C 74% RH退火0、2、4、6、8、16、24和48 小时的电纺WPI-葡聚糖（40kDa)膜。
[0028] 图17A和17B例示WPI-葡聚糖缀合物在2-巯基乙醇存在下的SDS-PAGE谱。图 17A是蛋白质染色。图17B是糖蛋白染色。图17A和B的泳道均为，泳道1 :WPI溶液；泳道 2-5 :分别于0、8、16和24小时加热的电纺WPI-葡聚糖（40kDa)膜；泳道6-9 :分别于0、8、 16和24小时加热的电纺WPI-葡聚糖（lOOkDa)膜。
[0029] 图18A和18B例示WPI-葡聚糖（70kDa)缀合物的SDS-PAGE谱：图18A是蛋白质 染色。图18B是糖蛋白染色。所有电纺膜中葡聚糖与WPI之间的重量比为3:1。泳道1:蛋 白梯；泳道2-5 :分别于0、8、16和24小时于60°C，74% RH退火的电纺膜。
[0030] 图19例示用于SDS PAGE凝胶的TGX预制凝胶的标准曲线。等式中显示的变量丽 和d分别为以kDa计的分子量和以％计的移动距离（R2 = 99. 86% )。中心的线和两条外 侧的线分别显示预测值和95%置信带。
[0031] 图20A和20B例示不同湿度和退火时间下形成的WPI-葡聚糖（lOOkDa)缀合物的 SDS-PAGE谱。所有电纺膜中葡聚糖与WPI之间的重量比为3:1。图20A是蛋白质染色。图 20B是糖蛋白染色。泳道1 :初纺膜；泳道2-10 :于60°C但不同相对湿度退火的电纺膜：泳 道2-4 = 0% RH ;泳道5-7 = 44% RH ;泳道8-10 = 74% RH。退火时间为8小时：泳道2、 5和8 ;16小时；泳道3、6和9 :16小时；和24小时泳道4、7和10。泳道0为标准蛋白梯。
[0032] 图21和21B例示在恒定湿度条件下的WPI-葡聚糖（lOOkDa)缀合物的SDS-PAGE 谱。分别以葡聚糖与WPI之间不同摩尔比制备电纺膜：泳道1-4 = 1:2 ;泳道5-8:1:1 ;泳 道9-12:2:1。图21A是蛋白质染色。图21B是糖蛋白染色。所有电纺膜于60°C和74%RH 退火。退火时间为：泳道1、5和9 :初纺膜；泳道2、6和10:8小时；泳道3、7和11:16小时； 泳道4、8和12:24小时。泳道0是标准蛋白梯。所用染料是对N-糖苷（其不存在于蛋白 质或麦芽糊精中）特异性的。
[0033] 图22A显示从WPI和葡聚糖40kDa混合物制备、以不同退火时间于60°C和74% RH退火的电纺样品的UV吸收光谱。图22B显不电纺样品于282nm的吸光度峰与退火时间 (WPI和葡聚糖40kDa样品）之间的关系。
[0034] 图23A显示从WPI和葡聚糖70kDa混合物制备、以不同退火时间于60°C和74% RH退火的电纺样品的UV吸收光谱。图23B显不电纺样品于282nm的吸光度峰与退火时间 (WPI和葡聚糖70kDa样品）之间的关系。
[0035] 图24A和24B显示溶液浓度对从WPI和葡聚糖lOOkDa混合物制备的电纺样品的 UV吸光度的影响作用。图24A是5mg/mL，而图24B是3mg/mL。
[0036] 图25A和25B显示从摩尔比为1:1(图25A)和2:1(图25B)的WPI与葡聚糖lOOkDa 混合物制备的电纺样品于282nm的吸光度峰。
[0037] 图26显示从摩尔比为2:1的葡聚糖lOOkDa与WPI混合物制备的电纺样品的UV 吸收光谱。
[0038] 图27显示以不同混合比：A) 1:2 ;B) 1:1;和〇2:1 (葡聚糖与WPI之间的摩尔比） 从WPI和葡聚糖lOOkDa制备的电纺样品。
[0039] 图28A-C例示于1:2⑷，1:1⑶和2:2 (C)的摩尔比用比色计测量的电纺膜的亮 度（实心圆圈）和黄度（空心圆圈）。
[0040] 图29A和B例示电纺膜WPI-葡聚糖lOOkDa的NIR光谱。
[0041] 详细描述
[0042] 在本文公开内容的一方面，提供了使用电纺法产生缀合蛋白的方法。在一些方面， 缀合物是蛋白质-碳水化合物缀合物（即蛋白质与一种或多种碳水化合物共价连接）。在 一些方面，缀合物是蛋白质-多糖缀合物（即蛋白质与一种或多种多糖共价连接）。在特定 方面，所述多糖是葡聚糖且所述蛋白质是乳清蛋白分离物（WPI)。
[0043] 乳清蛋白和糖基化作用
[0044] 乳清蛋白由于其优异功能（例如泡沫和乳液稳定作用）及其高营养含量（例如高 含量的必需氨基酸）是用于众多食品的关键成分[1]。
[0045] 乳清蛋白在食品加工期间由于固有遭遇到的环境条件如高温、压力和/或存在多 种酸而容易变性。因此提高乳清蛋白稳定性已成为食品生产商的主要兴趣所在以改进其在 食品应用中的用途。已证实乳清蛋白与葡聚糖之间通过形成希夫碱中间产物的糖基化作用 是改善所述蛋白质的热稳定性[1]和乳化特性[3, 4]的有效方法。
[0046]蛋白质_多糖缀合物的形成提高乳液的冻融稳定性，甚至在于_18°C 22小时和 +40°C 2小时的三次冻融循环之后[5]。
[0047] 蛋白质与多糖的非化学糖基化可通过将蛋白质粉末与含有还原糖的粉末的混合 物于大约60°C和至少?44%的相对湿度干热长达4天来进行[6]。在干热法中，并非直接 将热应用于其最初粉末形式的WPI和葡聚糖，而是先制备液体形式的WPI和葡聚糖溶液，然 后冻干以获得固体形式的混合物，其更适于随后的糖基化反应。
[0048]将WPI糖基化的一种替代方法是将葡聚糖和乳清蛋白分离物溶液于60°C和pH? 6. 5加热约48小时，即所谓的湿热法。参见例如美国公开申请20090311407。湿热法具有 比干热法实质上更短的反应时间和高级的美拉德反应产物，其生成的深色色素不如在干热 法中容易形成。这两种方法由于所涉及的费用以及两种方法均产率低（〈5% )而均未能广 泛使用。
[0049] 电纺
[0050] 电纺是一种形式的电沉积，且是通过使用高压电场（例如15_25kV)可从合成和/ 或天然聚合物产生纤维的通用技术。电纺可以有针或者无针。典型的电纺设置由配备有喷 丝头的溶液容器、用于收集沉积的纤维的收集板和在喷丝头与收集板之间生成电场的高压 单元组成。参见图1。溶液容器可以是配备有导电针的注射器，所述导电针既可用作喷丝头 还可用作电极。
[0051] 聚合物溶液的流速可使用注射器泵来控制。一旦聚合物溶液经由电极而带电，在 喷丝头尖端聚合物溶液小滴的形状将转化为泰勒锥体（Taylor cone)形状。如果电压高到 足以克服表面张力，则细聚合物射流将从泰勒锥体尖端射出。喷射出的聚合物射流由于射 流尺寸小而迅速干燥，而干燥的固体纤维可从收集板收集。电纺纤维的平均直径通常为数 百纳米左右。
[0052] 聚合物链缠结是将目标溶液成功电纺成纤维所需的。聚合物链缠结防止聚合物射 流由于电纺期间的电拉伸力而破裂。如果聚合物浓度太低，溶液中缺乏聚合物链重叠。当 浓度增加到临界浓度c*，链缠结启动。链缠结的程度（^匕^取决于聚合物浓度和分子量两 者,且可通过等式2. 1确定[12]:
【权利要求】
1. 经由电纺制备碳水化合物-蛋白质纤维或颗粒的方法，包括以下步骤： 制备包含碳水化合物和蛋白质的水溶液， 向所述溶液施加15到25kV的电压， 在收集板上收集纤维。
2. 权利要求1的方法，其中所述电纺是无针的。
3. 权利要求1的方法，其中所述碳水化合物具有醛基或通过异构形成醛基。
4. 权利要求1的方法，其中所述碳水化合物是葡聚糖。
5. 权利要求4的方法，其中所述葡聚糖分子量在大约lOkDa和大约500kDa之间。
6. 权利要求4的方法，其中所述葡聚糖以0. lg/mL到大约5. Og/mL的浓度存在。
7. 权利要求1的方法，其中所述蛋白质选自微生物、动物、奶制品和植物性的。
8. 权利要求1的方法，其中所述蛋白质是乳清蛋白分离物（WPI)。
9. 权利要求1的方法，其中所述水溶液包含摩尔比（w/w)从50 :1到1 :50的碳水化合 物和蛋白质。
10. 权利要求1的方法，其中所述水溶液包含摩尔比（w/w)从3 :1到1 :10的碳水化合 物和蛋白质。
11. 权利要求1的方法，其中所述水溶液包含葡聚糖和WPI。
12. 权利要求1的方法，还包括将所述纤维于至少45%的相对湿度温育至多24小时， 从而形成缀合膜的步骤。
13. 权利要求12的方法，其中相对湿度在65%和75%之间。
14. 权利要求12的方法，其中温度在10-70°C的范围内。
15. 权利要求1的方法，其中所述纤维直径为大约100nm到大约500nm。
16. 权利要求15的方法，其中所述纤维直径为大约150nm到大约250nm。
17. 通过电纺制备多糖-蛋白质纤维的方法，包括以下步骤： 制备包含lOOkDa葡聚糖和乳清蛋白分离物的水溶液，其中所述葡聚糖和乳清蛋白分 离物以在3 :1和10 :1之间的摩尔比（w/w)存在， 向所述溶液施加15到25kV的电压从而产生纤维， 在收集板上收集所述纤维，和 将所述纤维于至少45%的相对湿度温育达4和24小时之间的时间，从而形成缀合膜。
18. 权利要求17的方法，其中相对湿度在65%和75%之间。
19. 权利要求17的方法，其中温育在4和8小时之间。
20. 权利要求17的方法，其中温度在10-70°C的范围内。
21. 权利要求17的方法，其中所述电纺是无针的。
【文档编号】B82B3/00GK104284858SQ201380023823
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2013年3月13日 优先权日:2012年4月4日
【发明者】S·贝尔, P·吉文, K·坎加纳庞库尔, J·韦斯 申请人:百事可乐公司