一种铁蛋白重链亚基纳米粒子及其制备方法和用途
【专利摘要】本发明公开了一种铁蛋白重链亚基纳米粒子及其制备方法和用途。所述的铁蛋白重链亚基纳米粒子为在FTH1的N端修饰有穿膜肽。本发明的铁蛋白重链亚基纳米粒子的N端修饰有具有不同电荷性质的短肽，与修饰有EGF的纳米粒子同时进行变复性，并在体外进行自组装，形成的杂合蛋白纳米粒子具有强的细胞穿透力，能够与肿瘤靶细胞有很强的结合，为后续选择药物靶向肿瘤细胞治疗提供了非常好的模型，具有很好的应用前景。
【专利说明】一种铁蛋白重链亚基纳米粒子及其制备方法和用途
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医学工程【技术领域】，具体涉及一种铁蛋白重链亚基纳米粒子及其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002]纳米材料的特性使其在肿瘤诊断分析方面具有许多优势，纳米技术的近期发展使得纳米级载体可以同时连接上各种功能性分子，包括对肿瘤特异识别的配体、抗体、抗癌药物以及成像探针等。生物笼状蛋白本身就是天然生物大分子，具有良好的生物兼容性。他们通常是由多个多肽亚基结合形成中空结构，外部与中空直径均在纳米尺度，使得纳米材料易于在其表面、内部以及各蛋 白亚基界面之间进行修饰，组装成各种多功能分子。近来随着基因工程、蛋白化学修饰技术与纳米技术的融合，这方面的工作已经引起了普遍的关注和兴趣。
[0003]有大量研究表明，肿瘤细胞的表皮生长因子受体(epithelial growth factorreceptor, EGFR)表达量过高，这使得EGFR成为肿瘤治疗中一个非常好的靶点。表面修饰EGF的纳米粒子，能通过配体受体结合作用进入细胞，这为药物的传递提供了良好的可行性。然而，现有的修饰了 EGF的纳米粒子与细胞的结合作用并非很强。为了进一步提高靶向肿瘤细胞的能力，有必要研究开发在细胞穿透能力和细胞结合作用方面更强的新型纳米粒子。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是针对现有的纳米粒子对肿瘤细胞的靶向能力不够强，效率不够高的缺陷，而提供一种新的铁蛋白重链亚基纳米粒子及其制备方法和用途。本发明的铁蛋白重链亚基纳米粒子的N端修饰有具有不同由荷性质的短肽，与修饰有EGF的纳米粒子同时进行变复性，并在体外进行自组装，形成的杂合蛋白纳米粒子具有强的细胞穿透力，能够与肿瘤靶细胞有很强的结合，为后续选择药物靶向肿瘤细胞治疗提供了非常好的模型，具有很好的应用前景。
[0005]本发明提供下述技术方案解决上述技术问题。
[0006]本发明提供的技术方案之一是:一种铁蛋白重链亚基纳米粒子，其在FTHl的N端修饰有穿膜肽。
[0007]本发明中，所述的FTHl为本领域最常见的铁蛋白重链亚基纳米粒子(专利CN101942022A中已经对其做了详细披露)，其还可以是现有技术中已经报道过的任意的铁蛋白重链亚基纳米粒子。
[0008]本发明中，所述的穿膜肽(cell-penetrating pep tides, CPPs)为本领域常规所述的穿膜肽，其是一类具有特殊功能的多肽分子，一般由30个以下的氨基酸残基构成，具有生物膜穿透功能，还可携带其他分子甚至超分子颗粒进入细胞中。正是因为这种特殊的性质，它们被看作生物活性分子有效的细胞内转运工具，具有广泛的应用前景。[0009]较佳地，所述的穿膜肽的氨基酸序列如SEQ ID N0.1，SEQ ID N0.2，SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4中的任一种所示。前述几种氨基酸序列均由短肽TAT(其氨基酸序列如SEQ IDN0.5所示)通过点突变设计引物而扩增获得，其中，TAT是最先被发现并证实的具有穿膜功能的多肽分子，作为一种阳离子穿膜肽，其本身所含有的大量碱性氨基酸残基，在穿膜过程中同时起到了核定位信号的作用。
[0010]本发明提供的技术方案之二是:一种杂合蛋白纳米粒子，其由N端修饰有穿膜肽的铁蛋白重链亚基纳米粒子和N端修饰有EGF的铁蛋白重链亚基纳米粒子组成。
[0011]本发明中，所述的EGF(Epidermal Growth Factor)为本领域常规所述的含义,其为表皮生长因子，是哺乳动物体内的一种小肽，在体内体外都对多种组织细胞有强烈的促分裂作用。
[0012]本发明提供的技术方案之三是:如前所述的杂合蛋白纳米粒子的制备方法，其包括如下步骤:
[0013](I)基因工程菌株的构建:分别构建表达N端修饰有穿膜肽的铁蛋白重链亚基融合蛋白和N端修饰有EGF的铁蛋白重链亚基融合蛋白的基因工程菌株，其中，所用的表达载体为pET-28 (+)，所用的宿主菌为大肠杆菌；
[0014](2)融合蛋白的表达和收获:将步骤(1)所述的基因工程菌株接种于LB培养基上培养，加入IPTG诱导表达，然后破碎菌体，离心，分别收获表达N端修饰有穿膜肽的铁蛋白重链亚基融合蛋白和N端修饰有EGF的铁蛋白重链亚基融合蛋白；
[0015](3)杂合蛋白 纳米粒子的自组装:将步骤⑵收获的表达N端修饰有穿膜肽的铁蛋白重链亚基融合蛋白和N端修饰有EGF的铁蛋白重链亚基融合蛋白在体外进行变性，然后置于透析液中进行梯度透析复性，收获自组装而得的杂合蛋白纳米粒子。
[0016]步骤⑴中，所述的穿膜肽的氨基酸序列较佳地如SEQ ID N0.1，SEQ ID N0.2，SEQID N0.3和SEQ ID N0.4中的任一种所示。
[0017]步骤(1)中，所述的大肠杆菌优选E.coliBL21菌株。
[0018]步骤⑵中，收获表达N端修饰有穿膜肽的铁蛋白重链亚基融合蛋白和N端修饰有EGF的铁蛋白重链亚基融合蛋白的方式为本领域常规所述，较佳地为将包涵体蛋白进行洗涤和纯化；或者，将可溶性蛋白进行凝胶过滤层析，以达到纯化的目的。
[0019]步骤(3)中，所述的梯度透析复性较佳地包括如下步骤:将变性的融合蛋白按比例混合，使得蛋白总浓度为0.lmg/mL ;用橡皮筋捆住透析袋的一端，将变性蛋白装入透析袋，用橡皮筋捆住透析袋的另一端；将透析袋置于复性液中，4°C条件下开始复性，复性过程中逐渐减低脲素的浓度，使得变性蛋白慢慢正确折叠，隔6h换一次复性液，经由St印I~Step6复性结束后，将透析袋里的蛋白溶液取出，离心，得上清液，用0.2μπι滤膜过滤除去未正确折叠的蛋白沉淀物。
[0020]其中，所述复性液的配方优选如下:
[0021]Stepl:50mM Tris (三羟甲基氨基甲烷)，50mM 氯化钠溶液，0.5mMEDTA,0.1 %PEG (聚乙二醇)，10%甘油，4M脲素，0.2mM GSH (还原型谷胱甘肽)，0.1mM GSSG (氧化型谷胱甘肽)，ρΗ7.9 ；
[0022]St印2:50mM Tris (三羟甲基氨基甲烷)，50mM氯化钠溶液，0.5mMEDTA,0.1 %PEG (聚乙二醇)，10 %甘油，3M脲素，0.2mMGSH (还原型谷胱甘肽)，0.1mM GSSG (氧化型谷胱甘肽)，ρΗ7.9 ；
[0023]St印3:50mM Tris (三羟甲基氨基甲烷)，50mM氯化钠溶液，0.5mMEDTA,0.1 %PEG (聚乙二醇)，10 %甘油，2M脲素，0.2mMGSH (还原型谷胱甘肽)，0.1mM GSSG (氧化型谷胱甘肽)，ρΗ7.9 ；
[0024]St印4:50mMTris (三羟甲基氨基甲烷)，50mM 氯化钠溶液，0.5mMEDTA，0.1% PEG,10%甘油，pH7.9 ；
[0025]St印5:50mMTris (三羟甲基氨基甲烷)，50mM氯化钠溶液，10%甘油，ρΗ7.9 ；
[0026]St印6:50mMTris (三羟甲基氨基甲烷)，50mM氯化钠溶液，10%甘油，pH7.9。
[0027]本发明提供的技术方案之四是:如前所述的杂合蛋白纳米粒子在制备靶向肿瘤细胞的药物中的用途。
[0028]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0029]本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0030]本发明的积极进步效果在于:在多肽修饰对纳米粒子的细胞功能特性的影响方面，本发明考察了细胞穿膜肽修饰纳米粒子对纳米粒子靶向特性的影响。结果表明，本发明的由N端修饰有穿膜肽的铁蛋白重链亚基纳米粒子和N端修饰有EGF的铁蛋白重链亚基纳米粒子组成的杂合蛋白纳米粒 子的穿膜效率比仅仅修饰有EGF的铁蛋白重链亚基纳米粒子高，其具有强的细胞穿透力，能够与肿瘤靶细胞有很强的结合，为后续选择药物靶向肿瘤细胞治疗提供了非常好的模型，具有很好的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0031 ] 图1为EGF/TAT-A-FTH1杂合蛋白颗粒的透射电镜图。
[0032]图 2 为 EGF/TAT-3-FTH1、EGF/TAT-4-FTH1、EGF/TAT-A-FTHl、EGF/TAT-N-FTH1 杂合蛋白颗粒对MCF-10A、MDA-MB-468、THP-1细胞的结合效果图，其中Apoferritin作为阴性对照，而EGF-FTHl作为阳性对照。
【具体实施方式】
[0033]下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0034]下述实施例中，所使用的主要仪器和试剂如下:
[0035]载体pET-28 (+)和 pET-28 (+)/FTHl 为实验室保存。E.col1.DH5 α 和 Ε.col1.BL2感受态细胞购于北京天根生化科技公司。
[0036]限制性内切酶购于Takara生物工程有限公司。
[0037]DNA引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
[0038]测序由上海美季生物技术有限公司完成。
[0039]隔水式恒温培养箱:GNP_9050型，购自上海精宏实验设备有限公司。
[0040]超声波细胞粉碎机:JY92-1IN型，购自宁波新芝生物科技股份有限公司。
[0041 ] 压力蒸汽灭菌器:SYQ-DSX-280B型，购自上海申安医疗器械厂。[0042]其余仪器或试剂如未特别述及，均为常规市售可得。
[0043]实施例1TAT-A-FTH1融合蛋白的表达
[0044]1、构建 pET-28 (+) /TAT-A-FTHl 基因工程菌
[0045]其中，TAT的氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0.5所示，其为已知序列。在模板TAT-FTHl质粒的EcoR I和Nco I两酶切位点之间突变为新序列，该段氨基酸序列由6个酸性氨基酸，3个碱性氨基酸和11中性氨基酸所组成。TAT-A的氨基酸序列如序列表中SEQID N0.1所示，其通过设计点突变引物并经PCR扩增获得，所述引物为TAT-A-F和TAT-A-R，其序列分别如序列表中SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.7所示。
[0046]将引物稀释到IOpmol，模板TAT-FTH1质粒浓度调整为50ng/ μ L，进行PCR，用DPnI酶对PCR产物进行消化，并使PCR产物自身环化。取出DH5 α感受态细胞100 μ L，冰浴融解。取上述自身环化产物IOyL,加入感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴放置30min。42°C,30sec热休克，冰浴放置2min。加入SOC培养基900 μ L，37°C振荡培养lh。取适量涂布于含卡那霉素的LB平板，室温正放0.5h。倒置37°C CO2培养箱过夜(16h以上)。
[0047]每个固体平板上随机挑选单菌落5个，分别加入到含卡那霉素的新鲜培养基IOm ；中，并做记号。放37°C恒温箱摇过夜。次日，取8m;培养基离心5500rpmX20min，得菌体。用按照天根生化公司的高纯度小提中量试剂盒说明书提取质粒。然后，对已提取的质粒进行Hinc II酶切验证。取5yL质粒分别加入E.coliBL21感受态细胞中，轻轻混匀后，放置冰上30min。然后放42°C水浴90s，再冰上静置5min。加入900 μ L的无菌SOC培养基，混匀放置37°C摇床2h。1000rpm离心5min，吸出800 μ L的上清。重悬剩下的菌液并均匀涂布于含50ng/y L卡那霉素的LB固体平板上。室温放置0.5h，待全部的菌液被吸收完，将平板倒置37 °C培养箱过夜。
[0048]2、TAT-A-FTHl目标蛋白的制备
[0049]从转化了 TAT-A-FTHl质粒的固体培养基上随机挑选饱满的单菌落，加入含50ng/μ L卡那霉素的新鲜液体培养基中，37°C摇菌过夜进行活化。然后以1: 100的比例加入50ml新鲜培养基中进行扩培。待菌液的OD值至0.6左右时，加入ImM/L的诱导剂IPTG，诱导4-5h，离心收集菌体，放-20°C冻存过夜。次日，往菌体加入10-15m ;的重悬液A[50mMPBS (磷酸盐缓冲液)，150mM NaCl, pH7.9]进行细胞超声破碎。破碎条件为:工作ls，间歇Is, 30min,功率300w。取100 μ L全细胞组，剩下的样品离心12000rpmxlomin，取上清液，收获可溶性蛋白TAT-A-FTH1。采用Superosee为填料的凝胶色谱柱分离目标蛋白，洗脱液为50mM PBS (磷酸盐缓冲液)，150mM NaCI，pH7.9，收集蛋白流出液。最后，超滤浓缩目标蛋白。
[0050]实施例2 ~4 融合蛋白 TAT-N-FTHl、TAT-3-FTH1、TAT-4-FTH1 和 EGF-FTH1 的表达
[0051]pET-28 (+)/TAT-N-FTHl、pET-28 (+)/TAT-3-FTH1、pET-28 (+)/TAT-4-FTH1、pET-28 (+)/EGF-FTHl基因菌的构建以及目标蛋白表达的诱导表达，方法同实施例1。
[0052]其中，TAT-N的氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0.2所示，其通过设计点突变引物并经PCR扩增获得，所述引物为TAT-N-F和TAT-N-R，其序列分别如序列表中SEQ ID N0.8和SEQ ID N0.9所示；TAT-3的氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0.3所示，其通过设计点突变引物并经PCR扩增获得，所述引物为TAT-3-F和TAT-3-R，其序列分别如序列表中SEQ ID N0.10和SEQ ID N0.11所示；TAT-4的氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0.4所示，其通过设计点突变引物并经PCR扩增获得，所述引物为TAT-4-F和TAT-4-R，其序列分别如序列表中SEQ IDN0.12 和 SEQ ID N0.13 所示。
[0053]TAT-N-FTHl也以可溶性蛋白的形式存在，而TAT_3_FTH1、TAT_4_FTH1和EGF-FTHl则以包涵体的形式存在于破壁细胞沉淀中。对于包涵体形式的融合蛋白，在破壁得到包涵体沉淀后，加入洗涤液[50mM Tris,50mM NaCl, ImM EDTA(乙二胺四乙酸)，1%Trion-100 (C34H62H11)，pH7.9]洗涤所得的包涵体4次，即得到较纯的包涵体。
[0054]实施例5杂合纳米粒子EGF/TAT-A-FTH1的制备
[0055]1、将纯化后的TAT-A-FTHl蛋白超滤浓缩，然后加适量的新鲜配制的变性液，并变性过夜。用0.22 μ m滤器过滤除去未变性的蛋白沉淀物。如果需要可以用50KDa的超滤管对滤出液再进行超滤浓缩，然后用考马斯亮蓝测定浓缩蛋白的浓度并进行SDS-PAGE考察其纯度和浓度。 [0056]2、用20-25mL的变性液处理洗涤后的包涵体EGF-FTHl融合蛋白，用超声破碎仪辅助重悬包涵体。待包涵体重悬至无明显颗粒，放于28°C摇床变性过夜。5500rpm离心20min，取上清组进行SDS-PAGE，观察变性后蛋白的纯度。然后用考马斯亮蓝对变性的蛋白浓度进行定量。
[0057]3、复性过程:先用考马斯亮蓝对蛋白浓度进行定量，然后将两种变性液按一定的比例混合后，使得蛋白总浓度为0.lmg/mL,总体积为50mL。用橡皮筋捆住透析袋的一端,将变性蛋白装入透析袋，用橡皮筋捆住透析袋的顶端。将透析袋放于IL的复性液中，4°C条件下开始复性。复性过程中逐渐减低脲素的浓度，使得变性蛋白慢慢正确折叠，大约隔6h换一次复性液。复性液的配方如下表:
[0058]Stepl:50mM Tris，50mM 氯化钠溶液，0.5mMEDTA，0.1 % PEG，10 % 甘油，4M 脲素，0.2mM GSH, 0.1mM GSSG, ρΗ7.9 ；
[0059]St印2:50mM Tris，50mM 氯化钠溶液，0.5mMEDTA，0.1 % PEG，10 % 甘油，3M 脲素，0.2mMGSH, 0.1mM GSSG, ρΗ7.9 ；
[0060]St印3:50mM Tris，50mM 氯化钠溶液，0.5mMEDTA，0.1 % PEG，10 % 甘油，2M 脲素，0.2mMGSH, 0.1mM GSSG, ρΗ7.9 ；
[0061]St印4:50mMTris，50mM 氯化钠溶液，0.5mMEDTA,0.1% PEG, 10%甘油，ρΗ7.9 ；
[0062]St印5:50mMTris，50mM 氯化钠溶液，10%甘油，ρΗ7.9 ；
[0063]St印6:50mMTris，50mM 氯化钠溶液，10%甘油，ρΗ7.9。
[0064]复性结束后，将透析袋里的蛋白溶液取出，离心，得上清液。用0.2μπι滤膜过滤除去未正确折叠的蛋白沉淀物。用50KDa超滤管对蛋白液进行浓缩到l_2mL左右，用考马斯亮蓝测定其蛋白含量。进行SDS-PAGE和NATIVE-PAGE考察复性蛋白是否能自组装成正确的笼状结构。所得的EGF/TAT-A-FTH1杂合蛋白纳米颗粒的透射电镜图如图1所示。
[0065]实施例6 ~8 杂合纳米粒子 EGF/TAT-N-FTH1、EGF/TAT-3-FTHl 和 EGF/TAT-4-FTH1的制备
[0066]其方法和过程同EGF/TAT-A-FTH1相同。
[0067]实施例9
[0068]EGF/TAT-3-FTH1杂合蛋白纳米粒子细胞靶向性的研究
[0069]1、标记荧光染料荧光素-5-马来酰亚胺(FAM)
[0070]荧光染料FAM，又名荧光素-5-马来酰亚胺，它可以和蛋白质表面游离的巯基在适当的温度和pH条件下反应发生化学偶联。因而荧光素连接在蛋白质表面，实现其荧光修饰。
[0071]荧光标记过程一般为:将复性后的纳米粒子超滤浓缩后，用50mMPBS、150mMNaCl、pH7.0的溶液重悬复性液，浓缩体积约100 μ L，加适量的FAM荧光染料，使得蛋白亚基与FAM的摩尔比在1: 10左右。然后混匀，将混合液的pH调节到7.0-7.5，避光室温放水平摇床30min，4°C反应过夜。
[0072]2、细胞靶向性的研究
[0073](I)用胰酶消化MDA-MB-468、MCF-10A和THP-1数盘集中于离心管中，离心1000rpmx5min,去掉上清液。然后加入适量的新鲜培养基重悬细胞，稀释并计数后分装，每管约5 X IO5个细胞。
[0074](2)用预冷的0.5% BSA PBS洗涤分装的细胞三到四遍，1000rpmx5min去掉上清液，再用0.5% BSAPBS重悬，将最终体积调为100 μ L。
[0075](3)加入标有FAM的纳米粒子，冰上孵育Ih左右，期间每隔IOmin轻轻摇晃一次。
[0076](4)孵育结束后，每次用预冷的0.5% BSA PBS洗涤三次，去掉未结合于细胞的标记FAM的纳米粒子。
[0077](5)0.5mL0.5% BSA PBS溶液重悬细胞，流式细胞仪测定荧光强度。
[0078]乳腺癌细胞MDA-MB-468中的荧光强度明显高于MCF-10A、THP-1的荧光强度，说明EGF/TAT-3-FTH1对癌细胞 的靶向性更好。
[0079]实施例10~13
[0080]杂合蛋白纳米粒子EGF/TAT-A-FTH1、EGF/TAT-N-FTH1、EGF/TAT-4-FTH1 细胞靶向性的研究
[0081]具体方法和步骤同杂合蛋白纳米粒子EGF/TAT-3-FTH1，参见实施例9。
[0082]效果实施例1
[0083]此外，从流式细胞仪测定的各纳米粒子与细胞靶向性的结果来看，在MDA-MB-468组中，EGF/TAT-N-FTH1和EGF/TAT-3-FTH1纳米粒子处理的荧光值为38025和28168，而阳性对照组EGF-FTHl处理的荧光值为6527，说明EGF/TAT-N-FTH1和EGF/TAT-3-FTH1比其他纳米粒子更能有效与细胞结合。同时在MCF-10A和THP-1两组中，实验组与阳性对照组无明显的差异。说明插入中性氨基酸后，能有效改变纳米粒子的表面特性，增加他们与细胞的结合。而由于THP-1及MCF-10A表达EGFR受体较少，纳米粒子的表面特性也不能有效影响它们这两种细胞的结合。以上结果说明，在静态条件下纳米粒子与细胞结合的主要作用方式是纳米粒子表面的EGF配体与细胞表面的EGFR受体的特异性结合；表面修饰多肽能有效地影响纳米粒子与细胞的结合情况，含有中性氨基酸的多肽修饰纳米粒子后能有效增加其结合程度。其结果反映于图2中，其中横坐标为不同的杂合蛋白纳米粒子，纵坐标为荧光强度值。
[0084]
【权利要求】
1.一种铁蛋白重链亚基纳米粒子，其特征在于，其在FTHl的N端修饰有穿膜肽。
2.如权利要求1所述的铁蛋白重链亚基纳米粒子，其特征在于，所述穿膜肽的氨基酸序列如 SEQ ID N0.1，SEQ ID N0.2，SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4 中的任一种所示。
3.一种杂合蛋白纳米粒子，其特征在于，其由N端修饰有穿膜肽的铁蛋白重链亚基纳米粒子和N端修饰有EGF的铁蛋白重链亚基纳米粒子组成。
4.如权利要求3所述的杂合蛋白纳米粒子的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤: (1)基因工程菌株的构建:分别构建表达N端修饰有穿膜肽的铁蛋白重链亚基融合蛋白和N端修饰有EGF的铁蛋白重链亚基融合蛋白的基因工程菌株，其中，所用的表达载体为pET-28 (+)，所用的宿主菌为大肠杆菌； (2)融合蛋白的表达和收获:将步骤(1)所述的基因工程菌株接种于LB培养基上培养，加入IPTG诱导表达，然后破碎菌体，离心，分别收获表达N端修饰有穿膜肽的铁蛋白重链亚基融合蛋白和N端修饰有EGF的铁蛋白重链亚基融合蛋白； (3)杂合蛋白纳米粒子的自组装:将步骤(2)收获的表达N端修饰有穿膜肽的铁蛋白重链亚基融合蛋白和N端修饰有EGF的铁蛋白重链亚基融合蛋白在体外进行变性，然后置于透析液中进行梯度透析复性，收获自组装而得的杂合蛋白纳米粒子。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤⑴中，所述的穿膜肽的氨基酸序列如 SEQ ID N0.1，SEQ ID N0.2，SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4 中的任一种所示。
6.如权利要求4 所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的大肠杆菌为E.colilBL21 菌株。
7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，收获表达N端修饰有穿膜肽的铁蛋白重链亚基融合蛋白和N端修饰有EGF的铁蛋白重链亚基融合蛋白的方式为将包涵体蛋白进行洗涤和纯化；或者，将可溶性蛋白进行凝胶过滤层析，以达到纯化的目的。
8.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的梯度透析复性包括如下步骤:将变性的融合蛋白按比例混合，使得蛋白总浓度为0.lmg/mL ;用橡皮筋捆住透析袋的一端，将变性蛋白装入透析袋，用橡皮筋捆住透析袋的另一端；将透析袋置于复性液中，4°C条件下开始复性，复性过程中逐渐减低脲素的浓度，使得变性蛋白慢慢正确折叠，隔6h换一次复性液，经由Stepl~St印6复性结束后，将透析袋里的蛋白溶液取出，离心，得上清液，用0.2 μ m滤膜过滤除去未正确折叠的蛋白沉淀物。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述复性液的配方如下:Stepl:50mMTris，50mM 氯化钠溶液，0.5mMEDTA,0.1% PEG, 10%甘油，4M 脲素，0.2mM GSH，0.1mM GSSG,ρΗ7.9 ； St印2:50mM Tris,50mM 氯化钠溶液，0.5mMEDTA,0.1 % PEG, 10 % 甘油，3M 脲素，0.2mMGSH, 0.1mM GSSG, ρΗ7.9 ； St印3:50mM Tris,50mM 氯化钠溶液，0.5mMEDTA,0.1 % PEG, 10 % 甘油，2M 脲素，0.2mMGSH, 0.1mM GSSG, ρΗ7.9 ；
St印4:50mM Tris,50mM 氯化钠溶液，0.5mMEDTA,0.1% PEG，10%甘油，ρΗ7.9 ； St印5:50mMFris,50mM 氯化钠溶液，10%甘油，ρΗ7.9 ； St印6:50mM Tris, 50mM 氯化钠溶液，10%甘油，ρΗ7.9。
10.如权利要求3所述的杂合蛋白纳米粒子在制备靶向肿瘤细胞的药物中的用途。
【文档编号】B82Y30/00GK104017089SQ201410292853
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月25日 优先权日:2014年6月25日
【发明者】曹旭妮, 黄培森, 王焦清 申请人:华东理工大学