专利名称：一种T－淋巴细胞核仁形成区嗜银蛋白Ag－NORs的检测方法
技术领域：
本发明属于生物检测方法，特别是一种淋巴细胞核仁形成区嗜银蛋白Ag—NORs的检测方法。
现有技术中的检测只用于组织切片，受检者必须先行手术，取活体组织进行制片染色检查，病人痛苦大，并且不宜重复检查。
本发明采取了新检测对象，即对外周血中的T—淋巴细胞进行检测，克服了现有技术中的不足，提供了一种用血量小、操作简便、过程简单、易于普及的T—淋巴细胞核仁形成区嗜银蛋白Ag—NORs的检测方法。
本发明的T—淋巴细胞核仁形成区嗜银蛋白Ag—NORs的检测方法，包括细胞培养、细胞分离、制片、染色、检测五个部分。
1．细胞培养(1)培养液的制备培养液的组成成分及配制1000克培养液的用量为N—(2—羟乙基)哌嗪—N’—2—乙烷磺酸(Hepes)3—6g碳酸氢钠 1—3gRPMI 1640培养基(干粉) 5—10gL—谷氨酰胺(LG)0．1—0．3g肝素钠(150u／mg) 0．1—0．3g植物血凝素(PHA)5—20mg
胎牛血清 100—300ml青霉素(80万u／2ml)0．1—0．5ml链霉素(100万u／2ml) 0．1—0．5ml余量用蒸馏水补齐。
该培养液的PH值为6．5—7．5。
该培养液是通过如下方法及步骤制备而成的①将Hepes、碳酸氢钠和1640培养基三种试剂按计量置于容器中，向容器中加入约300毫升蒸馏水，于37℃下混合溶解，再加入剩余量的蒸馏水，混合均匀待用；②取密封在容器中的胎牛血清或将胎牛血清置于容器中，在56℃水浴箱内30分钟灭活，冷却至室温后加入到①步骤制得的水溶液中；③将L—谷氨酰胺、肝素钠、植物血凝素(PHA)、青霉素和链霉素，加入到②步骤的溶液中，充分混匀，直至全部溶解。
④将上述溶液用滤膜滤菌器过滤，即得本发明的培养液。
将培养液分装、密封后，于—18℃以下冰冻保存。培养液置于37℃孵箱内孵育一周无细菌生长，则为合格。
(2)细胞培养依如下方法和步骤进行T—淋巴细胞培养①室温下将冰冻的、上述T—淋巴细胞培养液解冻；②抽取静脉血注入盛培养液的容器内，立即混匀，血与培养液的体积比为1∶8—12；
③将培养瓶置于37℃±O．5℃培养箱中，48—96小时后即完成细胞培养。
2．细胞分离(1)吸入上述细胞培养步骤制得的细胞液4．5ml，在转速为2000转／分条件下离心5分钟；(2)弃上清，然后加入低渗液5ml充分混匀，再加固定液0．5ml混匀，在转速为2000转／分条件下离心5分钟；(3)弃上清，加固定液5ml混匀，在转速为2000转／分条件下离心5分钟；(4)弃上清，加固定液5ml混匀，在转速为2000转／分条件下离心5分钟；(5)弃上清，加固定液0．3ml，混匀备用。
上述低渗液为0．43％氯化钠溶液；固定液为甲醇与冰醋酸按体积比3∶1比例配制的混合溶液。
3．制片(1)将冷冻载玻片置于水平位；(2)吸取经细胞分离步骤后的细胞悬液，在距玻片20cm高度处，向玻片滴加2—3滴；(3)细胞悬液快干时，将玻片快速过火2—3次，室温凉干。
4．染色(1)染色液的制备
染色液由A液和B液两部分组成，A液的组成成分及其配比为硝酸银(分析纯)30—60g，蒸馏水100ml。A液的优选配比为硝酸银(分析纯)50g，蒸馏水100ml。A液的配制方法为按比例将硝酸银加入到蒸馏水中，充分搅拌，直至完全溶解，并装入棕色瓶中于2—8℃保存。
B液的组成成分及其配比为明胶1—3g，纯甲酸200—500微升，蒸馏水100ml。B液的优选配比为明胶2g，甲酸250微升，蒸馏水100ml。B液的配制方法为将甲酸加入到蒸馏水中，混匀，再加入明胶，混合均匀，然后放入37℃培养或室温中至完全溶解，即得本发明的B液。将B液于2—8℃下保存。
细胞染色时，A液与B液的体积比为1—3∶1(2)染色按如下方法进行细胞染色①将按上述(1)步骤制得的染色液的A液和B液置于室温或37℃温箱中恒温备用；②将三用水箱预热至80—90℃后恒温；③将上述制片步骤制好的玻片放在水箱之铝板上；④向玻片上有细胞悬液处，先后滴加A液和B液，两者的体积比为1—3∶1，混匀后将盖玻片盖上；⑤待颜色变为深金黄色后，将玻片取下；⑥用少量、慢速自来水冲净玻片，再用蒸馏水冲一遍，晾干，即完成染色。
5．检测将上述经过染色步骤的玻片在KL型肿瘤免疫图像分析系统(由北京健尔康医疗设备有限公司开发生产)进行读片，分析30—50个细胞，取胞核与核仁形成区面积比平均值作为量化值。
本发明的所有步骤及过程中，所使用的器皿及其它用具等全部需要消毒灭菌处理，而且所有操作均应符合无菌操作，消毒灭菌方法和无菌操作方法均属于本领域的公知技术。
本发明的T—淋巴细胞核仁形成区嗜银蛋白Ag—NORs的检测方法，具有如下优点(1)用血量少，仅需要0．4—0．5ml血样，而现有技术一般需要5—10毫升；(2)细胞培养方法简便、省时、易操作、设备简单，而现有技术中需要用淋巴细胞分离液做淋巴细胞分离，而且需要较昂贵的二氧化碳培养箱，操作繁琐、费时、仪器昂贵。
(3)标本染色效果好，染色均匀，背景清晰；(4)染好的标本片色泽稳定，室温干燥条件下1—2个月不退色。
下面结合实施例进一步说明本发明实施例一本实施例的T—淋巴细胞核仁形成区嗜银蛋白Ag—NORs的检测方法，包括细胞培养、细胞分离、制片、染色、检测五个部分。
1．细胞培养(1)培养液的制备按上述方法配制培养液，其组成成分及配制1000克培养液的用量为Hepes 4．76g碳酸氢钠 1．6gRPMI 1640培养基 8．32gL—谷氨酰胺(LG) 0．3g肝素钠(150u／mg) 0．1g美国sigma生产的PHA—P 10mg青霉素(80万u／2ml)0．35ml链霉素(100万u／2ml) 0．3m胎牛血清 200ml余量用蒸馏水补齐。
该培养液的PH值为7．0—7．2。
(2)细胞培养依下列方法及步骤进行T—淋巴细胞的培养(1)室温下将上述4ml冰冻的淋巴细胞培养液解冻；(2)抽取静脉血0．4—0．5ml注入盛培养液的容器内，立即将两者混匀；(3)将上述容器置于37℃±0．5℃培养箱中，72小时后即完成细胞
(4)培养。
依此方法，T—淋巴细胞转化率达80％以上，而且胞核涨大，核仁分裂。
2．细胞分离(1)吸入上述细胞培养步骤制得的细胞液4．5ml，在转速为2000转／分条件下离心5分钟；(2)弃上清，然后加入低渗液5ml充分混匀，再加固定液0．5ml混匀，在转速为2000转／分条件下离心5分钟；(3)弃上清，加固定液5ml混匀，在转速为2000转／分条件下离心5分钟；(4)弃上清，加固定液5ml混匀，在转速为2000转／分条件下离心5分钟；(5)弃上清，加固定液0．3ml，混匀备用。
上述低渗液为0．43％氯化钠溶液；固定液为甲醇与冰醋酸按体积比3∶1比例配制的混合溶液。
3．制片(1)将冷冻载玻片置于水平位；(2)吸取经细胞分离步骤分离的细胞悬液，在距玻片20cm高度处，向玻片滴加2—3滴；(3)细胞悬液快干时，将玻片快速过火2—3次，室温凉干。
4．染色
(1)染色液的制备按上述方法制备如下配比的染色液A液硝酸银(分析纯)50g，蒸馏水100ml；B液明胶2g，甲酸340微升，蒸馏水100ml。
(2)染色按如下方法进行T—淋巴细胞染色，其步骤为(1)将上述A液和B液置于室温或37℃温箱中恒温备用；(2)将三用水箱预热至85℃后恒温；(3)将上述制片后的玻片放在水箱之铝板上；(4)向玻片上先后滴加A液4滴、B液2滴，混匀后将盖玻片盖上；(5)待颜色变为深金黄色后，将玻片取下；(6)用少量、慢速自来水冲净玻片，再用蒸馏水冲一遍，晾干，即完成染色。
5．检测将上述经过染色步骤的玻片在KL型肿瘤免疫图像分析系统(由北京健尔康医疗设备有限公司开发生产)进行读片，分析30—50个细胞，取胞核与核仁形成区面积比平均值作为量化值。
实施例二本实施例中所用染色液的B液的组成成分及配比为明胶2g，甲酸250微升，蒸馏水100ml。其余试剂、步骤及条件均与实施例一相同。
权利要求
1．一种T—淋巴细胞核仁形成区嗜银蛋白Ag—NORs的检测方法，其特征在于其包括T—细胞的培养、分离、制片、染色、检测五个部分；(1)细胞培养①培养液的制备培养液的组成成分及配制1000克培养液的用量为N—(2—羟乙基)哌嗪—N’—2—乙烷磺酸(Hepes)3—6g碳酸氢钠 1—3gRPMI 1640培养基(以干粉量计)5—10gL—谷氨酰胺(LG)0．1—0．3g肝素钠(150u／mg) 0．1—0．3g植物血凝素(PHA)5—20mg胎牛血清 100—300ml青霉素(80万u／2ml) 0．1—0．5ml链霉素(100万u／2ml)0．1—0．5ml余量用蒸馏水补齐；该培养液的PH值为6．5—7．5；②细胞培养Ⅰ．室温下将冰冻的、上述①步骤制备的T—淋巴细胞培养液解冻；Ⅱ．抽取静脉血注入盛培养液的容器内，立即混匀，血与培养液的体积比为1∶8—12；Ⅲ．将上述容器置于37℃±0．5℃培养箱中48—96小时；(2)细胞分离①吸入经过细胞培养步骤制得的细胞液4．5ml，在转速为2000转／分的条件下离心5分钟；②弃上清，然后加入低渗液5ml充分混匀，再加固定液0．5ml混匀，在转速为2000转／分条件下离心5分钟；③弃上清，加固定液5ml混匀，在转速为2000转／分条件下离心5分钟；④弃上清，加固定液5ml混匀，在转速为2000转／分条件下离心5分钟；⑤弃上清，加固定液0．3ml，混匀备用；上述低渗液为0．43％氯化钠溶液；固定液为甲醇与冰醋酸按体积比3∶1比例配制的混合溶液；(3)制片①将冷冻载玻片置于水平位；②吸取经细胞分离步骤分离的细胞悬液，在距玻片20cm高度处，向玻片滴加2—3滴；③细胞悬液快干时，将玻片快速过火2—3次，室温凉干；(4)染色①染色液的制备染色液由A液和B液两部分组成，A液的组成成分及其配比为硝酸银(分析纯)30—60g，蒸馏水100ml；B液的组成成分及其配比为明胶1—3g，纯甲酸200—500微升，蒸馏水100ml；细胞染色时，A液与B液的体积比为1—3∶1；②染色按如下方法进行细胞染色Ⅰ．将上述①步骤制备的染色液A液和B液置于室温或37℃温箱中恒温备用；Ⅱ．将三用水箱预热至80—90℃后恒温；Ⅲ．将上述制片步骤制好的玻片放在水箱之铝板上；Ⅳ．向玻片上有细胞悬液处，先后滴加A液和B液，两者的体积比为1—3∶1，混匀后将盖玻片盖上；Ⅴ．待颜色变为深金黄色后，将玻片取下；Ⅵ．用少量、慢速自来水冲净玻片，再用蒸馏水冲一遍，晾干，即完成染色；(5)检测将上述(4)步骤经过染色的玻片在KL型肿瘤免疫图像分析系统进行读片，分析30—50个细胞，取胞核与核仁形成区面积比平均值作为量化值。
2．如权利要求1所述的T—淋巴细胞核仁形成区嗜银蛋白Ag—NORs的检测方法，其特征在于所述组成染色液的A液和B液的组成成分和配比为A液硝酸银(分析纯)50g，蒸馏水100ml；B液明胶2g，甲酸250微升，蒸馏水100ml。
全文摘要
本发明涉及一种T－淋巴细胞核仁形成区嗜银蛋白Ag－NORs的检测方法,其包括细胞培养、细胞分防、制片、染色、检测五个部分,具有用血量小、操作简便、过程简单、易于普及等优点。
文档编号G01N33/569GK1278601SQ0010965
公开日2001年1月3日 申请日期2000年6月21日 优先权日2000年6月21日
发明者张国庆 申请人:张国庆