专利名称：四种病原体抗体检测试剂盒的制备方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域体外诊断试剂的制备。
我国现有先天性畸形致残者640万人，另有智力发育低下者1000万人，其中约50％为先天性的原因所致。据统计，在我国14岁以下的残疾儿童中先天性因素致残者达420万人，每年尚有38万例畸型儿出生，这给社会与家庭带来了沉重的经济与精神负担。先天性畸形除遗传性因素以外，主要是感染性因素。造成儿童先天性畸形的主要感染性因素包括人类巨细胞病毒(HCMV)，风疹病毒，Ⅰ、Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-1，2)及弓形虫造成的宫内感染。这四种病原体在孕妇围产期的感染造成的新生儿畸形约占总感染性畸形因素的90％以上，除造成新生儿畸形外，尚可导致儿童的智力低下。据统计，全国的弱智残疾人有1000余万，除近亲结合、缺碘原因外，先天性上述四种病原体的感染是一个重要的原因。在改革开放，以计划生育为基本国策的今天，优生优育对于整个社会与每一个家庭都是一个十分迫切的愿望。有鉴于此，国家计划生育委员会及其下属的各级计划生育部门、各级妇幼保健系统十分重视围产期妇女的保健工作，全国许多省、市已在婚前检查、孕期开展上述四种病原体的感染状态的检查，对于活动性感染的孕妇进行定期的监控，必要时进行药物治疗或人工流产以确保胎儿的正常发育。人类巨细胞病毒(HCMV)，风疹病毒，Ⅰ、Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-1，2)及弓形虫造成的宫内感染在人群中是十分普遍的。文献表明我国16岁以上人群的近100％曾经感染过人类巨细胞病毒、单纯疱疹病毒。人类巨细胞病毒及单纯疱疹病毒是属于疱疹病毒科的双股DNA病毒，在正常人群的感染不会造成严重的致死性的疾病，一般只有轻微的疾病表现，如唇疱疹、三叉神经痛等。但这两类病毒感染人体后，可以长期潜伏在体内，当机体的免疫能力低下时，可以有复发感染。在特定人群如在妇女的怀孕期有原发感染或复发感染时，病毒可经胎盘感染胎儿，造成胎儿的畸型或智力低下。风疹病毒属RNA病毒，多于冬春季节流行，在孕期的原发感染也可造成胎儿的畸型、智力低下或白内障。弓形虫则主要寄居在家畜及家庭宠物如猫的体内，其人群感染率近年呈不断上升的势头。
近年来，国内外学者对这四种病原体感染的快速诊断方面做了大量工作，其中包括细胞病理学检查、细胞培养中早期核抗原检测、临床标本中相关抗原的直接检测、血清学快速诊断、核酸杂交技术和聚合酶链反应(PCR)等方法。这些诊断技术，均有其特定的优缺点，但大多数需要有一定的实验室设备，甚至较为昂贵的检测仪器，不适合于基层的推广应用。
酶联免疫吸附实验是一种结合免疫学和生物酶学先进方法的抗体检测技术，具有稳定、灵敏、特异、快速、操作简单及结果判定简单等特点。ELISA技术广泛应用于多个病原体抗体抗原的检测，特别便于基层医学化验室的推广应用。在国际同类抗体检测ELISA试剂盒中，有两种基本的技术路线，即间接性ELISA方法和捕获性ELISA方法。
本发明采用了现代分子生物学技术对抗原加以纯化，对反应过程加以优化以减少非特异性反应，并采用酶联免疫检测技术路线使试剂的使用更为安全、简便、易于推广普及。已有的四种酶联免疫检测方法，应用于四种与优生优育密切相关的四种病毒相关的IgM型抗体的检测，具有灵敏度高，特异性强，方法简便，重复稳定性好的特点。产品使用效果与国外同类产品相近，同时后期的产品包装设计合理，搭配得当，为本发明的产品化，商品化提供了保证。
本发明的目的是这样实现的选用巨细胞病毒(CMV)、单纯疱疹病毒(HSV)、风疹病毒(RV)、弓形虫(TP)四种病原体各自的敏感细胞株，分别接种四种病原体的标准毒株，经细胞培养，获取抗原。通过高速离心和Sephadex凝胶柱的分子筛作用进行抗原纯化。并将纯化抗原用标准的阳性血清滴定抗原的效价。以一定浓度的抗原包被96孔ELISA反应板，同配套的商品化的辣根过氧化物酶标羊抗人IgM以及其他一系列的相关显色试剂以及阴阳性标准对照，组装成TORCH ELISA抗体检测试剂盒。
工艺流程1抗原制备的流程选取胚龄5-7周水囊引产的胎儿双肺，↓用含双抗的PRMI 1640液冲洗3遍后剪成1mm3大小碎块。置100ml小烧杯内。
↓加适量0.05％胰蛋白酶液(一般为10倍于组织块量)置4℃冷消化12小时，或置37℃震荡热消化1小时。
↓1000rpm/5min离心后去上清，加入营养液，过200目不锈钢网，配成1×106个细胞/ml的悬液。
↓在250ml细胞培养瓶分别接种四种病原体的标准毒株↓待细胞病变(CPE)达80-90％时，倒掉维持液。
↓0.01M pH7.4 PBS洗单层细胞3次。
↓用pH9.0甘氨酸抗原提取液，洗脱裂解病变细胞。
↓超声粉碎病变细胞↓8000rpm/min，4℃离心30-60min↓上清液经紫外线照射灭活病毒后，加吸附剂再离心去除正常细胞成分。
↓上清液经Westem blot确定含主要抗体中和决定簇的蛋白成分的分子量↓上清液选用相应的凝胶分子筛Sephadex G-75填充柱回收特定的病毒蛋白↓测蛋白含量，用方阵滴定病毒抗原或-70℃保存备用。
↓以美国GB和Sigma公司阳性和阴性对照血清作为标准参照血清，采用常规方阵滴定法确定抗原的工作浓度。
2 ELISA.包板与操作流程间接ELISA法原理利用病原体可溶性抗原包板(3-5mg/ml)，再加入待检经吸附血清，通过与酶标二抗结合，显色测定结果。
抗原包被方法与操作流程抗原包被抗原用包被液稀释至100μg/ml，每孔加100μl 37℃过夜干板。
↓封闭加0.2％牛白蛋白封闭液100μl/孔37℃ 1h，洗2次。
↓待检血清血清1:80稀释加至反应板孔中，100μl/孔，37℃1h，洗3次，每次0.5min。
↓酶标物酶标二抗工作液加50μl/孔，37℃ 1h，洗3次，每次0.5min。
↓显色加OPD片剂稀释的底物液50μl/孔，37℃ 15min。
↓中止反应加1滴2MH2SO4/孔。
↓结果判断以空白调零孔校正零点，测定490nm下各孔的吸光度(OD)值。
实施例1人巨细胞病毒(HCMV)检测诊断试剂盒的制备抗原制各方法一、细胞株的构建与培养为保证细胞培养的成功进行，实验室按以下条件进行人胚肺二倍体细胞株的构建1.人胚龄的选择选取胚龄5-7周水囊引产的胎儿，自放置水囊至胎儿娩出不超过18小时，胎儿娩出后1小时内在4℃环境内送达实验室。
2.原代细胞培养(1)在无菌室内将胎儿皮肤作常规无菌消毒处理，实施胸腔术取出双肺，用含双抗的PRMI 1640液冲洗3遍后剪成1mm3大小碎块。
(2)将所得的组织块用1640液冲液洗二遍，置100ml小烧杯内，加适量0.05％胰蛋白酶液(一般为10倍于组织块量)置4℃冷消化12小时，或置37℃震荡热消化1小时。
(3)用长吸管轻吹打，吸上清1000rpm/5min离心后去上清，沉淀加入营养液，过200目不锈钢网，配成1×106个细胞/ml悬液。(余下组织块可按方法1.2.2补偿新鲜胰蛋白酶再消化)(4)将细胞置250ml培养瓶中，37℃ CO2培养箱中培养。
3.传代细胞培养原代细胞5-7天在传代一次，5-10代细胞可用于接种HCMV毒种制备细胞抗原。(详见抗原制备工艺流程)二、HCMV抗原制备与纯化通过Western blot使用多克隆血清确定经细胞工程制备的抗原中含主要抗体中和决定簇的蛋白成分的分子量，选用凝胶分子筛Sephadex G-75填充过柱，并回收抗原蛋白作为抗原。
1.测定蛋白含量，用前用方阵法滴定效价，选择最适滴度或-70℃分装保存2.抗原制备工艺路线本试剂盒由包被HCMV抗原的96孔硬质可分隔塑料板，酶标羊抗人IgM血清、血清吸附剂(10％SPA)、阳性和阴性对照血清、底物液(OPD片剂及其配制液)、洗涤液(PH7.2 PBS-吐温20液)和终止液等共同组成。其制备工艺具体如下三、ELISA包板与操作流程ELISA.包板与操作流程1.HCMV-间接ELISA法原理利用HCMV可溶性抗原包板(3-5mg/ml)，再加入待检经吸附血清，通过与酶标二抗结合，显色测定结果。
2.抗原包被方法与操作流程(1) 抗原包被抗原用包被液稀释至100μg/ml，每孔加100μl 37℃过夜干板。
↓(2) 封闭加0.2％牛白蛋白封闭液100μl/孔37℃ 1h，洗2次。
↓(3) 待检血清:血清1:80稀释加至反应板孔中，100μl/孔，37℃ 1h，洗3次，每次0.5min。
↓(4) 加酶标物酶标二抗工作液加50μl/孔，37℃1h，洗3次，每次0.5min。
↓(5) 显色加OPD片剂稀释的底物液50μl/孔，37℃ 15min。
↓(6) 中止加1滴2MH2SO4/孔。
↓(7) 结果判断以空白调零孔校正零点，测定490nm下各孔的吸光度(OD)值。
四、诊断试剂盒的组成本试剂盒HCMV抗原包被酶标板，用含1μg的抗原96孔ELLSA反应板，配以酶标记羊抗人IgM抗体，以间接ELISA法检测HCMV抗体，供HCMV活动性感染诊断用。
试剂盒组成96孔包被反应板2块阳性对照 1支阴性对照 1支酶标试剂IgM 1支洗液(10X) 1瓶底物OPD片 2片底物缓冲液1瓶终止液1瓶血清稀释液1瓶血清吸附剂1瓶实施例2单纯疱疹病毒检测诊断试剂盒的制备一、抗原制备方法1.用自建HEF(5～15代)单层细胞，培养液为含10％新生小牛血清的RPMI 1640CM，维持液为将小牛血清改为2～5％，每250ml细胞瓶接种HSV-1毒种0.2毫升。
2.2天后，待细胞病变达90％时收获，倒掉维持液，PBS洗3次，每瓶病变细胞加5ml pH9.0甘氨酸缓冲液，洗脱裂解。
3.超声波处理1-2分钟，6000rpm/min 4℃离心20分钟取上清，灭活病毒，并用吸附剂处理抗原液以除去正常HEF成纤维细胞成分。通过Western blot使用多克隆血清确定经细胞工程制备的抗原中含主要抗体中和决定簇的蛋白成分的分子量，选用相应的凝胶分子筛Sephadex G-75填充过柱，并回收特定的抗原蛋白作为抗原。
4.测定蛋白含量，用前用方阵法滴定效价，选择最适滴度或-70℃分装保存。
二、包板与操作流程1.HSV-1间接ELISA法原理利用HCMV可溶性抗原包板(＞5mg/ml)，再加入待检经吸附血清，通过与酶标二抗结合，显色测定结果。
2.包板与液体配制同CMV IgM抗体检测试剂盒的研制。
3.结果判断同CMV IgM抗体检测试剂盒的研制。
实施例3风疹病毒IgM抗体检测试剂的研制一、抗原制备方法1.材料(1)BHK-21细胞，购自中国生物制品检定所。
(2)风疹病毒Gos-10株，购自中国生物制品检定所。
(3)其它，同HCMV抗原的制备。
2.风疹病毒细胞抗原的制备方法(1)将传代细胞BHK-21培养至单层，培养液为含量10％新生小牛血清的RPMI1640，维持液为含量4％新生小牛血清的RPMI1640。在250ml培养瓶中接种RV毒种0.2ml。
(2)接种RV毒种后2-3天，开始出现CPE，倒掉维持液，以PBS洗3遍，每瓶加5ml pH9.0甘氨酸缓冲液洗脱裂解。
(3)超声波处理1～2分钟，6000rpm/min 4℃离心20分钟取上清，灭活病毒，并用吸附剂处理抗原液以除去正常细胞成分。通过Western blot使用多克隆血清确定经细胞工程制备的抗原中含主要抗体中和决定簇的蛋白成分的分子量，选用相应的凝胶分子筛Sephadex G-75填充过柱，并回收特定的抗原蛋白作为抗原。
(4)蛋白含量测定，同前述方阵法滴定效价，选择最适滴度或-70℃分装保存。
二、包板与操作流程1.RV特异性IgM抗体间接ELISA法检测原理
利用RV可溶性抗原包板(＞5mg/ml)，再加入待检经吸附血清，通过与酶标二抗结合，显色测定结果。
2.包板与液体配制同HCMV IgM抗体检测试剂盒的研制。
3.结果判断同HCMV IgM抗体检测试剂盒的研制。
实施例4弓形虫特异性IgM抗体酶联免疫检测试盒的研制一、抗原制备方法1.BS细胞株的建立同HCMV2.弓形虫速殖子接种培养弓形虫种接种小鼠腹腔，每日观察小鼠变化，自第二天接种的小鼠出现症状，并逐渐加重，一般4-5天死亡，用接近死亡小鼠无菌条件下解剖，取其腹腔液。自建2SB(5-15代)单层细胞，培养液为含10％新生小牛血清的RPMI 1640，维持液为将小牛血清改为2-5％，每250ml细胞瓶接种小鼠腹腔液(含大量速殖子)0.2毫升。每日于倒置显微镜下观察，于24小时后即可见到速殖子，约72小时后，培养的上清液中可见到大量的速殖子，单层细胞趋向脱落，离心收集速殖子及细胞。
3.速殖子的纯化采用超声粉碎结合胰酶消化法速殖子悬液经超声粉碎后，用0.25％的胰酶(终浓度为0.05％)37℃消化1小时。该法虫体不丢失，□适用于细胞培养的速殖子悬液。
4、抗原的提取与纯化纯化的速殖子加灭菌双蒸水混匀，超声粉碎，□10000rpm/min离心30-60min，上清液加等量1.7％的氯化钠溶液.即为可容性粗制抗原。通过Westem blot使用多克隆血清确定经细胞工程制备的抗原中含主要抗体中和决定簇的蛋白成分的分子量，选用相应的凝胶分子筛Sephadex G-75填充过柱，并回收特定的抗原蛋白作为抗原。测蛋白含量。
5.用弓形虫特异性IgM阳性血清滴定抗原，方法同HCMV。
二、包板与操作流程1.包板及液体配制同HCMV IgM诊断试剂盒。
2.结果判断同HCMV IgM诊断试剂盒。
巨细胞病毒(HCMV)IgM诊断试剂盒使用说明书本试剂盒HCMV抗原包被酶标板，配以酶标记羊抗人IgM抗体，以间接ELISA法检测HCMV抗体，供HCMV活动性感染诊断用。
(一).试剂盒组成1.96孔包被反应板2块2.阳性对照 1支3.阴性对照 1支4.酶标试剂IgM 1支5.洗液(1∶10稀释) 1瓶6.底物OPD片 2片7.底物缓冲液1瓶8.终止液1瓶9.血清稀释液1瓶10.血清吸附剂 1瓶(二).操作程序1.血清处理取待检血清25ul，加血清吸附剂25ul混合，再用血清稀释液补足至总体积125ul(血清最终稀释度为1:5)，混匀后置37℃，30-40分钟(或4℃过夜)3000转/min离心10分钟，取上清液备用。
2.检测步骤(1)取上述上清液20ul(血清最终稀释度为1:80)混匀。
(2)取抗原板，每份血清加二孔，每孔加血清100ul，每块抗原板均设阳性、阴性及空白对照各二孔。每孔均加100ul，空白加稀释液。置37℃湿盒60分钟。甩去孔中液体，再用洗涤液洗3次，每次2分钟，每次均需拍干。
(3)加酶标羊抗人IgM，(按工作浓度标号用血清稀释液稀释)每孔50ul，置37℃湿盒90分钟，甩去孔中液体，洗涤4次，每次2分钟，每次均需拍干。
(4)取底物OPD一片，加10毫升底物缓冲液充分溶解(临时配用)每孔加底物液50ul，置22-25℃湿盒10分钟，每孔加终止液50ul，60分钟内于490nm波长读取OD值。
(三).结果判断1.计算临界值(cut off value，CV)临界值(CV)=2.1×(2个阴性对照OD值的平均值)2.结果判断阳性标本孔平均OD值＞CV阴性标本孔平均OD值＜CV×0.9可疑标本孔平均OD值在CV与CV×0.9之间，可疑的血清应重做。
(四).保存保存于2-8℃，有效期6个月。
(五)注意事项
1.本试剂盒不宜冷冻保存。
2.不同批号试剂不可混用，本试剂盒所用酶标羊抗人IgM工作浓度，不同批号有差异，详见该试剂瓶上工作浓度标号。
3.待检血清不宜反复冻融。
4.所有测得的OD值均应减去二个空白对照的OD值的平均值后再计算结果。
二、单纯疱疹病毒(HSV)IgM诊断试剂盒使用说明书本试剂盒HSV抗原包被酶标板，配以酶标记羊抗人IgM抗体，以间接ELISA法检测HSV抗体，供HSV活动性感染诊断用。
(一).试剂盒组成1.96孔包被反应板2块2.阳性对照 1支3.阴性对照 1支4.酶标试剂IgM 1支5.洗液(1∶10稀释)1瓶6.底物OPD片 2片7.底物缓冲液1瓶8.终止液1瓶9.血清稀释液1瓶10.血清吸附剂 1瓶(二).操作程序1.血清处理取待检血清25ul，加血清吸附剂25ul混合，再用血清稀释液补足至总体积125ul(血清最终稀释度为1∶5)，混匀后置37℃，30-40分钟(或4℃过夜)3000转/min离心10分钟，取上清液备用。
2.检测步骤(1)取上述上清液20ul(血清最终稀释度为1:80)混匀。
(2)取抗原板，每份血清加二孔，每孔加血清100ul，每块抗原板均设阳性、阴性及空白对照各二孔。每孔均加100ul，空白加稀释液。置37℃湿盒60分钟。甩去孔中液体，再用洗涤液洗3次，每次2分钟，每次均需拍干。
(3)加酶标羊抗人IgM，(按工作浓度标号用血清稀释液稀释)每孔50ul，置37℃湿盒90分钟，甩去孔中液体，洗涤4次，每次2分钟，每次均需拍干。
(4)取底物OPD一片，加10毫升底物缓冲液充分溶解(临时配用)每孔加底物液50ul，置22-25℃湿盒10分钟，每孔加终止液50ul，60分钟内于490nm波长读取OD值。
(三).结果判断1.计算临界值(cut off value，CV)临界值(CV)=2.1×(2个阴性对照OD值的平均值)2.结果判断
阳性标本孔平均OD值＞CV阴性标本孔平均OD值＜CV×0.9可疑标本孔平均OD值在CV与CV×0.9之间，可疑的血清应重做。
(四).保存保存于2-8℃，有效期6个月。
(五).注意事项1.本试剂盒不宜冷冻保存。
2.不同批号试剂不可混用，本试剂盒所用酶标羊抗人IgM工作浓度，不同批号有差异，详见该试剂瓶上工作浓度标号。
3.待检血清不宜反复冻融。
4.所有测得的OD值均应减去二个空白对照的OD值的平均值后再计算结果。
三、风疹病毒(RV)IgM诊断试剂盒使用说明书本试剂盒RV抗原包被酶标板，配以酶标记羊抗人IgM抗体，以间接ELISA法检测RV抗体，供RV活动性感染诊断用。
(一).试剂盒组成1.96孔包被反应板2块2.阳性对照 1支3.阴性对照 1支4.酶标试剂IgM 1支5.洗液(1∶10稀释)1瓶6.底物OPD片 2片7.底物缓冲液1瓶8.终止液1瓶9.血清稀释液1瓶10.血清吸附剂 1瓶(二).操作程序1.血清处理取待检血清25ul，加血清吸附剂25ul混合，再用血清稀释液补足至总体积125ul(血清最终稀释度为1∶5)，混匀后置37℃，30-40分钟(或4℃过夜)3000转/min离心10分钟，取上清液备用。
2.检测步骤(1)取上述上清液20ul(血清最终稀释度为1:80)混匀。
(2)取抗原板，每份血清加二孔，每孔加血清100ul，每块抗原板均设阳性、阴性及空白对照各二孔。每孔均加100ul，空白加稀释液。置37℃湿盒60分钟。甩去孔中液体，再用洗涤液洗3次，每次2分钟，每次均需拍干。
(3)加酶标羊抗人IgM，(按工作浓度标号用血清稀释液稀释)每孔50ul，置37℃湿盒90分钟，甩去孔中液体，洗涤4次，每次2分钟，每次均需拍干。
(4)取底物OPD一片，加10毫升底物缓冲液充分溶解(临时配用)每孔加底物液50ul，置22-25℃湿盒10分钟，每孔加终止液50ul，60分钟内于490nm波长读取OD值。
(三).结果判断1.计算临界值(cut offvalue，CV)临界值(CV)=2.1×(2个阴性对照OD值的平均值)2.结果判断阳性标本孔平均OD值＞CV阴性标本孔平均OD值＜CV×0.9可疑标本孔平均OD值在CV与CV×0.9之间，可疑的血清应重做。
(四).保存保存于2-8℃，有效期6个月。
(五).注意事项1.本试剂盒不宜冷冻保存。
2.不同批号试剂不可混用，本试剂盒所用酶标羊抗人IgM工作浓度，不同批号有差异，详见该试剂瓶上工作浓度标号。
3.待检血清不宜反复冻融。
4.所有测得的OD值均应减去二个空白对照的OD值的平均值后再计算结果。
四、弓形虫(TP)IgM诊断试剂盒使用说明书本试剂盒TP抗原包被酶标板，配以酶标记羊抗人IgM抗体，以间接ELISA法检测TP抗体，供TP活动性感染诊断用。
(一).试剂盒组成1.96孔包被反应板2块2.阳性对照 1支3.阴性对照 1支4.酶标试剂IgM 1支5.洗液(1:10稀释)1瓶6.底物OPD片 2片7.底物缓冲液1瓶8.终止液1瓶9.血清稀释液1瓶10.血清吸附剂 1瓶(二).操作程序1.血清处理取待检血清25ul，加血清吸附剂25ul混合，再用血清稀释液补足至总体积125ul(血清最终稀释度为1∶5)，混匀后置37℃，30-40分钟(或4℃过夜)3000转/min离心10分钟，取上清液备用。
2.检测步骤
(1)取上述上清液20ul(血清最终稀释度为1∶80)混匀。
(2)取抗原板，每份血清加二孔，每孔加血清100ul，每块抗原板均设阳性、阴性及空白对照各二孔。每孔均加100ul，空白加稀释液。置37℃湿盒60分钟。甩去孔中液体，再用洗涤液洗3次，每次2分钟，每次均需拍干。
(3)加酶标羊抗人IgM，(按工作浓度标号用血清稀释液稀释)每孔50ul，置37℃湿盒90分钟，甩去孔中液体，洗涤4次，每次2分钟，每次均需拍干。
(4)取底物OPD一片，加10毫升底物缓冲液充分溶解(临时配用)每孔加底物液50ul，置22-25℃湿盒10分钟，每孔加终止液50ul，60分钟内于490nm波长读取OD值。
(三).结果判断1.计算临界值(cut off value，CV)临界值(CV)=2.1×(2个阴性对照OD值的平均值)2.结果判断阳性标本孔平均OD值＞CV阴性标本孔平均OD值＜CV×0.9可疑标本孔平均OD值在CV与CV×0.9之间，可疑的血清应重做。
(四).保存保存于2-8℃，有效期6个月。
(五).注意事项1.本试剂盒不宜冷冻保存。
2.不同批号试剂不可混用，本试剂盒所用酶标羊抗人IgM工作浓度，不同批号有差异，详见该试剂瓶上工作浓度标号。
3.待检血清不宜反复冻融。
4.所有测得的OD值均应减去二个空白对照的OD值的平均值后再计算结果。
权利要求
1.四种病原体抗体检测试剂盒的制备，其特征在于选用巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、风疹病毒、弓形虫四种病原体各自的敏感细胞株，分别接种四种病原体的标准毒株，经细胞培养，获取抗原。
2.按照权利要求1所述的试剂盒的制备，其特征在于通过Western blot使用多克隆血清确定经细胞工程制备的抗原中含主要抗体中和决定簇的蛋白成分的分子量，选用凝胶分子筛Sephadex G-75填充过柱，并回收特定抗原蛋白作为抗原。
3.按照权利要求1所述的试剂盒的制备，其特征在于以1μg的抗原包被96孔ELISA反应板。
4.本发明所研制的试剂盒均为间接ELISA法病原体相应IgM抗体检测试剂盒，由分别包被病毒抗原的96孔硬质可分隔塑料板，酶标羊抗人IgM血清、血清吸附剂(10％SPA)、阳性和阴性对照血清、底物液(OPD片剂及其配制液)、洗涤液(PH7.2 PBS-吐温20液)和终止液等共同组成。
全文摘要
四种病毒抗体测试盒的制备方法,选用巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、风疹病毒、弓形虫四种病原体各自的敏感细胞株,分别接种四种病原体的标准毒株,经细胞培养,获取抗原。通过高速离心和Sephadex凝胶柱的分子筛作用进行抗原纯化。并将纯化抗原用标准的阳性血清滴定抗原的效价。以一定浓度的抗原包被96孔ELISA反应板,同配套的商品化的辣根过氧化物酶标羊抗人IgM以及其他一系列的相关显色试剂以及阴阳性标准对照,组装成TORCH ELISA抗体检测试剂盒。
文档编号G01N33/531GK1286403SQ0013042
公开日2001年3月7日 申请日期2000年9月26日 优先权日2000年9月26日
发明者王斌 申请人:青岛大学