生物机－电芯片及应用的制作方法

专利名称：生物机－电芯片及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物芯片及其应用，具体是关于制作带有悬臂梁的生物机—电芯片，在芯片上利用悬臂梁技术进行生化反应的结果检测；更明确的说，是关于在生物芯片中利用悬臂梁技术，对生物化学中亲和结合反应的结果进行快速的检测。
生物芯片这个名词出现已经有十几年了，但是在早期，生物芯片多指用于研究生物计算机而开发的技术，作为目前研究很热门的生物芯片技术，其研究最早始于80年代中期的欧洲，但其迅猛发展是在1991年美国硅谷的Affymax公司宣布开始生物芯片的研制以后。随着1991年Affymax公司的研究人员报道了利用光刻技术与光化学合成技术相结合制作出的检测多肽和寡聚核苷酸的微阵列(Microarray)芯片研究成果以及1992年从Affymax派生出来的世界上第一家专门生产生物芯片的公司Affymetrix宣告成立，近几年来有上百家的生物芯片公司成立，不但有很多现成的技术被应用于生物芯片领域，同时也开发出很多新的技术。但是，不管是哪种生物芯片，都离不开检测这一步骤。由于一般情况下在生物芯片上进行的生化反应所需的样品都比较少，所以，对检测设备的灵敏度相对要求就高。针对于不同的生物芯片以及分析对象的不同，各个公司和研究机构开发出了多种检测技术，如荧光检测、飞行时间质谱仪、光波导、二极管阵列检测、直接电量变化检测等。例如，美国Sequenom公司采用光敏联接技术，将探针通过光敏基团联接在芯片上。当杂交结束后，利用激光切割释放寡聚核苷酸并用飞行时间质谱仪进行检测。由于光学检测方法在生物、化学等领域被广泛采用，所以目前大多数的生物芯片系统都采用光学的方法来检测，特别是目前应用的最广泛的微阵列芯片基本上都是采用荧光来检测。光学检测有它的优点如检测灵敏度高，重复性好等，但是一般而言，光学系统都比较复杂，需要有相应的光源、驱动及一系列镜头与检测设备，且对环境要求比较苛刻。随着生物芯片技术的发展，生物芯片技术的用途也日渐广泛，研究人员也开始研发便携式的生物芯片系统，同时也希望生物芯片的检测系统能尽量简单。
本发明的目的在于提供一种能方便快速地检测反应结果的生物芯片，由该种生物芯片组成的生物芯片系统可以对多种生物样品进行检测并具有高效、廉价、检测结果可靠等特点。
本发明的又一目的在于提供一种方便快速地对生物样品进行检测的方法，该检测方法效率高，检测结果可靠。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下本发明提出了一种生物机—电芯片，该生物芯片上含有多个悬臂梁单元，悬臂梁上设置有能感应悬臂梁之形变的感应器件，该感应器件输出反映悬臂梁形变大小的信号。当在每个悬臂梁上进行生化反应时，反应的结果表现为悬臂梁的形变大小，该形变大小通过感应悬臂梁形变的器件转化为可测量的信号输出，通过检测这些信号可以得知在悬臂梁上发生生化反应的结果。
由于悬臂梁结构在微机电系统中已有应用，如制作微型加速度传感器、原子力显微镜的探针等等，所以对悬臂梁微量形变的检测技术是比较成熟的，该领域内的技术人员可以容易地设计并采用合适的检测仪器来测量悬臂梁微量形变。在实施中，悬臂梁单元的尺寸可以从1平方微米至1平方厘米。
在本发明之生物芯片的悬臂梁表面上可设置有用于固定生物分子或生物颗粒的功能层。
在这里所述的生物分子或生物颗粒可以是、但不仅仅限于分子(如cDNA、寡核苷酸、抗体、抗原、酶、肽、糖等等)、分子复合物(如核酸—蛋白质复合物、糖—蛋白质复合物、核酸—酯复合物等等)、病毒(如噬菌体、真核病毒等)、以及细胞、组织等等。
感应悬臂梁形变的器件可采用多种不同的器件，而根据该设置在悬臂梁上之感应器件的工作原理不同，所输出的信号类型也不同。如果器件可以感应悬臂梁形变后电阻值的改变，则可以输出电信号反映悬臂梁形变的大小；如果器件通过光学的方法反映悬臂梁的微小形变，则输出的信号可以是光信号。
而对于这种由感应器件直接输出的信号的检测，检测结果可靠，检测速度快，检测手段也比较简单，不仅简化了生物芯片在反应后的信号检测部件，降低了其成本，而且大大简化了整个生物芯片系统，提高了检测的效率，并适于系统的缩微化。
本发明中所述的感应器件可设置在悬臂梁的根部。例如，在悬臂梁的根部加工有能感应悬臂梁形变的器件，如压阻片等。当悬臂梁发生形变时，压阻片的电阻值发生变化，产生相应的电信号以供检测。
在本发明优选的实施例中，在所述的悬臂梁的根部可设置有用于误差补偿的器件，例如将器件集成在悬臂梁的根部；在本发明之生物芯片上可集成有用于温度补偿的器件。
在本发明的优选实施例中，所述的感应器件和用于误差补偿的器件均可采用压阻片，压阻片与一恒流源相连。
本发明又提出了一种利用上述之生物芯片对生物样品进行检测的方法，该检测方法包括以下步骤(1)将不同种的生物分子或生物颗粒固定在该生物芯片上不同的悬臂梁表面上；(2)取待检测生物样品，使之与生物芯片上悬臂梁表面的生物分子或生物颗粒发生生化反应；(3)反应结束后，对生物芯片做严格度可以控制的清洗；
(4)读取能感应悬臂梁形变的器件输出之信号，以确定生化反应的发生与否及其程度，从而鉴定出待测生物样品中所含有的组成成分及其数量。
本发明的这种检测方法通过读取能感应悬臂梁形变的器件输出之信号以确定检测结果，其检测结果可靠性高，检测速度快，检测手段也比较简单，提高了检测的效率，并大大简化了整个生物芯片系统及降低其成本。
以下结合附图对本发明优选实施例的详细描述，以进一步说明本发明的上述目的和优点。


图1为本发明所述的生物机—电芯片之实施例的结构示意图；图2为本发明所述的生物机—电芯片上单个悬臂梁之实施例的微观结构示意图；图3为本发明所述的生物机—电芯片之实施例工作原理示意图；图4为本发明之实施例中用于测量悬臂梁之形变的电路图。
图1为本发明所述的生物机—电芯片的结构示意图。这里展示的是通过微加工得到的一个硅基生物机—电芯片的微观结构示意图。图1(A)是硅基生物机—电芯片上单个悬臂梁单元的微观结构俯视图。图中1是悬臂梁，2是加工在悬臂梁根部的压阻片，用于检测悬臂梁的形变。图1(B)是硅基生物机—电芯片上相临两个测试单元的微观结构示意图，显示了悬臂梁上形变检测器的连线方式，3为焊盘，用于芯片与外部电路之间的连接。图1(C)是封装好的硅基生物机—电芯片的结构示意图。在这个特选实施例中，硅基生物机—电芯片上的悬臂梁厚度为20μm，前端平台的大小为140μm×140μm，在硅基生物机—电芯片悬臂梁上修饰功能层，该功能层是用于探针分子的固定化。
在本发明的实施例中，在本发明之生物芯片上固定生物分子或生物颗粒之前，可根据需固定之生物分子或生物颗粒的类别，在悬臂梁表面设置用于固定该生物分子或生物颗粒之相应的功能层。功能层有多种，例如，功能层可以是如下薄层(但不限于此)单分子层、膜层、胶层、多孔或无孔的材料层。功能层也可以是生长在硅基生物机—电芯片悬臂梁上的一层附属层(通过微加工方法得到)。另外，功能层也可以通过直接对硅基生物机—电芯片悬臂梁表面分子进行化学修饰而形成。理想状态下，除了探针分子外，功能层不与其它分子发生非特异性结合，并且与探针分子的特异结合是高效的。具体地说，功能层可以为亲水单分子层或疏水单分子层、亲水或疏水薄膜、亲水或疏水凝胶层、聚合物层、多孔或无孔材料和/或者这些材料的组合。还可以在这些功能层表面再修饰上可以和待固定的生物分子或是生物颗粒结合的功能团。单分子层膜是指单分子层(如Langmuir-Blodgett膜)。为固定核酸探针，可以使用在Southern blot和Northern blot所用的结合材料如硝化纤维或尼龙。蛋白和多肽可以通过各种物理或化学手段来结合(例如疏水)。例如，为了结合蛋白或多肽探针分子可以将特定的受体如抗体或外源凝集素加到功能层上。根据目标分子及在编码器上所要进行的反应和分析，可以将不同的分子加到功能层上。这些为固定探针分子而加到功能层上的分子称为功能团。功能团可以是(但不局限于)乙醛、二亚胺碳、琥珀酰亚胺酯、抗体、受体及外源凝集素等。这些功能团还包括通过对硅基生物机—电芯片悬臂梁表面进行化学修饰而形成的化学团或分子位点。探针是一种常用于生物芯片上的生物分子或生物颗粒，可固定在悬臂梁表面的功能层上。所作的化学修饰方法与所要固定探针相对应。
图2是单个悬臂梁单元的微观结构侧视图。在悬臂梁的根部，集成两组压阻片，每组有两个，一组是用于测量悬臂梁的形变量的压阻片4，另外一组是用于误差补偿的压阻片5；这四个压阻片均与一恒流源I相连；故在芯片使用前接通恒流源，测量压阻片的两端将有V0＝IR0的电压信号输出。当该硅基生物机—电芯片进行实验后，再次测量压阻片的两端将有V＝IR的电压信号输出，比较实验前和实验后压阻片两端电压信号V0和V之间的差别，如果ΔV＝V-V0为零，说明实验前后悬臂梁的形变没有发生变化，如果ΔV不为零，说明实验前后悬臂梁发生形变，也就意味着固定在悬臂梁表面的探针发生了亲和反应。这样通过直接的电信号检测可以定性地得到实验结果，进一步对悬臂梁的形变与悬臂梁上的生物探针以及探针所结合的生物分子的量之间的关系做细致的分析，也可以做到定量的测定实验结果。
使用本发明之生物机—电芯片时，将不同种的探针先固定在已加工好的的生物机—电芯片上的不同的悬臂梁表面上，一种探针固定在一个悬臂梁上。探针的种类可以是cDNA、寡核苷酸、抗体或抗原、受体、酶、多肽、寡糖、多糖以及细胞、组织等。这些探针可以与待检测样品中与之对应的生物分子进行亲和结合反应，反应结束后，发生亲和结合反应的悬臂梁由于其上所附着的生物分子增多，其形变将变大，这样，通过外部的检测系统可以检测到这种形变的方法，也就确定了生化反应的发生，从而鉴定出待检测样品中所含有的未知成分。另外，按照本发明优选实施例方案的生物机—电芯片上的悬臂梁单元，在其根部还加工有用于误差补偿和温度补偿的器件。
本发明所提供的实施例中所述的生物机—电芯片，其制作工艺可采用目前基本上已比较成熟的微加工技术。该领域内的技术人员可以容易地根据芯片的具体结构设计并采用合适的加工工艺来加工生物机—电芯片。
图3为本发明所述的生物机—电芯片工作原理示意图。生物机—电芯片可用于生化反应中亲和结合反应(如抗体-抗原结合、核酸杂交等)的检测。以免疫检测为例，制备用于免疫检测的生物机—电芯片应先在悬臂梁的平台上固化特定的抗体6，此时，悬臂梁有一形变Δδ1(如图3(A)所示)，对应压阻片的电阻变化为ΔR1，在外加恒定电流I的情况下，可以检测到压阻片两端有电压信号V1＝I×(R0+ΔR1)＝V0+ΔV1；当进行免疫检测时，若所加入的未知生物样品中的含有与平台上抗体可以特定结合的抗原7，则会产生抗体与抗原的特定结合，经过严格度清洗后，去除样品中其他的物质，有发生抗体抗原亲和结合反应的悬臂梁产生的形变为Δδ＝Δδ1+Δδ2(如图3(B)所示，Δδ2代表亲合上的抗体所导致的形变量)，对应压阻片的电阻变化为ΔR＝ΔR1+ΔR2，通以恒定电流I，检测压阻片两端的电压V＝I×(R0+ΔR)＝V0+ΔV1+ΔV2；与反应前做比较有ΔV＝ΔV2的差别，由此可以判定未知生物样品中有与悬臂梁上固体的抗体相对应的特定的抗原存在。由于悬臂梁的尺寸很小，所在在一块芯片上可以加工出多个悬臂梁，形成阵列，每个悬臂梁上放置不同的抗体，这样在一次实验中可以检测样品的多个指标，达到并行处理的目的。
对于检测的灵敏度问题，可有多种方法提高其灵敏度。
方法一在制备待测生物样品时，可将待测样品与基本上不影响其和生物分子或生物颗粒亲和结合反应程度的珠体结合，从而可通过珠体的重量增大悬臂梁的形变。
在实施例中，在制备样品时，可以通过特定的结合方法(化学反应或非特异性亲和结合)让未知生物样品中所含有的抗原与不影响抗体—抗原反应发生的小珠体8结合，这样，在发生抗体抗原亲和结合并经过清洗后，该小珠体仍然留在悬臂梁上，它将引入Δδ3的形变量，使得反应前后电压信号的差别增大为ΔV＝ΔV2+ΔV3(见图3(C))；进一步，对生物样品检测时，在该生物芯片的适当位置可放置一个可与珠体发生相互作用的珠体作用器件，以增大悬臂梁的形变程度。该珠体作用器件通过可以对珠体施加电场、磁场等类型的作用力以增大悬臂梁的形变程度。
例如，若小珠体为磁性珠体9，则在检测时可以在芯片下方放置一磁铁，这样将珠体将受到磁铁的吸引，使得悬臂梁的形变增大，即磁铁的存在将引入Δδ4的形变量，反应前后电压信号的差别增大为ΔV＝ΔV2+ΔV3+ΔV4；更加便于检测(见图3(D))。
方法二利用这种珠体和珠体作用器件，本发明可提出另一种生物样品检测方法以提高检测灵敏度，该方法包括以下步骤(1)将该生物芯片竖起来，使芯片的悬臂梁竖置而无形变；(2)在制备待测生物样品时，将待测生物样品与基本上不影响其与生物分子或生物颗粒亲和结合反应程度的珠体结合；(3)取待检测生物样品，使之与生物芯片上悬臂梁表面的生物分子或生物颗粒发生生化反应；(4)生化反应完成后，对生物芯片做严格度可以控制的清洗；(5)采用可与珠体发生相互作用的珠体作用器件从侧面靠近该竖置的悬臂梁，读取能感应悬臂梁形变的器件输出之信号，以确定生化反应的的发生与否及其程度，从而鉴定出待测生物样品中所含有的组成成分及其数量。
在实施例中，将生物机—电芯片竖起来，即相应的芯片上的悬臂梁竖着放(如图3(E)所示)，此时悬臂梁无形变存在，同时，利用补偿压阻片可以使压阻片的输出电压为0；未知生物样品的制备如同方法一，让抗体与磁性珠体9相连，反应完成后让磁铁从侧面靠近芯片，若悬臂梁上有亲和结合反应产生，则在磁力的作用下，悬臂梁将有形变产生，压阻片有电压输出(如图3(F)所示)，若无亲和结合反应产生，悬臂梁将没有任何形变产生，压阻片的输出电压仍为0；采用这种方法将会避免在悬臂梁上存在其它非特异性吸附带来的影响。
在上述两种检测方法的具体实施中，有以下方案1、所述珠体为磁性珠体，所述的珠体作用器件为磁铁。对生物样品检测时，可以在该生物芯片的适当位置放置一磁铁，利用磁铁与磁珠之间的相互作用，进一步增大悬臂梁的形变程度。
2、所述珠体为对介电电泳信号具有响应的珠体，例如碳珠体(carbon bead)，所述的珠体作用器件为介电电泳器件。对生物样品检测时，可以在该生物芯片的适当位置放置一介电电泳器件，通入介电电泳信号，利用珠体对介电电泳信号的响应，进一步增大悬臂梁的形变程度。
3、所述珠体为带有电荷的珠体，所述的珠体作用器件为带有适当种类和数量的电荷的电子器件。对生物样品检测时，可以在该生物芯片的适当位置放置一带有适当种类和数量的电荷的电子器件，利用它与珠体之间的相互作用，进一步增大悬臂梁的形变程度。
另外，在生物机—电芯片的悬臂梁上还可以集成上温度补偿电阻，这样可以校正温度所带来的误差，使检测结果更加准确。
关于压阻片的电阻值测量及误差补偿方法的说明如下压阻片随悬臂梁变形而发生电阻变化ΔR，ΔR反映了悬臂梁的变形，这个变化量可以用四臂电桥来(惠斯顿电桥)测量。如图4所示，采用压阻片作为感应悬臂梁形变的感应器件，图中R1、R2为压阻片，R3、R4为标准电阻。对角节点A、C上接电压为E1的直流电源，另一对角节点B、D为电桥输出端。
根据欧姆定律可以得到ΔUBD＝E1(ΔR1-ΔR2)/4R其中ΔUBD为B、D两点之间的电压差，E1为直流电源的电压，ΔR1和ΔR2为压阻片的电阻变化量，R为压阻片的标称电阻值。
根据压阻片的性质，ΔR1、ΔR2正比于实际的应变ε1和ε2。
ΔR1/R＝kε1
ΔR2/R＝kε2其中k为压阻片的灵敏系数，R为压阻片的标称电阻值，ΔR1和ΔR2为压阻片的电阻变化量，ε1和ε2为测量点的应变。
于是得到ΔUBD＝kE1(ε1-ε2)/4R实际压阻片R1和R2分别贴在悬臂梁的根部上面和下面，当悬臂梁产生形变时，这两处的应变大小相等，但一个受拉一个受压，因此符号相反。
所以得到ΔUBD＝kE1ε/2R关于温度补偿方法的说明如下实测时压阻片粘贴在悬臂梁上，若温度发生变化，因为压阻片的线膨胀系数与悬臂梁的并不相同，且压阻片的电阻也随温度变化而改变，所以测得的应变将包含温度变化的影响，不能真实反映悬臂梁因受生化反应导致的形变。消除温度变化的影响可以采用了下面两种温度补偿方法。
1、双悬臂梁方法采用两个悬臂梁，一个为测量悬臂梁，一个为温度补偿悬臂梁。在测量悬臂梁上固定有探针分子，而温度补偿悬臂梁上不固定探针分子。
压阻片R1和R2分别贴在两个悬臂梁上，可以消除温度变化产生的误差。
2、单悬臂梁方法采用一个悬臂梁，并且固定有探针分子。压阻片R1和R2都贴在悬臂梁的根部附近上，但是方向相互垂直。两个电阻应变片产生的应变分别为
ε1＝ε1P+εTε2＝ε2P+εT＝-με1P+εT其中ε1P是因载荷引起的应变，εT是因温度引起的应变。
根据前面的公式可以得到ΔUBD＝kE1(1+μ)ε/4R这样也同样消除了温度的影响。
本发明中所述的生物机—电芯片的材料可以是各种适于加工出悬臂梁结构的刚性或弹性材料如硅，塑料等。所用的微加工工艺可以是光刻、激光刻蚀、铸模、硅橡胶铸造、模压、铸造等。
本发明中所述的生物机—电芯片避开了使用光学等其它复杂的检测手段，可以直接采用电检测，大大简化了整个生物芯片系统，适于系统的缩微化。
以上结合优选实施例对根据本发明的生物机—电芯片及其应用进行了描述。本领域内的技术人员可以理解，上文中所提到的参数如数量、尺寸等均是示例性的而不应视为对本发明的限制。本发明的范围有后附的权利要求书限定。
权利要求
1.一种生物芯片，其特征在于该生物芯片上含有多个悬臂梁单元，悬臂梁上设置有能感应悬臂梁之形变的感应器件，该感应器件输出反映悬臂梁形变大小的信号。
2.根据权利要求1所述的生物芯片，其特征在于在悬臂梁表面上设置有用于固定生物分子或生物颗粒的功能层。
3.根据权利要求1所述的生物芯片，其特征在于所述的感应器件设置在悬臂梁的根部。
4.根据权利要求1所述的生物芯片，其特征在于在悬臂梁的根部集成有用于误差补偿的器件。
5.根据权利要求4所述的生物芯片，其特征在于在该芯片上集成有用于温度补偿的器件。
6.根据权利要求1或4所述的生物芯片，其特征在于所述的感应器件和用于误差补偿的器件均采用压阻片，压阻片与一恒流源相连。
7.一种利用权利要求1所述之生物芯片对生物样品进行检测的方法，其特征在于包括以下步骤(1)将不同种的生物分子或生物颗粒固定在该生物芯片上不同的悬臂梁表面上；(2)取待检测生物样品，使之与生物芯片上悬臂梁表面的生物分子或生物颗粒发生生化反应；(3)反应结束后，对生物芯片做严格度可以控制的清洗；(4)读取能感应悬臂梁形变的器件输出之信号，以确定生化反应的发生与否及其程度，从而鉴定出待测生物样品中所含有的组成成分及其数量。
8.根据权利要求7所述的生物样品检测方法，其特征在于在该生物芯片上固定生物分子或生物颗粒之前，根据需固定之生物分子或生物颗粒的类别，在悬臂梁表面用于固定该生物分子或生物颗粒之相应的功能层。
9.根据权利要求7所述的生物样品检测方法，其特征在于在制备待测生物样品时，将待测样品与基本上不影响其和生物分子或生物颗粒亲和结合反应程度的珠体结合。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于对生物样品检测时，在该生物芯片的适当位置放置一个可与珠体发生相互作用的珠体作用器件，以增大悬臂梁的形变程度。
11.根据权利要求7所述的生物样品检测方法，其特征在于包括以下步骤(1)将该生物芯片竖起来，使芯片的悬臂梁竖置而无形变；(2)在制备待测生物样品时，将待测生物样品与基本上不影响其与生物分子或生物颗粒亲和结合反应程度的珠体结合；(3)取待检测生物样品，使之与生物芯片上悬臂梁表面的生物分子或生物颗粒发生生化反应；(4)生化反应完成后，对生物芯片做严格度可以控制的清洗；(5)采用可与珠体发生相互作用的珠体作用器件从侧面靠近该竖置的悬臂梁，读取能感应悬臂梁形变的器件输出之信号，以确定生化反应的的发生与否及其程度，从而鉴定出待测生物样品中所含有的组成成分及其数量。
12.根据权利要求10或11所述的检测方法，其特征在于所述珠体为磁性珠体，所述的珠体作用器件为磁铁。
13.根据权利要求10或11所述的检测方法，其特征在于所述珠体为对介电电泳信号具有响应的珠体，所述的珠体作用器件为介电电泳器件。
14.根据权利要求10或11所述的检测方法，其特征在于所述珠体为带有电荷的珠体，所述的珠体作用器件为带有适当种类和数量的电荷的电子器件。
全文摘要
一种生物芯片及其应用,该生物芯片上含有多个悬臂梁单元,悬臂梁上设置有能感应悬臂梁之形变的感应器件,该感应器件输出反映悬臂梁形变大小的信号。本发明还提供一种对生物样品进行检测的方法,在该方法中,使待测生物样品与固定在悬臂梁表面的生物分子或生物颗粒发生生化反应,反应及清洗后,读取能感应悬臂梁形变的器件输出之信号,以鉴定出生物样品中所含有组分及数量。本发明可对生物样品进行高效率检测,成本低,检测结果可靠。
文档编号G01N27/04GK1372135SQ0111111
公开日2002年10月2日 申请日期2001年2月28日 优先权日2001年2月28日
发明者许俊泉, 赖亚明, 朱小山, 刘理天 申请人:清华大学