专利名称：激光诱导荧光双重标记测定装置的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种荧光标记检测微量生物物质的测定装置，尤其是一种激光诱导荧光双重标记测定装置。
荧光标记是检测微量生物物质的常用方法。理想的荧光标记物(即荧光探针)应该是1、具有较高的荧光发光效率。可以获得较低的检测下限。2、在不同的pH下稳定。可适应不同反应条件下的分析测定。3、标记容易且不影响被标记物的生物活性。可获得较高的标记量。如果标记后损失或破坏生物分子的特异反应位点，势必影响灵敏度和选择性。4、有较好的水溶性。因为绝大多数生物反应是在水溶液中进行。5、在其它物质存在下不易产生荧光淬灭效应。淬灭会大大的降低检测灵敏度。6、产生荧光的激发光波长较长。可避免使用昂贵的紫外激光器。7、有较长的斯托克位移。在较长的斯托克位移情况下，反射、散射的激发光对荧光测量的影响更容易克服。从而提高信/噪比。
目前常用的荧光标记物均为荧光染料即小分子有机化合物。虽然大多数荧光标记物具有较高的灵敏度，但都不满足上述中的第4、5、6、7项的要求。特别是第7项要求。通常的荧光标记物的斯托克位移平均在28nm左右。这样就对仪器提出较高的要求，既在激光入射光光路和荧光测量光路设置高质量的窄带干涉滤光片，或在激发光和荧光光路设置高质量的分光系统。这样不但使仪器复杂化，造价昂贵。而且由于滤光片和分光系统大大的削弱了激发光和荧光的强度，使灵敏度大幅度的降低。如欲达到理想的灵敏度就必须要么提高光源的强度，要么提高荧光检测的灵敏度。同样会使仪器复杂，价格昂贵。因此寻找合适的荧光标记物是激光诱导荧光或荧光法测定微量生物物质的关键。
藻胆蛋白源于海洋生物红藻(Rhodophyta)，蓝绿藻(Cyanophyta)和隐藻(Cryptophyta)，其生理作用是捕集光能并迅速传递给叶绿素使生物产生光合作用。藻胆蛋白包括藻红蛋白，藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白。藻胆蛋白分子量在17-18KD，在其分子结构中含有两条多肽链α和β，每个多肽链均含一个或多个共价连接的发色基团。发色基团是由开链线性延展的四吡咯化合物组成并通过硫醚键连接在载体蛋白的半胱氨酸残基上。藻胆蛋白以(αβ)3三聚体和(αβ)6六聚体立体结构存在。三聚体呈圆盘状，厚度为30直径为120。藻胆蛋白发色基团的能量水平具有不平衡性，因此所有的发色团都是吸收激发光，所以荧光发生在最大激发波长处。在不同的发色团中吸收光能并把能量转移给其他发色团的是供体，而既能吸收激发光能又能发出荧光的是受体。只有受体可以稳定的发出荧光。藻蓝蛋白标记生物分子是属于大分子标记大分子，其标记的机理是利用标记物和被标记物表面所具有的不同的化学官能团之间的化学键合而标记。标记的数量是当被标记分子的分子量和分子体积尺寸与藻蓝蛋白在相同数量级时，每个生物分子标记藻蓝蛋白的数量为N时，此时的N不会大于3。在用金标时，其标记的机理是生物分子表面存在大量的属于化学上软硷的含硫的有机基团，如巯基，硫氢基，二硫键等能与化学上属于软酸的金属如金等强烈结合。在标记数量上，由于金是处于纳米颗粒状态，无论其质量还是其体积都远远小于被标记生物分子，此时的标记数量可能会很多，通常称为多标记.，N值可以在1到数百。
现有的激光诱导荧光检测仪均是采用常规光学的光路构成的即激光光源发出的激光束，经会聚后形成平行光束，在经反射镜反射和聚光镜会聚后照射到孔板被检液表面，产生的荧光经会聚后再经过半反半透镜和准直，会聚等透镜后射入光电倍增管的光阴极上。整个光路系统复杂，并且光损失较大，而且成本较高，操控不方便。
本实用新型的目的在于提供一种激光诱导荧光双重标记测定装置，以多种超长斯托克位移荧光标记物和普适性纳米金属标记物对生物物质进行双重标记，大幅度提高激光诱导荧光方法的检测灵敏度和分辨能力，它能够检测上述两束不同的荧光，并且省去了大部分会聚镜，准直镜和半反半透镜，简化了光路，减少了复杂光路带来的光损失，整体造价较低。
本实用新型的目的是这样实现的一种激光诱导荧光双重标记测定装置，它包括激光诱导荧光检测仪器的激光光源、光导纤维束构成的光传输光路、被测物体放置的孔板以及相应的控制电路。采用固体冷光源，该冷光源包括不同波长的半导体激光器和不同波长的高亮度发光二极管。
其中所述的光导纤维束为Y型，Y型上部分支的一侧为激发光源的导入端，接激光光源，另一分支侧为测量荧光的导出端，接光电倍增管；Y型下部的汇集端接至孔板位置。Y型上部两侧分支部近汇集端的下端光导纤维束为随机分布。Y型光导纤维束为60根以上。例如，光导纤维束的集合段是用于对样品导入激发光和导出荧光。该光导纤维束有两个分支段和一个集合段，每一个分支段由200根光导纤维构成，两个分支段汇合成一个集合段，该段内的光导纤维是有两个分支段内的光导纤维经无规分布而成。
所述的Y型下部的汇集端光导纤维束末尾设有短焦距聚光镜，短焦距聚光镜对应至孔板。
所述的Y型上部两侧分支部光路入口和光路出口处分别设有带通干涉滤光片，滤光片前部设有半透—半反透镜。入光光导纤维束和冷光源之间有一个半透—半反透镜，其作用是将两束波长不同的光和为一束光，一同进入导入光导纤维分支段；荧光导出光导纤维段后，设置一个半透—半反透镜，其作用是将不同波长的荧光分为两束。带通干涉滤光片可为一片以上。例如，作为固体冷光源的光路入口，该入口前有一个(或两个)带通干涉滤光片，其带通范围为光源中心波长±5纳米，另外一个分支段是荧光出口，在出口处也有一个带通干涉滤光片，其带通范围为荧光中心波长±5纳米。
荧光接收端之后有两套微弱光测量装置，因此测量荧光的导出端所接光电倍增管为高灵敏度，高稳定度和低暗电流型光电倍增管，并且对应两束荧光为两套光电倍增管。
所述的控制电路包括一中央控制器CPU，CPU的输入端接经过放大的光电倍增管的输出，CPU的输出接孔板行动控制机构的输入端以及激光光源的触发控制端。
所述的孔板行动控制机构由步进电机控制能够沿X、Y轴位移的移动装置构成。
根据上述技术方案分析可知，本实用新型具有如下优点首先，依据藻蓝蛋白和纳米金两种标记物的不同标记特征和标记性质，可知(1)、对于同一种生物分子用两种标记物标记后，在同一种激发光激励下会产生不同波长的荧光，通过不同滤光片可以检测到不同的信号。这样对于被检测物的确认是有帮助的，即标记功能、性质互补。(2)、在不同的生物分子用同一种标记物标记后产生类似的信号即产生干扰的情况下，如果采用两种标记后，就会给出分辨两种生物分子的可能，还能够排除干扰。
另外，本实用新型的装置不仅能够进行双重标记物荧光的测定，而且控制装置结构简单、合理，成本较低。
以下结合附图和具体实施方案对本实用新型做进一步的详细说明。
图1为本实用新型整体结构和光路原理图；图2为本实用新型的光导纤维束汇集端与孔板设置的结构示意图；图3为本实用新型光导纤维束上部分之端结构示意图；图4为本实用新型数模转换和放大电路原理图；图5为本实用新型CPU部分电路原理图；图6为本实用新型执行机构控制部分电路原理图。
本实用新型中所采用的超长斯托克位移荧光标记物为以藻胆蛋白为代表的系列荧光标记物。其激发波长和荧光波长之差可达50-60nm。比目前通用的荧光标记物长达30-40nm，对于提高检测的信号/噪声比有极大的好处。以纳米金为代表金属纳米颗粒是一种普适性荧光标记物。两种荧光标记物对同一种目标物的不同结合位点进行双标记。然后在同一激光或不同波长激光照射下使标记后的目标物产生荧光，在此基础上进行定性和定量测定。
藻蓝蛋白能发出强烈的荧光，最大激发波长在590nm，但在很宽的区域有较强的激发。荧光的最大发射波长在640nm处，其斯托克位移约为50nm以上。其荧光强度是荧光素的30倍，而且具有如下多种优点(1)、在较宽的光谱范围内有较高的吸收系数。(2)、在较宽的pH范围内有较高的荧光产率。(3)、产生的荧光不因其他生物分子的存在而消失即不易发生荧光淬灭现象。(4)、在水中有较高的溶解度。(5)、其水溶液和干物质均有相当好的稳定性。(6)、可在较长的激发波下(如532nm的绿色半导体激光器)产生较强的荧光。(7)、由于具有较宽的斯托克位移，在专用激光诱导荧光仪的设计中可以采用宽带滤光片。在满足信噪比的前提下，既可以减少光的衰减又可以降低造价。两种标记物是标记在生物分子的不同基团上(即不同的位点)，在绝大多数情况下是互不干扰的。因此双标记是可行的。
选择纳米金的原因有两点一、可以用较简单的方法制备相当稳定的纳米金胶体溶液，不但使用过程稳定而且可以长期储存。
二、用不同的制备方法和制备条件可以产生具有不同发光性质的纳米金。即金溶胶的光散射性与溶胶颗粒的大小密切相关，一旦颗粒大小发生变化，光散射也随之发生变异，产生肉眼可见的显著的颜色变化。金溶胶颗粒的直径和制备时加入的柠檬酸三钠量是密切相关的，保持其他条件恒定，仅改变加入的柠檬酸三钠量，可制得不同颜色的金溶胶，也就是不同粒径的金溶胶，见附表。
附表 100ml氯金酸中柠檬酸三钠的加入量对金溶胶粒径的影响1％柠檬酸三钠ml 0.30 0.45 0.70 1.00 1.50 2.00金溶胶颜色 蓝灰 紫灰 紫红 红 橙红 橙吸收峰(nm) 220240535525522 518径粒(nm)14797.5 71.5 41 24.5 15具体测定时，制备双标抗体①将由藻蓝蛋白标记好的抗体，按上述胶体金包被的程序再次标记纳米金。
②双标抗体用于测定时，除测定由藻蓝蛋白产生的荧光外，还可以测定纳米金产生的反射和散射光。由于纳米尺寸大小决定了他吸收某种特定波长的光，而反射其它波长的光。因此制备好的金标抗体是有固定颜色的，如10纳米以上的胶体金是呈暗红色的。
根据反射光的强度，使用本实用新型定量测定抗体浓度。
参见图1、2、3，其结构和功能说明如下被测定物体的载体孔板1是可以临床检验通用的孔板中的一种，即不透光的那一种。通常是用塑料制造的。如聚苯乙烯，聚碳酸脂，聚丙烯等。例如孔板96-microplate，是标准临床免疫分析用的不透光型96孔板。根据不同项目的分析需要在固相免疫分析时包被抗原或抗体，在均相免疫分析中可不包被。该板被放在一个由计算机程序控制的两台步进电机驱动的可以X和Y方向定位移动的机械平台上，该平台有专用96孔板卡具即孔板锁紧装置，保证在测定过程中孔板不位移。在孔板放入和取出时孔板托架由计算机控制通过密封门伸出机壳外部并同时释放孔板锁紧装置。Fiber是由多条光导纤维构成的Y型导光束2。Y型的左臂是作为激发光源的激光导入端21。Y型的右臂是测量荧光的导出端22。Y型的下端同时是激发光的导出和荧光的导入端23。左臂和右臂的光导纤维在下端是随机排布的，以保证入射光和导出光的君仪性。由于从造价和工艺上考虑采用了多条单膜光纤组合而成的光纤束，因此物体的象是由每条光纤所产生的多个象集合而成的。只有在光纤数量达到一定后才会避免每个个体象产生的强度和位置的离散。一般根数要大于60。
在导光束和孔板之间设置一个短焦距的光学聚光镜L3，其作用是首先将由多条光导纤维导出的具有一定发散角度的激光做一定的会聚增加激发光的利用率，其次是将高度发散的荧光会聚导入光导纤维端面提高荧光的收集率。透镜L3和与之相配的光导纤维一同安装固定在箱体的中间隔板上。固定组件同时固定透镜L3和固定纤维，为调整焦距，光导纤维可以在固定组件上，上下移动达到最佳会聚位置。
在右臂的出口处设置一个截止波长为620nm的前截止滤光片3，防止自然光和反射的激光中与荧光波长相近的光进入光电倍增管。在左臂的入口处设置一个截止波长为540nm的后截止滤光片(图中未示出)，防止自然光和激光中与荧光波长相近的光进入光导纤维干扰荧光测定。前后两个滤光片大大的降低和避免了反射激光和杂散光的影响和干扰。Laser是半导体激光器，功率为5毫瓦，配有专用电源。在激光器和光导纤维之间除设置滤光片外还有一个聚光镜，其作用是将发散的激光束全部会聚在光导纤维左臂的导入面内，提高激发光的利用率。同样在右臂也设置会聚镜提高荧光利用率。因此，Y型上部两侧分支部光路入口和光路出口处分别设有带通干涉滤光片，滤光片前部设有半透—半反透镜。入光光导纤维束和冷光源之间有一个半透—半反透镜L1。激光发射器出光端面处于透镜L1的焦点以外，使全部的激光会聚在入光光导纤维的端面上。同样，荧光导出光导纤维段后，设置一个半透—半反透镜L2，其作用是将不同波长的荧光分为两束，荧光导出光导纤维的端面应设置与L2的焦点以外，使全部荧光照射在光电倍增管的光阴极面上。
PMT为高灵敏度，低噪声，低暗电流的光电倍增管。PV为供给光电倍增管的负高压电源，最高输出为-100伏。A为光电倍增管输出电流的放大-整形-二次放大-输出单元电路，其作用是将光电倍增管输出的极微弱电流放大，去噪声，整形变换为与原始电流成比例的电压，该电压范围与A/D变换电路的输入范围相匹配。具体电路如图4。A/D是对整形输出的电压进行模/数变换，然后由CPU传输到CPU板上的内存空间。具体电路如图5。CPU板是由80C196微处理器，128K程序存储器，128K数据存储器，微处理器外围电路(如晶体振荡器，复位电路等)和大规模逻辑集成电路FPGA等组成。是执行仪器的控制，数据采集，整理传输等功能。RS232是主机的串行接口，其作用是承担主机和外部PC机之间的指令，参数和数据的相互传输。P是整机的主电源。
CPU板内存储器驻留的汇编程序，主要的功能是控制仪器的全部机械操作、运动，具体控制电路原理图如图6。执行数据采集和初期整理并送入主机串行口。回送仪器状态和接收并执行PC机的指令。CPU板执行仪器的自检和诊断功能。CPU还控制1、显示仪器操作界面，在界面下进行方法选择，条件和参数设定。2、开始和终止或暂停实验。在实验中实时显示实验进程和结果。3、对实验结果进行处理分析并显示实验最终报告。4、存储并打印报告。
权利要求1.一种激光诱导荧光双重标记测定装置，它包括激光诱导荧光检测仪器的激光光源、光导纤维束构成的光传输光路、被测物体放置的孔板以及相应的控制电路，其特征在于所述的光导纤维束为Y型，Y型上部分支的一侧为激发光源的导入端，接激光光源，另一分支侧为测量荧光的导出端，接光电倍增管；Y型下部的汇集端接至孔板位置。
2.根据权利要求1所述的激光诱导荧光双重标记测定装置，其特征在于所述的Y型上部两侧分支部近汇集端的下端光导纤维束为随机分布。
3.根据权利要求1或2所述的激光诱导荧光双重标记测定装置，其特征在于所述的Y型光导纤维束为60根以上。
4.根据权利要求1所述的激光诱导荧光双重标记测定装置，其特征在于所述的Y型下部的汇集端光导纤维束末尾设有短焦距聚光镜，短焦距聚光镜对应至孔板。
5.根据权利要求1所述的激光诱导荧光双重标记测定装置，其特征在于所述的Y型上部两侧分支部光路入口和光路出口处分别设有带通干涉滤光片，滤光片前部设有半透—半反透镜。
6.根据权利要求1所述的激光诱导荧光双重标记测定装置，其特征在于所述的带通干涉滤光片可为一片以上。
7.根据权利要求1所述的激光诱导荧光双重标记测定装置，其特征在于所述的测量荧光的导出端所接光电倍增管为一套以上。
8.根据权利要求1所述的激光诱导荧光双重标记测定装置，其特征在于所述的控制电路包括一中央控制器CPU，CPU的输入端接经过放大的光电倍增管的输出，CPU的输出接孔板行动控制机构的输入端以及激光光源的触发控制端。
专利摘要一种激光诱导荧光双重标记测定装置,它包括激光诱导荧光检测仪器的激光光源、光导纤维束构成的光传输光路、被测物体放置的孔板以及相应的控制电路,其中光导纤维束为Y型,Y型上部分支的一侧为激发光源的导入端,接激光光源,另一分支侧为测量荧光的导出端,接光电倍增管;Y型下部的汇集端接至孔板位置。本实用新型实现了双重标记采用同一类但不同种标记物进行标记,也可以是采用不同种类标记物进行标记,标记功能、性质互补,而且能够排除干扰。
文档编号G01N21/64GK2496015SQ0121990
公开日2002年6月19日 申请日期2001年4月23日 优先权日2001年4月23日
发明者刘兆乾, 朱果逸, 吴志音 申请人:吴志音, 朱果逸