专利名称：纳米硅膜生物传感器的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及及一种可对试样液中的被检测对象免标记地进行快速而高灵敏定量分析的纳米硅膜生物传感器。
背景技术：
传统的免疫检测方法即免疫标记技术是指用荧光素、酶、放射性同位素或电子致密物质等标记抗原或抗体进行的抗原抗体反应。下面以免疫标记技术中广泛应用的酶联免疫吸附试验(enzyme linkedimmunosorbem assay)，简称酶标法(ELISA)为例来说明免疫标记技术的原理。根据测定对象的不同，酶标法可采用不同的模式，主要有以下几种(一)双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，但仅适用于两价或两价以上抗原的检测，而不适用于小分子抗原或半抗原物质的测定。其测定原理是将特异性抗体包被于固相载体上，形成固相抗体；加入含待测抗原的样品，使之与固相抗体结合再加入酶标记的另一特异性抗体，使酶标抗体与固相免疫复合物中的抗原结合；然后加入底物显色。反应颜色的深浅与标本中的待测抗原的量成正比。
(二)间接法主要用于检测抗体，其原理是将特异性抗原包被固相载体，加入含待测抗体的样品，使之与固相抗原结合，加入酶标记抗体，反应后再加入底物显色。此法可用多种抗体测定，如检测各种感染性疾病的抗体。
(三)竞争抑制法竞争抑制法可用于检测大分子抗原和小分子抗原，也可以用于检测抗体，显色的深浅与标本中待测抗原或抗体量成反比。以测定抗原为例，待测样品中的抗原与酶标抗原竞争与固相抗体结合，待测抗原含量越多，能于固相抗体结合的酶标抗原就越少，则显色就越浅。
(四)IgM抗体捕捉法血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的鉴定，捕捉法主要用于检测各类IgM早期抗体。先用抗人IgM(链)抗体包被于载体，使血清中所有IgM(包括特异性与非特异性IgM)均固定在固相上，经洗涤除去IgG后，再测定特异性IgM。
以上为免疫标记技术中酶标法的各种原理。无论免疫标记技术采用那一种方法，均需要对生物分子进行标记，操作繁琐，反应时间长，涉及多种试剂。
目前，国际上公认0.1～100nm为纳米尺度空间。为研究工作方便，把尺寸0.1～1μm视为亚微米体系，把尺寸1～100nm划分为纳米体系，把尺寸＜1nm划分为团簇。纳米尺度空间所涉及的物质层次，是既非宏观又非微观的相对独立的中间领域，被称之为介观(mesoscopy)研究领域。这样的领域既非典型的微观系统亦非典型的宏观系统，并表现出表面效应、体积效应、量子效应及宏观量子隧道效应等四种被称之为纳米效应的特殊效应。纳米材料由于其结构的特殊性，表现出许多不同于传统材料的物理、化学性能。纳米材料生物兼容性好、低细胞粘附性、低毒性、传导性能高等都接近生物组织的要求，具有临床应用价值。纳米超细颗粒表面覆盖一层5-10nm厚的聚合物，可固定大量蛋白质或酶。
迄今为止，作为对试样中的被测定组分进行定量的方式，已有各种各样的纳米生物传感器提出。其中一例是哈佛大学Charles Lieber化学实验室2001年研制的纳米生物传感器即一种将所制备的结合了待测试样的纳米硅丝组装到电极表面通过测量电极间电导变化来分析被测试样的纳米生物传感器。
在该纳米生物传感器中，硅丝的制备如下首先，将聚L-赖氨酸加至二氧化硅基底上，形成带正电荷的聚L-赖氨酸层。随后加入纳米金颗粒，由于纳米金颗粒带负电荷，会吸附到正电荷的聚L-赖氨酸层上，形成纳米金层。然后，将已形成纳米金层的二氧化硅基底放入氧等离子区(oxygen plasma)中处理5分钟。随后放入石英反应器中下游的末端，在含10％硅烷的氦气中，生长出纳米硅丝。
为了结合生物大分子，对硅丝进行修饰，使硅丝表面覆盖氨基硅烷层。
由于固定在硅丝表面的氨基硅烷将氨基暴露于表面，于是，硅丝表面形成两种末端基团-NH2和≡SiOH。当溶液pH＜7，即酸性时，溶液中的氢离子与氨基结合，形成-NH3+，于是在硅丝表面形成一层正电荷，吸引硅丝中的负电荷(电子)，并排斥硅丝中的正电荷(空穴)，导致硅丝两端的电导下降。同理，在溶液pH＞7，即溶液呈碱性时，溶液中大量的氢氧根离子与≡SiOH结合，生成≡SiO-，使硅丝表面形成一层负电荷，吸引硅丝中正电荷(空穴)并排斥负电荷(电子)，导致硅丝电导增加。
当在硅丝表面固定了生物分子后，调节溶液的pH可使生物分子带上不同的电荷，利用上述原理，用将biotinamidocaproyl标记的小牛血清PBS溶液滴加至氨基硅烷层上，使氨基硅烷层表面形成生物素层。加入待测试样，对硅丝的电导进行检测。当外加待测试样中含有与生物素特异性结合的亲和素时，pH发生改变，导致硅丝两端的电导发生变化，从而可以检测出被测试样中亲和素浓度的应答值。
上述纳米生物传感器的关键组件为纳米硅丝，纳米硅丝的制作要求精度高，价格昂贵，实验及生产条件非常苛刻。
发明内容
本发明所解决的技术问题是克服上述纳米硅丝的缺陷，将纳米材料-纳米硅薄膜融入生物传感器，提供一种具有较高可操作性、可灵敏且快速定量测定试样液的纳米硅膜生物传感器。
本发明公开的纳米硅膜生物传感器由绝缘性基底、设置在基底上的至少包括测定电极和对应电极的电极系、与绝缘性基底及电极系相结合的纳米硅制薄膜、以及包裹在电极系上的保护膜组成；其中纳米硅制薄膜上依次覆盖有化学修饰层和生物分子层，电极间留有试样液供给通路口；电极系以对应嵌合的梳状排列，并通过引脚与电化学工作站的对应导线连接。纳米硅制薄膜和电极系位于绝缘基底之上，纳米硅制薄膜位于电极系之间并与电极系中的高参杂硅层相结合。
所述的纳米硅制薄膜即纳米硅膜，其厚度在纳米尺度空间，一般为5-100nm，根据不同的被测试样，可以对该纳米硅制薄膜进行化学修饰，固定上具有识别功能的敏感元件，这种敏感元件可以是各种与待测分子特异性结合的生物大分子如酶、抗原、抗体、激素、核酸等。本发明中将敏感元件固定到纳米硅膜表面的化学修饰试剂可以是能将生物大分子固定到纳米硅膜表面的一切试剂，例如3-氨基硅烷，该试剂构成化学修饰层。
所述的电极系由高参杂硅-金属合金制成，电极系中金属部分为常用导电材料如铝、银等。电极系暴露于空气中的部分均包裹了保护材料，例如Si3N4，以防止电极系被氧化并且避免电极系与被测试样液接触。对于敏感膜即纳米硅膜上电化学变化的测定方式有仅包括测定电极和对应电极的二极方式以及加入了参比电极的三极方式，三极方式可以更准确地进行测定。纳米生物传感器的二极方式电极系以对应嵌合的梳状排列，增大了电极系的表面积，更有利于提高纳米硅膜生物传感器的灵敏度。
所述的“电化学工作站”是指所使用的检测仪器。
本发明所要解决的另一技术问题是公开上述纳米硅膜生物传感器的制作方法。
本发明纳米硅膜生物传感器是通过下述技术方案制得的
首先利用SOI(silicon-On-Insulator)技术，通过光刻腐蚀，在由SiO2制成的绝缘性基底上形成厚度在纳米尺度空间内的硅制薄膜和电极系高参杂硅层；通过溅射金属，在高参杂硅层上形成包含测定电极金属部分和对应电极金属部分的电极系，在电极系暴露于空气中的部分沉积保护层如Si3N4；光刻腐蚀露出试样液供给通路口；然后在纳米硅膜上覆盖化学修饰剂，干燥后形成化学修饰层；再将一定浓度的生物分子溶液覆盖在化学修饰层上，静置后倾去，形成生物分子层；最后用小牛血清溶液封闭未与生物分子结合的化学修饰层。
本发明的原理是改进后的离子敏场效应管原理。当硅膜的厚度达到纳米级时，硅膜的比表面积增大，化学活性增强。对纳米硅膜表面进行化学修饰，固定上具有识别功能的敏感元件，这种敏感元件可以是各种与待测分子特异性结合的生物大分子如酶、抗原、抗体、激素、核酸等。当该敏感元件与试样液中的待测分子特异性结合后，会引起纳米硅薄膜电化学性质的变化，这种变化通过与电极系连接的检测仪器被检测出来，最终可在检测仪上读出存在于试样液中待测分子浓度的应答值。检测时，可根据不同的待测对象设定不同的电参数进行测量，即可以测量加入待测试样液前后加载在纳米硅制薄膜两端测定电极和对应电极之间各种电参数的变化(包括阻抗、电导、电容、电流等)。从而定量检测出待测试样中待测分子的浓度。
纳米硅膜的厚度同样属于纳米尺度空间，其制作相对于纳米硅丝容易，具有较高的可操作性，并且表面积大，可以结合更多的生物大分子。同时，本发明在对待测试样的测定上采用了可根据不同待测试样选择不同电参数进行测量的测定方法，使定量测定更趋灵敏。
本发明操作方法如下1、测量标准样品，建立标准工作曲线(或获得经验公式)首先，设定所要测量的电化学参数，包括阻抗、电导、电容、电流等其次，将已知不同浓度的标准样品沿试样液供给通路分别加至不同传感器的纳米硅膜表面，将电极系连入电路并向纳米硅膜两端电极系施加±0.005-±0.5V的交流电压，测量不同浓度的标准样品的电化学参数，通过已测出的电化学参数值和浓度在二维坐标系中建立标准工作曲线(或获得经验公式)。
2、在测量待测试样时，将待测试样加入另一传感器中，在与步骤1相同的测定条件下，测出已加载待测试样的纳米硅膜两端的电化学参数值，根据上述步骤1获得的标准工作曲线得出存在于被测试样液中的待测分子浓度的应答值。
本发明再一目的是公开上述纳米硅膜生物传感器在免标记体外免疫检测中的应用。
本发明纳米硅膜生物传感器可单独检测或集成后同时用于多个不同待测试样的检测。
本发明纳米硅膜生物传感器响应快、样品用量少，可以实现连续在位监测；同时使用简便，无须使用标记试剂；且使用范围广，可以用于生物医学领域来检测过敏原、抗原、抗体、微生物等物质。亦可应用于环境、化工、制药，法医，毒品、生物武器等领域的监控。
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述，但并不限于此。
图1为实施例1，纳米硅膜传感器垂直剖面示意图其中1为绝缘基底，2为硅制薄膜，3为3-氨基硅烷层(化学修饰层)，4为生物分子层，5为电极系高参杂硅层，6为测定电极金属部分，7为对应电极金属部分，8为Si3N4保护层，9为试样液供给通路口，10为Si片层底座。
图2为图1纳米硅膜生物传感器俯视示意图。
其中11为引脚，与电化学工作站的以对应导线相连接；2为硅制薄膜，6为测定电极金属部分，7为对应电极金属部分。
具体实施例方式实施例1、纳米硅膜生物传感器的制备如图1所示，利用SOI(silicon-On-Insulator)技术，通过光刻腐蚀，在由SiO2制成的绝缘性基底1上形成50nm厚的硅制薄膜2和电极系高参杂硅层5。通过溅射铝，在高参杂硅层上形成包含测定电极金属部分6和对应电极金属部分7的电极系，在电极系暴露于空气中的部分沉积Si3N4保护层8，光刻腐蚀露出试样液供给通路口9，宽度为5μm。在敏感膜即纳米硅膜2上，滴加20μl 1％(体积比)的3-氨基硅烷至完全覆盖纳米硅膜表面，在室温下静置30分钟后倾去3-氨基硅烷溶液，用重蒸水缓慢洗涤，在60℃的烘箱中干燥1小时，形成氨基硅烷层3(化学修饰层)。接着，滴加0.25mg/ml HGH(HumanGrowth Hormone)抗体和1％(体积比)戊二醛的混合溶液20μl，覆盖氨基硅烷层，在室温下静置30分钟后倾去上述混合溶液，用重蒸水缓慢洗涤，形成抗体层4(生物分子层)。之后，滴加3-4.5g/100ml标准小牛血清溶液至抗体层表面以封闭未与HGH抗体结合的氨基硅烷层，在37℃条件下静置30分钟，倾去标准小牛血清溶液，用重蒸水缓慢洗涤抗体层4。在SiO2绝缘性基底底部生长出Si片层底座10，这种结构是由原材料结构决定的。
为了使测量更准确，可在电极系中加入参比电极。参比电极的一端插入已滴加在纳米硅膜上的被测试样中，另一端通过导线连入电化学工作站。
图2是图1纳米硅膜生物传感器的俯视图。
在纳米硅膜2两端连接出测定电极6和对应电极7，电极系以对应嵌合的梳状排列，并通过引脚11与电化学工作站的对应导线连接。
实施例2、试样浓度的检测在两个按实施例1方法制得的纳米硅膜生物传感器中，分别加入已知浓度分别为65.0ng/ml、5.5ng/ml的HGH抗原标准品。37℃条件下，静置30分钟，使之结合在抗体层上。将电极系连入电路，在固定频率的条件下(1000Hz)，向纳米硅膜两端电极系施加±0.5V的交流电压，测出两个不同浓度的标准样品的阻抗值分别为56.5×107Ω和16.1×107Ω。通过公式C＝k*lg(Z1-Z0)-a(其中C为加入样品的浓度，a和k为未知常数，Z1为加入样品的阻抗值，Z0＝1.5×107Ω为未加任何样品的空白阻抗值)计算出a和k值，分别为831.7和102.6。在另一个纳米硅膜生物传感器中加入待测试样液(含有未知浓度的特异性HGH抗原)，37℃条件下，静置30分钟。在相同条件下测量该待测样品的阻抗值为16.3×107Ω。代入上述公式C＝102.6*lg(16.3×107-1.5×107)-831.7(a和k已通过标准品测出)得到存在于待测试样液中的与HGH抗体特异性结合的抗原浓度的应答值为6.5ng/ml。在上述待测样品的测量中用到三个规格完全相同的纳米硅膜生物传感器，所用到的公式为实验经验公式。
权利要求
1.一种纳米硅膜生物传感器，其特征在于该传感器由绝缘性基底、设置在基底上的至少包括测定电极和对应电极的电极系、与绝缘性基底及电极系相结合的纳米硅制薄膜、以及包裹在电极系上的保护膜组成；其中纳米硅制薄膜上依次覆盖有化学修饰层和生物分子层，电极间留有试样液供给通路口。
2.一种如权利要求1所述的纳米硅膜生物传感器，其特征在于其中所述的纳米硅制薄膜和电极系位于绝缘基底之上，纳米硅制薄膜位于电极系之间并与电极系中的高参杂硅层相结合。
3.一种如权利要求1所述的纳米硅膜生物传感器，其特征在于其中所述的纳米硅制薄膜，其厚度为5-100nm，根据不同的被测试样，可以对该纳米硅制薄膜进行化学修饰，覆盖具有识别功能生物分子层。
4.一种如权利要求1或3所述的纳米硅膜生物传感器，其特征在于其中所述生物分子层中各种与待测分子特异性结合的生物大分子为酶、抗原、抗体、激素、核酸等。
5.一种如权利要求1所述的纳米硅膜生物传感器，其特征在于其中所述化学修饰层是能将生物大分子固定到纳米硅膜表面的试剂层，该修饰层可选用3-氨基硅烷。
6.一种如权利要求1所述的纳米硅膜生物传感器，其特征在于其中所述的电极系可以是由测定电极和对应电极组成的二极方式或加入了参比电极的三极方式；在二极方式中，电极系以对应嵌合的梳状排列，并通过引脚与电化学工作站的对应导线连接。
7.一种如权利要求1所述的纳米硅膜生物传感器，其特征在于其中所述的电极系材料选用高参杂硅-金属合金。
8.一种如权利要求1所述的纳米硅膜生物传感器，其特征在于该传感器通过测量加入试样液前后加载在纳米硅制薄膜两端测定电极和对应电极之间各种电参数的变化，可以免标记地定量测定固定在纳米硅制薄膜上的被测试样。
9.一种如权利要求1所述的纳米硅膜生物传感器的制备方法，其特征在于该传感器的制备包括首先利用SOI技术，通过光刻腐蚀，在由SiO2制成的绝缘性基底上形成厚度在纳米尺度空间内的硅制薄膜和电极系高参杂硅层；通过溅射金属，在高参杂硅层上形成包含测定电极金属部分和对应电极金属部分的电极系，在电极系暴露于空气中的部分沉积保护层；光刻腐蚀露出试样液供给通路口；然后在纳米硅膜上覆盖化学修饰剂，干燥后形成化学修饰层；再将一定浓度的生物分子溶液覆盖在化学修饰层上，静置后倾去，形成生物分子层；最后用小牛血清溶液封闭未与生物分子结合的化学修饰层。
10.一种如权利要求1所述的纳米硅膜生物传感器在免标记体外免疫检测中的应用，其特征在于该生物传感器可单独检测或集成后同时用于多个不同待测试样的检测。
全文摘要
本发明提供了一种纳米硅膜生物传感器，该传感器由绝缘性基底、设置在基底上的至少包括测定电极和对应电极的电极系、与绝缘性基底及电极系相结合的纳米硅制薄膜、以及包裹在电极系上的保护膜组成；其中纳米硅制薄膜上依次覆盖有化学修饰层和生物分子层，电极间留有试样液供给通路口；电极系以对应嵌合的梳状排列，并通过引脚与电化学工作站的对应导线连接。该生物传感器的原理是通过测量加入待测试样液前后纳米硅膜两端各种电参数的变化，来定量测定试样液中各种生物大分子的浓度。该生物传感器具有免标记、灵敏度高、快速测定等优点，在生物学、医学研究和临床领域具有极大的应用前景。
文档编号G01N27/04GK1502988SQ0215073
公开日2004年6月9日 申请日期2002年11月27日 优先权日2002年11月27日
发明者胡赓熙 申请人:浙江贝特生物园区发展有限公司