专利名称：与β-受体激动剂类药物特异结合的受体蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种受体蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及与β-受体激动剂类药物特异结合的受体蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
β-受体激动剂是一种有害物质，如果在动物饲料中含有该类物质，会直接影响到动物肉类产品的品质，从而影响到人类的生命健康。动物体内的某些受体能够与β-受体激动剂特异性结合，同时受体蛋白已经被证实是一个胁迫应答的调节因子，可以启动相关基因的表达以达到促进动物生长的效果。
在外界环境刺激下，动物体内会发生生理生化特性的变化。动物先是通过多种途径感受外界环境的变化，并将细胞外的信号转移到细胞内部，然后经过一系列磷酸化级链式反应将信号传递给某些转录或调节因子，转录或调节因子再通过其特异性功能蛋白与β-受体激动剂特异性结合相互作用，启动对环境产生应答的目的基因的表达来提高动物的应激反应能力。
畜产品作为人类食用物质的重要来源，监督检测动物饲料中的有害成分，保证产品的品质是饲料检测工作者的重要任务之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够与β-受体激动剂类药物特异结合的受体蛋白及其编码基因。
本发明所提供的能够与β-受体激动剂类药物特异结合受体蛋白的编码基因来源于仓鼠(Golden Hamster)，命名为GhβAR。
能够与β-受体激动剂类药物特异结合受体蛋白的编码基因，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列由792个碱基组成，该基因的读码框为自5’端第1到第792位碱基，能够与β-受体激动剂类药物特异结合的受体蛋白，它是序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列或将SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №2相同活性的由SEQID №2衍生的蛋白质。
序列表中序列2氨基酸残基序列是由254个氨基酸残基组成的蛋白质。
含有本发明基因的表达载体及细胞系均属于本发明的保护范围，利用现有分子生物学的方法可以得到不同的表达载体，如pGEX-4T-1βAR(图谱如图1所示)。
本发明的受体蛋白能够与β-受体激动剂类药物特异性结合，在检测β-受体激动剂类药物，特别是检测动物饲料及畜产品中的β-受体激动剂类药物中将得到广泛应用，具有重要的理论及实践意义。
图1为GhβAR融合表达基因载体的基因图谱。
图2为不同处理的凝胶电泳图。
具体实施例方式
实施例1、仓鼠GhβAR cDNA的克隆与序列结构分析生长5个月的金色中仓鼠肺经洗净后收集于液氮中研磨至精细程度，置于4mol/L异硫氰酸胍中，再用酸性苯酚/氯仿抽提混合物，取上清液，用异丙醇沉淀总RNA，再重复上述步骤一次，将RNA溶于DEPC水，保存于-80℃(Davis等编1994，分子生物学的基本方法[Basic Methods in Molecular Biology]，pp.777)。取1μg总RNA通过一对特异性简并性引物进行各自独立的一步逆转录链式扩增反应(RT-PCR)(Takara kit DR2409A)。一对对应于金色中仓鼠β-受体蛋白保守域N-端的正向引物(Forward primers)MaARF5’-CAAAGAATTCATGGGGCCACCCGGGAACGAC-3’和对应于C-端的反向引物(Reverse Primer)MaARR15’-GCAACTCGAGGAACTTGGAGGACCTTCGGAG-3’，PCR条件为4℃，3分；94℃30秒，60℃30秒，72℃1.5分-30循环；72℃10分；4℃保存。PCR产物连接到pMD18-T载体上用于测序。结果表明该基因与体外包装序列完全一致，cDNA功能片段长度为792bp，命名为GhβAR，具有序列表中序列1的核苷酸序列。
该基因片段编码264个氨基酸，具有序列表中序列2的氨基酸残基序列。该蛋白质含有一个疏水氨基酸结构保守域，该保守区具有与β-受体激动剂特异结合的核心序列与结合机制，可由此判断目的化合物的存在。
实施例2、融合表达基因pGEX-4T-1βAR的构建利用金色中仓鼠肺新鲜组织，提取总RNA，并依据序列1设计一对特异性引物，通过RT-PCR扩增得到一个长度为792bp的包含疏水结构保守域cDNA片段，然后通过EcoRI与XhoI限制性内切酶消化该基因片段，经纯化后熔解于水用于连接。取1μgcDNA片段经EcoRI和XhoI酶切消化后的pGEX-4T-1载体，利用DNA连接酶，在16℃温度下连接12小时以上。连接后产物转化于大肠杆菌，经37℃培养，提取质粒，再进行酶切与测序确定该基因片段的大小与结构特征。经验证后的pGEX-4T-1βAR(如图1所示)转化于大肠杆菌中，以备纯化融合蛋白。
实施例3、融合表达基因pGEX-4T-1βMa在大场杆菌中的体外表达鉴定将上述构建好的融合表达载体转化于大肠杆菌后，在37℃下培养，经IPTG在大肠杆菌中诱导，SDS-PAGE检测表明该基因能够在大肠杆菌中进行体外翻译表达。而未经诱导的菌株却没有蛋白条带出现，表明该融合表达基因可以纯化后做为检测饲料以及蓄产品中β-受体激动剂的存在与否，结果如图2所示，其中M道为标准蛋白分子量，1道为未被诱导的大肠杆菌，2道为经诱导的空载体(GST)，3为未经诱导的融合载体，4为经诱导的融合载体(表达融合分子量为54.8kD).
实施例4、融合表达的pGEX-4T-1βAR基因在大场杆菌中的体外表达产物配体亲和力鉴定将上述构建好的融合表达载体转化于大肠杆菌后，在37℃下培养。经IPTG在大肠杆菌中诱导，使该基因能够在大肠杆菌中进行体外翻译表达。其产物经蛋白质粗提及亲和柱分离提纯后，以3H标记的盐酸克伦特罗(典型的β2-受体激动剂，CBL，瘦肉精)检验与配体结合的亲和力，并与未改变的MaβAR比较。单位体积GhβAR结合的3H CBL毫摩尔数为MaβAR的142％，达到最大结合浓度的时间前者为后者的51％。
序列表<160>2<210>1<211>792<212>DNA<213>中仓鼠属金色中仓鼠(Mesocricetus auratus)<400>1atggggccac ccgggaacga cagtgacttc ttgctgacaa ccaacggaag ccatgtgcca 60gaccacgatg tcactgagga acgggacgaa gcatgggtgg taggcatggc catccttatg 120tcggttatcg tcctggccat cgtgtttggc aacgtgctgg tcatcacagc cattgccaag 180ttcgagaggc tacagactgt caccaactac ttcataacct ccttggcgtg tgctgatcta 240gtcatgggcc tagcggtggt gccgtttggg gccagtcaca tccttatgaa aatgtggaat 300tttggcaact tctggtgcga gttctggact tccattgatg tgttatgcgt cacagccagc 360attgagaccc tgtgcgtgat agcagtggat cgctacattg ctatcacatc gccattcaag 420taccagagcc tgctgaccaa gaataaggcc cgaatggtca tcctaatggt gtggattgta 480tccggcctta cctccttctt gcccattcag atgcactggt accgtgccac ccaccagaaa 540gccatcgact gctatcacaa ggagacttgc tgcgacttct tcacgaacca ggcctacgcc 600attgcttcct ccattgtatc tttctacgtg cctctagtgg tcatggtctt tgtctattcc 660agggtcttcc aggtggccaa aaggcagctc cagaagatag acaaatctga gggaagattc 720cactccccaa acctcggcca ggtggagcag gatgggcgga gtgggcacgg actccgaagg 780tcctccaagt tc 792<210>2<211>264<212>PRT<213>中仓鼠属金色中仓鼠(Mesocricetus auratus)<400>2Met Gly Pro Pro Gly Asn Asp Ser Asp Phe Leu Leu Thr Thr Asn1 5 10 15Gly Ser His Val Pro Asp His Asp Val Thr Glu Glu Arg Asp Glu20 25 30Ala Trp Val Val Gly Met Ala Ile Leu Met Ser Val Ile Val Leu35 40 45Ala Ile Val Phe Gly Asn Val Leu Val Ile Thr Ala Ile Ala Lys50 55 60
Phe Glu Arg Leu Gln Thr Val Thr Asn Tyr Phe Ile Thr Ser Leu65 70 75Ala Cys Ala Asp Leu Val Met Gly Leu Ala Val Val Pro Phe Gly80 85 90Ala Ser His Ile Leu Met Lys Met Trp Asn Phe Gly Asn Phe Trp95 100 105Cys Glu Phe Trp Thr Ser Ile Asp Val Leu Cys Val Thr Ala Ser110 115 120Ile Glu Thr Leu Cys Val Ile Ala Val Asp Arg Tyr Ile Ala Ile125 130 135Thr Ser Pro Phe Lys Tyr Gln Ser Leu Leu Thr Lys Asn Lys Ala140 145 150Arg Met Val Ile Leu Met Val Trp Ile Val Ser Gly Leu Thr Ser155 160 165Phe Leu Pro Ile Gln Met His Trp Tyr Arg Ala Thr His Gln Lys170 175 180Ala Ile Asp Cys Tyr His Lys Glu Thr Cys Cys Asp Phe Phe Thr185 190 195Asn Gln Ala Tyr Ala Ile Ala Ser Ser Ile Val Ser Phe Tyr Val200 205 210Pro Leu Val Val Met Val Phe Val Tyr Ser Arg Val Phe Gln Val215 220 225Ala Lys Arg Gln Leu Gln Lys Ile Asp Lys Ser Glu Gly Arg Phe230 235 240His Ser Pro Asn Leu Gly Gln Val Glu Gln Asp Gly Arg Ser Gly245 250 255His Gly Leu Arg Arg Ser Ser Lys Phe260 26权利要求
1.能够与β-受体激动剂类药物特异结合受体蛋白的编码基因，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于所述能够与β-受体激动剂类药物特异结合受体蛋白的编码基因是序列表中的SEQ ID №1。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述SEQ ID №1的编码框是自5’端第1位核苷酸到第792位核苷酸。
4.能够与β-受体激动剂类药物特异结合的受体蛋白，它是序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列或将SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白质。
5.根据权利要求4所述的能够与β-受体激动剂类药物特异结合的受体蛋白，其特征在于它具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列。
6.含有权利要求1所述基因的表达载体。
7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于所述载体为pGEX-4T-1βAR。
8.含有权利要求1所述基因的细胞系。
9.权利要求4所述的受体蛋白在检测β-受体激动剂类药物中的应用。
10.权利要求4所述的受体蛋白在检测动物饲料及畜产品中β-受体激动剂类药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种与β－受体激动剂类药物特异结合的受体蛋白及其编码基因与应用，目的是提供一种能够与β－受体激动剂类药物特异结合的受体蛋白及其编码基因。本发明所提供的能够与β－受体激动剂类药物特异结合受体蛋白的编码基因是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID№1；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。能够与β－受体激动剂类药物特异结合的受体蛋白，是序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列或将SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID№2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白质。
文档编号G01N33/68GK1504570SQ02153850
公开日2004年6月16日 申请日期2002年12月5日 优先权日2002年12月5日
发明者杨曙明, 程宪国, 宋荣, 许雷 申请人:国家饲料质量监督检验中心(北京)