专利名称：一种乙肝病毒前s1抗原酶联免疫测定试剂盒及制备方法
技术领域：
本发明书属生物制剂技术领域。具体涉及一种一步法(立可读)乙肝病毒前S1(PreS1)抗原(Ag)酶联免疫测定试剂盒及制备方法。
背景技术：
长期以来，临床医生是根据“二对半”试剂盒检验结果判断乙肝患者的病情。但是“二对半”试剂查的是与乙型肝炎病毒(HBV)相关的表面和核内抗原和抗体，不是直接查HBV。因此该方法不能确定患者有无HBV。此外，用“二对半”试剂盒检查结果表明全世界约有3亿人为乙肝表面抗原(HbsAg)携带者，我国约有1.3亿，已成为世界之最，但实际上其中的部分人既无临床症状，转氨酶也不高，因此，并非所有HbsAg阳性者都携带HBV。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，设计并建成了一步法PreS1 Ag的试剂盒。
为了克服上述检测HBV的缺陷，我们发明了“一步法(立可读)乙肝病毒PreS1 Ag酶免测定试剂盒”。因为已证明PreS1 Ag是HBV-DNA复制的必然标志物，若检测出病人PreS1 Ag阳性，说明其HBV-DNA存在。
本发明提供了一种“一步法(立可读)PreS1 Ag酶联免疫测定试剂盒”，该试剂盒是包括主要成份为抗体预包被反应条、酶标记抗前S1抗体、次要成份为阳性对照液1支、阴性对照液1支、20倍浓洗涤液1瓶、底物缓冲液甲1瓶、底物缓冲液乙1瓶和终止液1瓶组成。
本发明的试剂盒中所述抗体预包被反应条为48-96孔；酶标记PreS 1抗体为辣根过氧化物酶；阳性对照液为HBV-DNA和HbeAg均阳性血清；阴性对照液为正常人血清；浓洗涤液为磷酸-Tween-20；底物缓冲液甲为H2O2；底物缓冲液乙为3，3’5.5’一四甲基联苯胺(TMB)和终止液为4NH2SO4。
本发明的“一步法乙肝病毒前S1抗原酶联免疫测定试剂盒”的临床应用结果如下1998年9月至2000年3月上海第二医科大学附属新华医院、上海中医药大学附属曙光医院和上海市传染病医院使用我们研制、生产的“一步法乙型肝炎病毒PreS1 Ag双抗体夹心ELISA试剂盒，检测各种急、慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染后的血清标本，并与常规乙肝病毒免疫标志物(HBV-M)和HBV-DNA(PCR法)进行比较。现将结果总结报告如下。
材料和方法1.临床血清标本各医院临床收集血清标本总数为1445份，其中新华医院437份，曙光医院324份和传染病医院648份。
2.实验方法2.1.PreS1蛋白检测按“一步法乙肝病毒前S1抗原酶联免疫测定试剂盒”说明书进行操作。即取已包被抗体板条，孔内加血清标本50μl，同时设空白对照一孔，阳性和阴性标准孔，立即加稀释后的酶标记抗PreS1抗体50μl，37℃温育30min，弃液并充分洗涤5遍。用底物甲H2O2及乙TMB显色、终止反应，在酶标仪上读波长为450nm处的吸光度值(OD值)。
结果判定阴性对照(A值)×2.5＝临床值(cut off值)，阴性对照高于0.05时按实际OD值算，阴性对照小于0.05按0.05计算，凡待检标本孔A值大于临界值即为阳性。
2.2.HBV-M检测均采用国产或进口EIA试剂盒检测。
2.3.HBV-DNA PCR法。
结果
1.大三阳与PreS1 Ag阳性符合率二对半的大三阳血清中，三家医院应用报告PreS1 Ag阳性率结果，新华医院为87.1％(见表1)，曙光医院为91.9％(见表2)和传染病医院为83.4％(见表3)。
2.HbeAg与PreS1 Ag阳性符合率新华医院 121例PreS1 Ag(+)中有74例HBeAg(+)(见表4)曙光医院 270例PreS1 Ag(+)中有148例HBeAg(+)(见表5)传染病医院390例PreS1 Ag(+)有267例HBeAg(+)(见表6及9)3.HBV-DNA(PCR法)与PreS1 Ag阳性符合率新华医院140例HBV-DNA(PCR法)(+)血清中有128例PreS1Ag(+)阳性率为91.4％。(见表7)曙光医院68例HBV-DNA(PCR法)(+)血清中有64例PreS1Ag(+)阳性率为94.1％。(见表8)传染病医院464例HBV-DNA(PCR法)(+)血清中有390例PreS1 Ag(+)阳性率为84.1％。(见表9)4.一步法PreS1 Ag酶免试剂盒与二步法PreS1 Ag酶免试剂盒检测的比较。用中国药品生物制品检定所拟定的二步法PreS1 Ag酶免试剂盒61份标准参考品来检定二步法和“一步法PreS1 Ag酶免试剂盒“其检定结果完全一致，如下检验项目 标准规定 检验结果阴性参考品符合率 不得出现假阳性(0/27)(+/-) 0/27阳性参考品符合率 允许出现1份假阴性(1/30)(-/+) 1/30精密性CV(％) ≤15 15灵敏度1# ≥164 15122# ≥1128 110243# ≥132 1256稳定性 37℃放3天后，检定指标达到要求 合格5.三家医院使用结果三家医院使用一步法测定1445份乙肝患者血清中PreS1 Ag与HbeAg及HBV-DNA(PCR法)的比较，见下列表1-11。
表1 PreS1 Ag与HBV-M的关系(新华)HBV-M N PreS1-positivePreS1-positive(％)HBsAg(+)+HBeAg(+)+anti-HBc(+) 85 7487.1HBsAg(+)+anti-HBe(+)+anti-HBc(+) 106 3432.1HBsAg(+)+anti-HBc(+) 46 7 15.2HBsAg(+)+the other mode 74 6 8.1合计 311 121 38.9表2 PreS1 Ag在各HBV-M中的阳性率(曙光)HBV-M模式 血清份数 前S1蛋白(+) (％)HBsAg(+)HBeAg(+)抗HBc(+) 161148 91.9HBsAg(+)抗HBe(+)抗HBc(+) 35681 22.7HBsAg(+)抗HBc(+) 39532 8.1HBsAg(+)抗HBe(+) 42 4 9.5HBsAg(+) 86 5 5.8HBsAg(-)抗HBs(+)抗HBc(+) 1780 0HBsAg(-)的其它模式3040 0合计 1522 270 17.7表3 不同的HBV-M模式和PreS1Ag、PreS1Ab及HBV DNA的关系或检出率(传染)HBV-M例Pre-S1Ag Pre-S1Ab HBVDNA+ ％ + ％ + ％HBsAg HBeAg HBcAb阳性265 22183.4 10 3.7 25194.7HBsAg HBeAb HBcAb阳性192 98 51 16 8.3 12062.5HBsAg HBcAb阳性 121 71 58.7 5 4.1 90 74.4HBsAb HBeAb HBcAb阳性380 00 00 0HBsAb阳性170 00 00 0HBV-M阴性150 00 00 0表4 PreS1 Ag与E系统的关系(新华)HBeAg(-)HBeAg(+) anti-HBe(-)Totalanti-HBe(+)Pre-S1(+) 74 35 12 121Pre-S1(-) 11 74 105190Total 85 109117311
表5 PreS1 Ag与E系统间的关系(曙光)前S1蛋白HBeAg(+) HBeAg(-)抗HBe(+) 抗HBe(-) 合计前S1蛋白(+) 148 85 37 270前S1蛋白(-) 13313 444770合计161 398 4811040表6 HBeAg与HBV DNA的关系(传染)HBeAg 合计+-HBVDNA + 251 210 464- 15 172 187合计 267 382 648表7 PreS1 Ag HBeAg和HBV DNA检测结果(新华)HBeAg Pre-S1HBVDNATotal+ -+ -+ 84 56 128 8 140- 4 90 6 8894Total 88 142 134 96234表8 PreS1 Ag、HbeAg和HBV DNA检测结果(曙光)HBV DNA HBeAg(+) 前S1蛋白 合计+ - +-+42 26 64 4 68-2 45 344 47合计 44 71 67 48 115表9 PreS1 Ag与HBV DNA的关系(传染)PreS1 Ag 合计+ -HBVDNA + 340124 464- 49 135 184合计 390258 648
表10 PreS1 Ag检测阳性率(新华)诊断 NPreS1-positivePreS1-positive(％)急性乙型肝炎 484593.8慢性活动性肝炎864451慢性迁延性肝炎120 2924.2HBsAg(+)携带者573 5.3BsAg阴性者162 0 0表11 Pre-S1Ag、Pre-S1Ab在不同乙肝患者中的检测情况(传染)例数 Pre-S1Ag Pre-S1Ab HBVDNA HBeAg+ - + - + - + -HBV携带25 12 13 0 2620 5 20 5急性肝炎 81 35 46 10 7138 43 20 61慢性肝炎 317 210 1079 308 25265 156161亚重肝 51 4 0 5 2 3 1 4慢重肝 48 28 20 7 4137 11 17 31肝硬化 128 97 31 4 124 10721 53 75肝癌 11 7 4 1 107 4 2 9讨论PreS1蛋白是HBVS区基因编码产物，它和PreS2蛋白一起在HBV附着和侵入肝细胞的机制中起重要作用。PreS1蛋白主要存在于Dane颗粒中。已证实HBV的PreS1蛋白的P21-47肽是吸附于靶细胞受体的配体。
目前，通过血清学检查以判断HBV感染状态的常用手段是检测HBV-M，即所谓“两对半”FbsAg-HbsAb，HbeAg-HbeAb和HbcAb，其中HbeAg和HbcAb阳性，表明HBV在肝内复制。然而，常规HBBV-M检测方法繁琐、耗时，且结果分析比较复杂。PCR法测定HBV-DNA(PCR法)亦已在一些大医院开展，但是尽管该方法有敏感性高等特点，亦因其操作步骤繁琐、费时、技术要求高、消耗性试剂昂贵收费价又高，很难被普遍应用。Theilman等首先报告用western blot技术检测了HbsAg阳性病人血清PreS1蛋白，认为该蛋白与HbeAg和HBV-DNA有良好的相关性，是HBV在体内复制的标志。我们用重组PreS1 Ag免疫豚鼠制备多体或免疫Balb/c小鼠得抗PreS1单抗，经过(MH4)2SO4粗提，再柱层析(DE52)，获高效价多体或单抗，在国内首先建成了一步法(立可读)乙肝病毒PreS1 Ag酶免试剂盒。经过临床应用结果表明，PreS1 Ag检测在下述几个方面具有重要价值如下1.PreS1Ag是很好的HBV复制标志本文三家医院检测的1445份乙肝患者血清中结果，发现一步法乙肝病毒PreS1 Ag酶免法的阳性与HBV-DNA(PCR法)的阳性符合率较高，显示本一步法PreS1Ag酶免试剂盒与HBV-DNA(PCR法)有良好的相关性。HBV-M和HBV-DNA阴性者血清标本也未检出PreS1蛋白，因而本一步法PreS1Ag试剂盒能很好判断病人是否有乙肝病毒复制。
2.PreS1Ag的检测结果与乙型肝炎活动程度有关从表10显示，在乙型肝炎的急性期PreS1Ag多为阳性(93.8％)与乙型肝炎HBV高度复制状态相吻合；慢性活动性肝炎(51.0％)明显高于慢性迁延性肝炎(24.2％)和HbsAg携带者(5.3％)HbsAg阴性者(0％)。
3.PreS1Ag的检测比HBeAg的检测更有临床意义本文三家医院均发现一步法PreS1Ag和HBeAg同时与HBV-DNA(PCR法)作比较，显示出HBV-DNA(PCR法)阳性血清中一步法PreS1Ag酶免试剂盒的阳性率比HBeAg阳性率高，因此PreS1 Ag的检测比HBeAg检测更有临床意义。
4.一步法比二步法更受欢迎用中国药品生物制品检定所拟定二步法PreS1Ag酶免试剂盒75份标准参考品检测一步法PreS1Ag酶免试剂盒其阳性和阳性参考品符合率、精密性、灵敏度和稳定性与二步法酶免试剂盒一样。
由于一步法在40分钟左右内出结果，所以普遍叫“立可读”。一步法比二步法PreS1Ag酶免试剂盒更具有操作简便、迅速和经济的特点，所以更受临床检验工作者和广大乙肝患者的欢迎。
本发明的另一目的是提供了上述“一步法PreS1 Ag酶免测定试剂盒”的制备方法。该方法包括下列步骤
1.抗体制各1.1.制备抗原HBV-DNA重组PreS1 Ag基因片断的21-47aa及1-199aa；1.2.制备抗体1.2.1.用上述重组抗原免疫豚鼠，得抗PreS1抗血清或免疫Balb/C小鼠得阳性鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞，筛选阳性克隆建株，得腹水；1.2.2.抗血清或腹水用(NH4)2SO4或正辛酸沉淀处理，得粗提抗PreS1抗体；1.2.3.用DE52离子交换层析法得纯抗PreS1抗体；1.2.4.经高压液相色谱(HPLC)检定，纯抗PreS1抗体呈单一峰，其纯度95％以上。
2.HRP-抗前S1抗体制备辣根过氧化物酶(HRP)与纯化的抗前S1抗体偶联；3.包被抗体成为予包被反应条用抗HBS或抗PreS1豚抗；4.分装试剂盒其余7种成份，按试剂盒需要量分装在小瓶或尖底离心管中；5.检定试剂盒的特异性、灵敏度、精密度、稳定性合格；6.组装成为成品。
本发明的试剂盒在使用时可以如下操作1.取出已包被条孔，插入支架上，用胶布固定，以防脱落。
2.每孔加待检血清50μ1，各板设阳性对照1孔(50μl)阴性对照1孔(50μl)，空白对照1孔(加蒸馏水50μl)，然后除空白对照孔外各孔加酶标记液50μl，置37℃中反应30分钟。
3.取出反应板甩去孔内液体后停留30秒钟，每次甩去洗涤液后都要在草纸上拍干，以便洗涤彻底。(20倍浓洗涤液1ml+19ml蒸馏水即为工作洗涤液)4.各孔滴加底物缓冲液甲、乙各1滴，室温避光10-15分钟后再每孔滴加终止液1滴，置酶标仪中450nm波长读数。
结果判定阴性对照(A值)×2.5＝临界值(cut off值)，阴性对照高于0.05时按实际OD值计算，阴性对照小于0.05按0.05计算，凡待检标本孔A值大于临界值即为阳性。
本发明的试剂盒能非常专一地检测患者血清中HbsAg-PreS1蛋白的浓度。它具有简便、灵敏和稳定等特点。且本试剂盒操作简便快速，采用一步法可在40分钟左右获得实验结果，比PCR检测法省时(PCR法最快需6-8小时完成实验)，经临床试用PreS1蛋白检测阳性与PCR检测的HBV-DNA阳性有很好的符合率，试剂盒的临床阴阳性预示值为90％。因而本试剂盒对判断病人是否有病毒复制，确定乙肝感染病程及预后具有十分重要的参考意义。本试剂盒与PCR法相比，PCR法需贵重的仪器设备，消耗性试剂昂贵，收费价又高，而本试剂盒整个实验中无需贵重仪器设备，消耗性试剂便宜且收费价低廉，能适用于各级医院及临床测试中心，也可用于流行病学普查。一步法PreS1 Ag试剂盒，具有简便、灵敏、重复性好的优点，能检出完整HBV，将可被普遍使用，做为HBV感染，复制和乙肝病人诊断、治疗和预后的一个新的标志，与其抗PreS1抗体联合可成为新的乙肝检测系统。
具体实施例方式
实施例1制备一步法乙肝病毒前S1蛋白酶免试剂盒的生产步骤(一)纯化包被抗体(HbsAb)HbsAg免疫豚鼠得单抗或用重组PreS1 Ag免疫豚鼠得抗PreS1多抗。加等体积的饱和(NH4)2SO4沉淀，粗提后再经DE-52柱纯化，收集蛋白峰，PBS透析得抗HBs或抗PreS1多抗纯品。经HPLC检定得纯抗PreS1抗体，呈现单一峰。纯度＞95％，效价＞10万。
(二)酶标记抗体制备1.抗体制备
基因重组的PreS1 Ag(21-47aa)及(1-119aa)免疫豚鼠得抗PreS1抗体或重组PreS1 Ag免疫Balb/c小鼠得腹水。用饱和(NH4)2SO4沉淀粗提两次，再经DE-52柱纯化，得纯抗PreS1抗体或单克隆抗体。效价＞10万，经HPLC鉴定纯度在95％以上。
2.酶标记抗体制备抗PreS1抗体用过碘酸钠法与辣根过氧化物偶联对PBS充分透析，加等体积甘油，-20℃以下保存。效价＞2000。
3.酶标记抗体浓度选定采用方阵滴定法选择酶标记抗体的工作浓度大于1∶2000。
PreS1重组抗原从10μg/ml倍增稀释，包被酶标板，加梯度稀释的酶标抗体测定，以确定最适稀释度。
(三)预包被抗体板的制备1.包被Na2CO30.6gNaHCO31.58g重蒸水 500ml加入适量Anti-S抗体，调整PH至9.5，加入微孔板各孔中，置湿盒中加盖，4℃过液甩干。
2.洗涤Na2HPO4·12H2O 2.6gNaH2PO4·2H2O 0.4g20％Tween-20 2.5mlNaCL8.2g重蒸水 100ml调整PH至7.2，1∶10稀释后，加入微孔板各孔中，静置5秒后甩干，上述操作重复三次，以除去剩余抗体。
3.封闭明胶 1.1g 微波炉加温注入酶标BSA 5.0g 至呈透明溶液 板各孔中0.1N PBS 20ml-→冷却至室温-→蒸馏水至100ml
弃去液体放入湿盒中(加盖)吸水纸上拍干重复一次，待干燥后，——→37℃ 1hr—→放入有干燥剂的塑料袋封口，保存于4℃。
(四)阳性对照的制备HBeAg和HBV-DNA同时呈阳性的乙肝患者血清，60℃放置1个小时，除菌过滤，用本药盒测定A值＞0.3，备用，分装。
(五)阴性对照的制备用本试剂盒测定正常人血清A值在0-0.03，加万分之二硫柳汞，分装备用。
(六)酶标单抗配置——————-→10％小牛血清90％0.15MPBSAnti-preS1 HRP——————————→稀释20倍，分装。
(稀释度1∶2000)(七)酶标单抗稀释液BSA 0.5gNa2HPO4·12H2O 2.6gNaH2PO4·2H2O 0.4gNaCL8.2g20％Tween-20 100ml调整PH至7.2(八)底物液ANa2HPO4·12H2O 1.7g柠檬酸.H2O 0.5g3％H2O2200μl重蒸水100ml调整PH至5.0(九)底物液BNa2HPO4·12H2O 1.7g柠檬酸.H2O 0.5g重蒸水 100ml
调整PH至5.0后，加入10mlDMSO含60mgTMB的溶液25μl(十)终止液浓H2SO410ml重蒸水 80ml(十一)10x洗涤液Na2HPO4·12H2O 2.6gNaH2PO4·2H2O0.4g20％Tween-20 2.5ml重蒸水 100ml调整PH至7.2(十二)半成品及成品的组成上述(一)→(十一)步骤所得产品装入小瓶及尖底离心管中，即为半成品。抽出三份经过特异性、稳定性、灵敏度及精密度检定合格才能组装成preS1试剂盒。组装成盒后还需抽出三份同半成品一样经过检定合格才能出售。
权利要求
1.一种“一步法乙肝病毒PreS1抗原酶联免疫测定试剂盒”，其特征在于该试剂盒包括由主要成份抗体预包被反应条48-96孔、酶标记前S1抗体和次要成份阳性对照液1支、阴性对照液1支、20倍浓洗涤液1瓶、底物缓冲液甲1瓶、底物缓冲液乙1瓶及终止液(4N H2SO4)1瓶组成。
2.一种如权利要求1所述的一种“一步法乙肝病毒PreS1抗原酶联免疫测定试剂盒”的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)制备抗原HBV-DNA重组PreS1 Ag基因片断的21-47aa及1-199aa；(2)制备抗体用上述重组抗原免疫豚鼠，得抗PreS1抗血清或免疫Balb/C小鼠得阳性鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞，筛选阳性克隆建株，得腹水；抗血清或腹水用(NH4)2SO4或正辛酸沉淀处理，得粗提抗PreS1抗体；用DE52离子交换层析法得纯抗PreS1抗体；经高压液相色谱HPLC检定，纯抗PreS1抗体呈单一峰，其纯度95％以上。(3)HRP-抗前S1抗体制备辣根过氧化物酶(HRP)与纯化的抗前S1抗体偶联；(4)包被抗体成为予包被反应条用抗HBs或抗PreS1豚抗；(5)分装试剂盒其余7种成份，按试剂盒需要量分装在小瓶或尖底离心管中；(6)检定试剂盒的特异性、灵敏度、精密度、稳定性合格；(7)组装成为成品。
3.根据权利要求1所述的一种一步法乙肝病毒PreS1抗原酶联免疫测定试剂盒，其特征在于其中所述的抗体预包被反应条为48-96孔、酶标记抗体、阳性对照液为HBV-DNA和HBeAg均阳性血清、阴性对照液为正常人血清、浓洗涤液为磷酸-Tween-20、底物缓冲液甲为H2O2、底物缓冲液乙为3，3’.5.5’一四甲基联苯胺和终止液为4NH2SO4。
全文摘要
本发明涉及一种“一步法乙肝病毒前S1蛋白酶免测定试剂盒”。该试剂盒能检出完整HBV，并且具有简便、灵敏和稳定等特点，操作简便快速，可以补充或替代常规的“两对半”和PCR检测法。本发明提供了制备方法。
文档编号G01N33/576GK1510421SQ0215766
公开日2004年7月7日 申请日期2002年12月23日 优先权日2002年12月23日
发明者杜凤鸣 申请人:杜凤鸣