专利名称：待分析物的检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及对待分析物的存在或浓度的检测。更准确地说，本发明涉及使用指示系统来检测待分析物，所述指示系统在暴露于待分析物中时分子结构会发生改变。结构的改变将影响与指示系统有关的可检测的性质，由此能够对待分析物的存在或浓度进行检测。
背景技术：
美国专利5 503 770(James等人)涉及一种包含硼酸的荧光化合物，当其结合至糖类(包括葡萄糖)上时将发出高强度的荧光。所述荧光化合物的分子结构中包含一荧光基团，至少一个苯基硼酸部分和至少一个供胺氮原子；其中氮原子排列在苯基硼酸部分附近，以便与硼酸发生分子内相互作用。由此，上述相互作用将使化合物在与糖类结合时发射荧光。美国专利5 503 770中描述了适于检测糖类的化合物。参见T.James等人的J.Am.Chem.Soc.117(35)8982-87(1995)。
NatureBiotechnology16，49-53(1998)涉及利用分子信标，即标记有荧光基团/猝灭剂对的发夹形低聚核苷酸探针，来进行等位基因鉴别。在结合至目标物上时，探针将经历结构改组，从而恢复已经内部猝灭的荧光基团的荧光。然而，由于在环境温度下DNA碱基配对的强度相对较高，因此，在应用时，分子信标探针必须经历大的结构改变(通过基本上180°的改变)，所述系统不能容易地用来连续地实时检测待分析物浓度的波动。
因此，现有技术中对于指示系统还有这样的需求，即所述系统能够以更高的灵敏度检测待分析物的存在或浓度，它还可以使用多种检测系统，并且还可以用于对浓度会发生波动的待分析物进行实时检测。
发明概述一方面，本发明涉及一种检测试样中多羟基待分析物的存在或浓度的方法，该方法包括a)将试样暴露于指示系统中，所述系统具有i)能以可逆方式与所述待分析物形成共价键的第一识别单元，和能以可逆方式与结合至第一识别单元上的所述待分析物形成共价键的第二识别单元(A)，或在没有所述待分析物时能以可逆方式与第一识别单元相互作用的配位体单元(B)；所述配位体单元还可有可无地包含产生可检测性的标记，所述可检测性通过配位体单元与识别单元的相互作用而调控，其中指示系统中包含所述第一识别单元的部分以共价方式或非共价方式连接到包含所述第二识别单元或所述配位体单元的指示系统部分上；和ii)包含下列至少之一的检测系统(A)产生可检测特性的供体/受体系统，当所述指示系统暴露至所述待分析物中时，该系统以浓度-依赖的方式发生改变，或(B)所述被标记的配位体单元；和b)测量所述检测特性的任何改变，由此测定在所述试样中所述待分析物的存在或浓度。
另一方面，本发明涉及实施上述方法的指示系统。
附图简介
图1示出了实施例1中描述的化合物的标准化荧光发射(在535nm的I/Io)。
图2示出了实施例2中描述的化合物的标准化荧光发射(在535nm的I/Io)。
图3示出了实施例3中描述的指示系统的荧光发射(在535nm的I)。
图4示出了实施例4中描述的指示系统的荧光发射(在535nm的I)。
图5示出了实施例5中描述的指示系统的荧光发射(在535nm的I)。
图6示出了实施例6中描述的指示系统的荧光发射(在450nm的I)。
图7示出了实施例6中描述的指示系统的标准化荧光发射(在430nm的I)。
图8示出了实施例7中描述的指示系统的吸收光谱。
图9示出了实施例7中描述的指示系统吸光率之比〔A(565nm)/A(430nm)〕。
图10示出了实施例7中描述的指示系统在550nm的标准化荧光(I/Io)。
发明详述一方面，利用在与待分析物相互作用时会发生结构改变的指示系统，本发明提供了一种检测待分析物的存在或浓度的方法。当所述指示系统经历结构改变时，它的可检测特性会发生变化，这可以指示待分析物的存在或浓度变化。
根据本发明可以对许多待分析物进行检测。合适的待分析物包括分子待分析物(与例如由配位键组成的金属离子或金属配合物相反，它可以称为由共价键组成的分子)；碳水化合物；多羟基化合物，尤其是具有连位羟基的那些化合物，如游离糖(例如葡萄糖、果糖、乳糖等等)和结合至类脂、蛋白质等上的糖；小分子药物；激素；氧；二氧化碳；各种离子，如锌离子、钾离子、氢离子、碳酸根离子等等。本发明尤其适于检测小分子量待分析物，特别是小于5000道尔顿的待分析物。
在一实施方案中，本发明可以利用对于被检测的分析物具有至少两个识别单元的指示系统来实施，其通过定向能够在两个位点上与待分析物发生相互作用，从而使指示系统发生结构改变。另外，所述指示系统还具有与其配合的检测系统，当指示系统与待分析物相互作用时，检测系统具有的可检测特性发生变化。在与待分析物相互作用时，识别单元可以呈现一构型，与没有待分析物时的构型相比，在新的构型中它们将靠得更近或离得很远，或者限制其分子运动的自由度，这又会对信号产生影响。构型的改变可以引起可检测特性的改变。
在另一实施方案中，实施本发明所用的指示系统具有至少一个针对待检测分析物的识别单元和一个配位体单元。配位体单元与识别单元之间能够发生可逆的相互作用，并且与待分析物和识别单元的相互作用相竞争。当识别单元和配位体单元在没有待分析物的情况下相互作用时，检测系统将具有不同的优选构型或相对取向，而在待分析物与识别单元相互作用时，配位体单元将被从识别单元上置换下来。构型的改变可以引起可检测特性的改变。在某些实施方案中，配位体单元还可以是检测系统的一部分。例如，配位体单元也可以是猝灭剂，当待分析物与识别单元相互作用时其作用将被消除。此外，配位体单元还可以包含例如特性(例如光谱分布)随配位体单元与识别单元之间的相互作用的存在与否而不同的可检测标记。
对于上面描述的任一实施方案，合适的识别单元包括优选能够与被检测分析物可逆地相互作用的分子片断。应理解的是术语“相互作用”可包括各式各样的物理的和化学的相互作用，如电荷相互作用、氢键合、共价键合等等。特别优选的是，在识别单元和待分析物之间的相互作用，以及在配位体单元(如果存在的话)和识别单元之间的相互作用，的形式为以可逆方式形成一个或更多个共价键。在此，共价键优选指的是两个原子之间的键，其中每一个原子提供一个电子，并且不包括氢键合、离子键合和由两原子之一提供两个电子的配位键合或配价键合。优选较弱的相互作用，例如离解常数高于约10-6M。已知的合适的识别单元有多种，优选包括硼酸、硼酸根离子、亚砷酸、亚砷酸根离子、碲酸、碲酸根离子、锗酸、锗酸根离子等等，已知所述这些可用于识别邻位二醇如葡萄糖及其他碳水化合物。当待分析物是葡萄糖时，硼酸是最优选的识别单元。
在指示系统包括配位体单元的实施方案中，这样的单元应当能够与识别单元相互作用，并且根据目标待分析物的动态范围进行设计。在上述指导原则下，配位体单元的选择将取决于待分析物和识别单元。在优选的实施方案中，当待分析物是邻位二醇如葡萄糖，并且识别单元是硼酸时，配位体单元优选是能够以可逆方式与识别单元成键的分子片断(如酯键)。上述配位体单元包括芳族二醇(例如儿茶酚)、乳酸盐、α-羟酸、酒石酸、苹果酸、二乙醇胺、β-氨基醇、葡萄糖、多羟基化合物以及含邻位羟基的化合物，所述这些物质可以是取代或未取代的。在另一实施方案中，配位体单元还可以是检测系统的一部分。例如，配位体单元还能够调控与指示系统缔合的荧光基团的荧光。当配位体单元与识别单元相互作用时，它将处于例如可以有效地猝灭荧光基团的构型。当配位体单元被待分析物从识别单元上取代下来时，配位体不再是猝灭荧光基团的构型(参见实施例6)。在另一实施方案中，确实还可以有相反的情况(当与识别单元相互作用时猝灭剂不能与荧光基团相互作用)。
使用中，本发明的指示系统优选处于在此所述结构状态的动态平衡之中。更优选的是，存在较弱的结合和高速的相互作用，使得在游离的待分析物存在下能够实现更快的平衡。因此，使用本发明能够在很宽的条件范围内对待分析物进行实时检测，尤其是检测待分析物的浓度波动。通常，在实施此处所述的方法时，本发明不需要使用大的温度改变。也就是说，本发明的方法基本上可以在环境温度下进行，这意味着正常情况下发现待分析物试样的温度。很清楚，环境温度将根据待分析物及其环境而大大地改变。例如，环境温度可以包括室温或更冷的；对于许多活体内的应用可以高达约45℃；而对于例如某些发酵应用可以高达约80℃或更高。
本发明的指示系统包括检测系统，当指示系统暴露于待分析物中时，该检测系统具有以浓度-依赖的方式改变的可检测特性。检测系统优选包含给体/受体系统，它指的是通过相互作用来提供信号的一对不同的基团，其中基团之间距离的改变将改变信号的特性。优选的是，所述信号是电磁或电化学信号(例如，当紧密接近时提供不同电化学势的电荷转移对)。
已知的上述性质/系统有许多种，并且可以用于本发明。例如，指示系统可以包括发光的(荧光的或磷光性的)或化学发光的标记，基于吸光率的标记等等，当指示系统经历结构改变时，所述标记的检测特性将发生改变。检测系统可以包含给体部分和受体部分，各自有一定间距，以便在指示系统与待分析物相互作用时有可检测的改变。
检测特性可以是可检测的光谱改变，如荧光衰减时间的改变(通过时域或频域测量确定)，荧光强度的改变，荧光各向异性或偏振的改变；发射光谱的光谱移动；时间-分辨的各向异性衰减的改变(通过时域或频域测量确定)，吸收光谱的改变，等等。
检测系统可以包含荧光基团和能够猝灭荧光基团的荧光的分子片断。在该实施方案中，指示系统可以两种方式构成。首先，它可以这样构成，以致使在没有待分析物时，荧光基团和猝灭剂彼此距离很近，结果有效地猝灭了荧光的发射。在与待分析物相互作用时，指示系统的构型发生改变，导致足以使荧光基团去猝灭(dequenching)的荧光基团/猝灭剂的分离。另外，指示系统可以这样构成，以致使在没有待分析物时，荧光基团和猝灭剂彼此距离很远，此时荧光基团能够发射荧光。在与待分析物相互作用时，指示系统的构型发生改变，并且使荧光基团/猝灭剂足够接近，从而将荧光基团猝灭。在本发明中使用的荧光基团/猝灭剂对包括如下情形所述荧光基团/猝灭剂对的双方是相同或不同荧光体，但是当指示系统处于猝灭构型时，如通过接近效应、能量转移等等，一个荧光基团将影响另一个的荧光。
已知的荧光基团/猝灭剂对有许多，并且是本发明也设计了多个荧光基团/猝灭剂对。例如，已知的是，DABCYL将有效地猝灭许多荧光体，如香豆素、EDANS、荧光素、萤光黄、BODIPYTMEosine、四甲基碱性蕊香红、Texas RedTM等等。
应该理解的是从荧光基团发射的荧光可以通过多种机理来猝灭。一种是通过荧光基团和猝灭剂之间光致电子转移而猝灭(参见Acc.Chem.Res.1994，27，302-308，在此将其引入作为参考)。猝灭还可以通过由重原子作用所引起的系间跃迁或者通过与顺磁性金属离子的相互作用而进行，其中猝灭剂可以包含重原子如碘或顺磁性金属离子如Cu+2(参见例如J.Am.Chem.Soc.1985，107，7783-7784，和J.Chem.Soc.Faraday Trans.，1992，88，2129-2137，两者均引入作为参考)。
猝灭还可以通过在荧光基团和猝灭剂之间形成基态配合物而发生，如Nature Biotechnology，1998，16，49-53(在此引入作为参考)中所述。另一猝灭机理涉及例如在Meas.Sci.Technol.10(1999)127-136和JACS2000，122，10466-10467(在此引入作为参考)中描述的荧光共振能量传递(FRET)。
对本发明的检测系统有用的另一类分子片断包括吸收光谱随分子构型改变而发生改变的那些分子片断，包括Alizarin Red-S，等等。
适合本发明用的指示系统包括具有下列结构之一的物质的组合物 或
R1-D1-L1-Z-L2-D2-R2或D1-R1-L1-Z-L2-R2-D2式中-R1是针对所述待分析物的一个或多个识别单元；-R2是i)针对所述待分析物的一个或多个识别单元，或ii)可有可无的被标记的配位体单元；-D1和D2一起包含检测系统，检测系统包含能量给体/受体系统，当所述指示剂分子与待分析物相互作用时，该检测系统具有以浓度-依赖方式改变的检测特性；或者当R2是被标记的配位体单元时，D1和D2可以不存在；-L1和L2相同或不同，并且其所包含的连接基团的长度和结构足以使相互作用和可检测特性的变化能够发生；和Z是在L1和L2之间的共价键或非-共价键。
业已描述了识别单元、配位体单元和检测系统。连接基团L1和L2具有足以使所述相互作用和改变能够发生的长度和结构。公认的是，连接基团的准确性质将取决于指示系统其它单元的结构。可以就结构刚度、分子距离、电荷相互作用等对连接剂进行设计，如实施例所示，这可用来使得可逆待分析物检测系统的相互作用最佳化。本发明指示系统的Z组分优选是在L1和L2之间的共价键。指示系统可以呈单分子或大分子的形式。
L1和L2可以采取多种的形式。例如，合适的连接基团包括烷基、芳基、聚酰胺、聚醚、聚氨基、聚酯及其组合，所述这些基团是取代或未取代的。
本发明的指示系统，如果可溶的话，可以根据需要直接在溶液中使用。另一方面，如果需要的话，指示系统可以固定(如通过机械夹带或共价的或离子的连接)至如玻璃、塑料、聚合材料等不溶表面或基体上或其内部。当指示系统夹带在例如聚合物内部时，负载材料优选对于待分析物是可充分渗透的，以便在待分析物和指示系统之间提供合适的相互作用。
如果指示系统微溶于水或不溶于水，可是仍希望在水介质中进行检测的话，可以使指示系统与亲水单体共聚合，从而形成如共同待批美国申请09/632,624(2000年8月4日申请)所述的亲水大分子，在此将其引入作为参考。
可以理解的是本发明的指示系统在化学上可以采取许多形式。例如，整个指示系统可以是一个尺寸较小的分子。或者，指示系统的个别组分可以是大分子的一部分。在后一情况下，系统的各组分可以掺入相同的聚合物中，或者能够与单独交联的聚合物缔合。例如，包含荧光基团/配位体单元加合物和猝灭剂/识别单元加合物的单独的单体可以共聚合而形成指示系统聚合物(参见实施例5)。另外，可以单独地使单体聚合形成单独的聚合物链，然后再交联而形成指示系统。
本发明的指示系统有着许多应用，包括在能源、医药和农业方面用作指示剂。例如，指示系统能够作为指示剂分子用于检测血液或尿中微量或超微量葡萄糖的检测，因此，对于诊断或监护如糖尿病和肾上腺机能不全这样的疾病提供重要情报。具有两个识别单元的本发明指示系统尤其可用于检测溶液中的葡萄糖，其中还可以潜在地包含干扰量的α-羟酸或β-二酮(参见共同待批申请09/754,217(2001年1月5日申请)；60/329,746(2001年10月18日申请)；和60/269,887(2001年2月21日申请)，发明名称为“对含有α-羟酸或β-二酮的溶液中葡萄糖的检测”，在此将其引入作为参考)。用于医疗卫生方面的医用/药用葡萄糖的生产需要监控。
本发明在农业方面的应用包括检测待分析物如葡萄糖，在大豆及其他农产品中的含量。对于如欧洲葡萄这样的高价值产品，在作出收获决策前，必须对葡萄糖进行仔细地监测。由于葡萄糖是发酵过程中最为昂贵的碳源和原料，因此，在烈性酒生产中，为了使反应器进料速率控制最优化，对葡萄糖的监控是十分重要的。在软饮料和酒精饮料生产期间，反应剂的混合和葡萄糖浓度的控制对于质量控制也是至关重要的，从全球来看，绝大部分的葡萄糖和可发酵糖(顺式-二醇)被用于上述生产。
当将荧光指示剂取代基结合到检测系统中时，本发明的系统可用于已知的各种检测技术。例如，本发明的系统可以用于荧光感受设备(例如美国专利5 517 313)或能够结合至聚合材料上，如用于肉眼检查的试纸上。后一技术，例如使得葡萄糖的测量类似于用石蕊试纸条测量pH。在此所述的系统还可以作为简单的试剂与标准的小型(benchtop)分析测试设备如由Shimadzu、Hitachi、Jasco、Beckman等制造的荧光分光计或临床分析仪一起使用。这些分子还将待分析物特定的化学/光学信号通过转换提供给如由Ocean Optics(Dunedin，Florida)或OrielOptics制造的基于光学纤维的传感器和分析荧光计。
在此引入作为参考的美国专利5 517 313描述了可使用本发明的系统的荧光传感设备，其可用来测定待分析物如液体培养基中的葡萄糖或其他顺式-二醇化合物的存在或浓度。该传感设备包括包含成层排列的荧光指示系统的基体(下面称之为“荧光基体”)、高通量过滤器和光检测器。在该装置中，光源，优选发光二极管(“LED”)，至少部分地位于指示剂材料内，或者指示剂基体下面的波导管中，以便来自光源的入射光使指示系统发荧光。高通量过滤器使发射光能够到达光检测器，同时能够从光源中过滤掉分散的入射光。
使用不均匀存在的待分析物，如葡萄糖或其他顺式-二醇化合物，对美国专利5 517 313中描述的装置中使用的指示剂分子的荧光进行调控，例如减弱或增强。
在美国专利5 517 313中描述的传感器中，包含指示剂的材料能够渗透待分析物。因此，待分析物可从周围的试验介质扩散入该材料中，由此影响由指示系统发射的荧光。通过对光源、包含指示系统的材料、高通量过滤器和光检测器的设置，使指示系统发射的至少一部分荧光射向光检测器，从而产生电信号，该信号就是周围介质中待分析物(例如葡萄糖)浓度的指示。
根据利用本发明指示系统的其他可能的实施方案，传感设备还描述于美国专利5 910 661、5 917 605和5 894 351中，在此将其引入作为参考。
本发明的系统还可用于植入装置中，例如连续地监测体内的待分析物(如血糖量)。合适的装置描述于例如，共同待批专利申请美国专利09/383 148(1999年8月26日申请)，以及美国专利5 833 603，6 002954，和6 011 984中，在此将其引入作为参考。
利用已知的反应机理和试剂，包括与如下所述常用步骤一致的反应机理，无需过度的试验，本领域熟练技术人员将能够制备本发明的系统。
实施例1 nBuF-二甲苯-Q二-硼酸酯nBuF-二甲苯-Q二-硼酸酯nBuF-二甲苯-Q二-硼酸酯N-2-[5-(N-4-二甲氨基苄基)-5-[2-(二羟硼基)苄基]-氨基己基]-[2-(二羟硼基)苄基]氨乙基-4-丁基氨基-1，8-萘酰亚胺(nBuF-hexa-Qbis-boronate)。
在葡萄糖研究中使用的游离二硼酸产物是通过将N-2-[5-(N-4-二甲氨基苄基)-5-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]氨基己基]-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]氨乙基-4-丁基氨基-1，8-萘酰亚胺溶解于MeOH/PBS缓冲体系中而得到的。
N-(2，2-二乙氧基乙基)-4-溴-1，8-萘酰亚胺在45℃，将4-溴-1，8-萘二甲酸酐(10.0克，36.1毫摩尔)和氨基乙醛二乙基乙缩醛(4.81克，5.26毫升，36.1毫摩尔，1克当量)在45毫升EtOH中的悬浮液搅拌3天。然后过滤得到的悬浮液，用EtOH进行洗涤，并对残余物进行干燥，得到13.3克(94％)浅棕色固态产物。
TLCMerck硅胶60板，Rf 0.17(98/2 CH2Cl2/CH3OH)，利用UV(254/366)观察。
HPLCHP 1100HPLC色谱仪，水5×100mm NovaPak HR C18柱，注入0.050毫升，0.75毫升/分钟，1.5毫升注入回路，检测波长360nm，A＝水(0.1％HFBA)，B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B2分钟，10-80％B18分钟，80-100％B2分钟，100％B2分钟，停留时间24.2分钟。
N-(2，2-二乙氧基乙基)-4-丁氨基-1，8-萘酰亚胺在45℃下，将N-(2，2-二乙氧基乙基)-4-溴-1，8-萘酰亚胺(0.797克，2.03毫摩尔)和正丁基氨(1.48克，2.00毫升，20.2毫摩尔，9.96克当量)在8毫升NMP中的溶液加热66小时。这时，将得到的悬浮液冷却至25℃，继之以过滤。用50毫升乙醚溶解残余物并利用3×50毫升的水进行萃取。在无水硫酸钠上对有机萃取物进行干燥，过滤并浓缩，以便得到粗的黄色粉末。通过硅胶色谱法(25克重力级凝胶，0-1％CH3OH/CH2Cl2)对该原料进行提纯，从而得到0.639克(82％)的黄色粉末。
TLCMerck硅胶60板，Rf 0.71(95/5 CH2Cl2/CH3OH)，利用UV(254/366)观察。
HPLCHP 1100HPLC色谱仪，水5×100mm NovaPak HR C18柱，注入0.050毫升，0.75毫升/分钟，1.5毫升注入回路，检测波长450nm，A＝水(0.1％HFBA)，B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B2分钟，10-80％B18分钟，80-100％B2分钟，100％B2分钟，停留时间23.5分钟。
N-(2-氧乙基)-4-丁基溴-1，8-萘酰亚胺在25℃，将N-(2，2-二乙氧基乙基)-4-丁基溴-1，8萘酰亚胺(0.622克，1.62毫摩尔)和对-甲苯磺酸单水合物(0.010克，0.053毫摩尔，0.032克当量)在25毫升丙酮中的溶液搅拌18小时。这时，对该溶液进行浓缩并通过硅胶色谱法(25克重力级凝胶，0-1％CH3OH/CH2Cl2)对残余物进行提纯，从而得到0.47克(94％)的橙色固体。
TLCMerck硅胶60板，Rf 0.61(95/5 CH2Cl2/CH3OH)，利用UV(254/366)观察。
1H NMR(400MHz，CDCl3)；δ1.03(t，3H，J＝7.3Hz)，1.53(m，2H)，1.78(m，2H)，3.38(t，2H，J＝7.2Hz)，5.02(s，2H)，6.64(d，1H，J＝8.6Hz)，7.52(dd，1H，J＝7.4，8.3Hz)，8.08(dd，1H，J＝1Hz，8.5Hz)，8.38(d，1H，J＝8.3Hz)，8.46(dd，1H，J＝1.0，7.3Hz)，9.75(s，1H).
HPLCHP 1100HPLC色谱仪，水5×100mm NovaPak HR C18柱，注入0.050毫升，0.75毫升/分钟，1.5毫升注入回路，检测波长450nm，A＝水(0.1％HFBA)，B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B2分钟，10-80％B18分钟，80-100％B2分钟，100％B2分钟，停留时间19.6分钟。
N-(4-二甲氨基苄基)-1，6-二氨基己烷在25℃下，在黑暗中，在氮气气氛下，将4-二甲氨基苯甲醛(1.00克，6.70毫摩尔)，硫酸钠(6.7克，47.2毫摩尔，7.04克当量)和1，6-二氨基己烷(3.89克，33.5毫摩尔，5.00克当量)在20毫升无水EtOH中的悬浮液搅拌18小时。这时，对溶液进行过滤并将NaBH4(1.73克，45.8毫摩尔，6.84克当量)添加至滤液中。在25℃下将悬浮液搅拌5小时。这时，将反应混合物浓缩，并将残余物溶解于50毫升水中，再用3×50毫升乙醚进行萃取。用2×50毫升水对混合的有机萃取物进行洗涤。用2×50毫升乙醚对混合的含水提取物进行萃取。在无水硫酸钠上对混合的有机萃取物进行干燥，过滤并浓缩，以便得到粘性油(1.35克(81％))。
TLCMerck硅胶60板，Rf0.58(80/15/5 CH2Cl2/CH3OH/iPrNH2)，利用茚三酮着色剂、UV(254/366)观察。
HPLCHP 1100HPLC色谱仪，水5×100mm NovaPak HR C18柱，0.050毫升注入，0.75毫升/分钟，1.5毫升注入回路，检测波长280nm，A＝水(0.1％HFBA)，B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B2分钟，10-80％B18分钟，80-100％B2分钟，100％B2分钟，停留时间13.3分钟。
N-2-[5-(N-4-二甲氨基苄基)氨己基]氨乙基)-4-丁氨基-1，8-萘酰亚胺。
向N-(2-氧乙基)-4-丁氨基-1，8-萘酰亚胺(0.346克，1.11毫摩尔)在25毫升无水甲醇中的悬浮液中添加N-(4-二甲氨基苄基)1，6-二氨基己烷(0.554克，2.22毫摩尔，2.00克当量)和乙酸(0.067克，1.11毫摩尔，1.0克当量)在20毫升无水甲醇中的溶液。向该混合物中添加NaCNBH3(0.070克，1，1毫摩尔，1.0克当量)在5毫升无水甲醇中的溶液。在25℃将反应混合物搅拌15小时。这时，通过旋转蒸发除去甲醇，并将残余物溶解于30毫升水中。利用1N的HCl将溶液的pH调节至2，然后在25℃搅拌1小时。这时，利用1N的NaOH将溶液的pH调节至12，然后用3×50毫升CH2Cl2进行萃取。用3×50毫升水对混合的有机萃取物进行洗涤，在无水硫酸钠上进行干燥，过滤并浓缩，以便得到粗制的棕色油。通过硅胶色谱法(35克闪蒸级凝胶，0-50％CH3OH/CH2Cl2，然后45/50/5CH3OH/CH2Cl2/iPrNH2)对该原料进行提纯，从而得到0.190克(32％)二胺产物。
FAB MS对于C33H45N5O2，计算值[M]+554；测量值[M]+554。
TLCMerck硅胶60板，Rf 0.42(80/20CH2Cl2/CH3OH)，利用茚三酮着色剂和UV(254/366)观察。
HPLCHP 1100HPLC色谱仪，水5×100mm NovaPak HR C18柱，0.050毫升注入，0.75毫升/分钟，1.5毫升注入回路，检测波长450nm，A＝水(0.1％HFBA)，B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B2分钟，10-80％B18分钟，80-100％B2分钟，100％B2分钟，停留时间17.6分钟。
N-2-[5-(N-4-二甲氨基苄基)-5-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]氨基己基]-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]氨乙基-4-丁氨基-1，8-萘酰亚胺。
向N-2-[5-(N-4-二甲氨基-苄基)氨己烷]氨乙基)-4-丁氨基-1，8-萘酰亚胺(0.150克，0.276毫摩尔)和DIEA(0.355克，0.478毫升，2.81毫摩尔，10.0克当量)在5毫升三氯甲烷中的溶液中添加(2-溴乙基苯基)硼酸新戊基酯(0.390克，1.38毫摩尔，5.00克当量)在2毫升CHCl3中的溶液。然后，在25℃对该溶液搅拌27小时。这时，对该混合物进行浓缩并通过氧化铝柱色谱法(100克激活的中性氧化铝，0-5％CH3OH/CH2Cl2)对残余物进行提纯，从而得到0.024克(19％)的粘性棕色油。
FAB MS(甘油基体)对于C53H67B2N5O8，计算值为[M]+924(二甘油加合物替代硼酸的二新戊基酯)；测量值为[M]+924
TLCMerck中性氧化铝板，Rf0.62(80/20CH2Cl2/CH3OH)，利用UV(254/366)观察。
HPLCHP 1100HPLC色谱仪，水5×100mm NovaPak HR C18柱，0.050毫升注入，0.75毫升/分钟，1.5毫升注入回路，检测波长450nm，A＝水(0.1％HFBA)，B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B2分钟，10-80％B18分钟，80-100％B2分钟，100％B2分钟，停留时间20.7分钟。
nBuF-二甲苯-Q二-硼酸酯 N-2-[4-(N-4-二甲氨基苄基)-[2-(二羟硼基)苄基]氨基-甲基]苄基-[2-(二羟硼基)苄基]氨乙基-4-丁氨基-1，8-萘酰亚胺(nBuF-二甲苯-Q二-硼酸酯)将1-[N-(4-二甲氨基苄基)氨基]甲基-4-氨甲基苯用作二胺偶联配偶，采用类似于N-2-[5-(N-4-二甲氨基苄基)-5-[2-(二羟硼基)苄基]-氨己基]-[2-(二羟硼基)苄基]氨乙基-4-丁氨基-1，8-萘酰亚胺(nBuF-hexa-Q-二硼酸酯)的方式，制备所述化合物。
对比指示剂分子NBuF单-硼酸酯
N-2-(羧甲基)-2-[2-(二羟硼基)苄基]氨乙基-4-丁氨基-1，8-萘酰亚胺(nBuF单-硼酸酯) N-2-(叔丁氧基羰基)氨乙基-4-溴-1，8-萘酰亚胺在45℃，将4-溴-1，8-萘二甲酸酐(1.00克，3.61毫摩尔)和N-(叔-丁氧基羰基)-1，2-二氨基乙烷(0.578克，3.61毫摩尔，1.00克当量)在20毫升EtOH中的悬浮液搅拌2小时。这时，在15分钟内将温度升至150℃。随后，使反应混合物冷却至25℃并再搅拌15小时。在这时候，将得到的悬浮液过滤，用EtOH进行洗涤，并对残余物进行干燥，得到1.03克(68％)浅棕色固态产物。
TLCMerck硅胶60板，Rf0.63(95/5 CH2Cl2/CH3OH)，利用UV(254/366)观察。
N-2-(叔-丁氧基羰基)氨乙基-4-丁氨基-1，8-萘酰亚胺在45℃下，将N-(叔-丁氧基羰基)氨乙基-4-溴-1，8-萘酰亚胺(0.900克，2.15毫摩尔)和正-丁基氨(0.786克，1.06毫升，10.7毫摩尔，5.01克当量)在5毫升NMP中的溶液加热17小时。在这时候，添加第二份正-丁胺(0.786克，1.06毫升，10.7毫摩尔，5.01克当量)。在25℃对得到的溶液搅拌23小时。这时，在真空下对混合物进行浓缩。通过硅胶色谱法(50克重力级凝胶，0％，然后4％CH3OH/CH2Cl2分段梯度)对残余物进行提纯，从而得到0.97克含残余NMP的粘性黄色固体。照现在的样子，对该材料继续进行试验。
FAB MS对于C23H29N3O4，计算值为[M]+411；测量值为[M]+411。
TLCMerck硅胶60板，Rf 0.60(95/5 CH2Cl2/CH3OH)，利用UV(254/366)观察。
N-2-氨乙基-4-丁氨基-1，8-萘酰亚胺单三氟乙酸盐在25℃，将N-2-(叔-丁氧基羰基)氨乙基-4-溴-1，8-萘酰亚胺(0.92克，2.24毫摩尔)在20毫升20％三氟乙酸/CH2Cl2中的溶液搅拌19小时。这时，在氮气流下对反应混合物进行浓缩。利用醚对残余物进行粉碎，并将得到的固体在真空中干燥，以得到0.772克(81％)橙色粉末。
FAB MS对于C18H21N3O2，计算值为[M]+311；测量值为[M]+312。
HPLCHP 1100HPLC色谱仪，Vydac 201TP 10×250mm柱，0.100毫升注入，2毫升/分钟，检测波长450nm，A＝水(0.1％HFBA)，B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B 2分钟，在18分钟内10-80％B，在2分钟内80-100％B，100％B2分钟，停留时间19.5分钟。
N-2-[(叔-丁氧基羰基)甲基]氨乙基-4-丁氨基-1，8-萘酰亚胺在25℃，将N-2-氨乙基-4-丁氨基-1，8-萘酰亚胺单三氟乙酸盐(0.99克，0.23毫摩尔)，DIEA(0.167克，0.225毫升，1.29毫摩尔，5.55克当量)和溴乙酸叔-丁酯(0.032克，0.024毫升，0.16毫摩尔，0.70克当量)在2.5毫升CH2Cl2中的溶液搅拌23小时。在这时候，添加25毫升CH2Cl2，用1×25毫升饱和的NaHCO3对该溶液进行洗涤，在无水Na2SO4上对有机萃取物进行干燥，过滤并浓缩。通过硅胶色谱法(15克重力级凝胶，0％-4％CH3OH/CH2Cl2)对残余物进行提纯，从而得到0.051克(73％)黄色玻璃状固体。
TLCMerck硅胶60板，Rf 0.27(95/5 CH2Cl2/CH3OH)，利用UV(254/366)观察 N-2-[(叔-丁氧基羰基)甲基]-2-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]氨乙基-4-丁氨基-1，8-萘酰亚胺在25℃，将N-2-[(叔-丁氧基羰基)甲基]-氨乙基-4-丁氨基-1，8萘酰亚胺(0.051克，0.12毫摩尔)，DIEA(0.78克，0.11毫升，0.60毫摩尔，5.0克当量)和(2-溴甲苯基)硼酸新戊基酯(0.083克，0.29毫摩尔，2.4克当量)在10毫升CH2Cl2中的溶液搅拌72小时。这时，对该混合物进行浓缩并通过硅胶色谱法(10克重力级凝胶，0-1％CH3OH/CH2Cl2)进行提纯，从而得到0.035克(47％)玻璃状的橙色固体。照现在的样子，对该产物继续进行试验。
TLCMerck硅胶60板，Rf 0.39(95/5 CH2Cl2/CH3OH)，利用UV(254/366)观察。
N-2-(羧甲基)-2-[2-(二羟硼基)苄基]氨乙基-4-丁氨基-1，8-萘酰亚胺(nBuF单-硼酸酯)在25℃，将N-2-[(叔-丁氧基羰基)-甲基]-2-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]氨乙基-4-丁氨基-1，8-萘酰亚胺(0.035克，0.056毫摩尔)在5毫升20％TFA/CH2Cl2中的溶液搅拌16小时。在这时候，在氮气流下对该溶液浓缩，并用乙醚对残余物进行粉碎，以便得到橙色固体。通过硅胶色谱法(8克重力级凝胶，0-5％CH3OH/CH2Cl2)对该原料进行提纯，从而得到0.011克(39％)的黄色/橙色固体。
FAB MS对于C30H34BN3O7，计算值为[M]+559(单甘油加合物)；测量值为[M]+560。
TLCMerck硅胶60板，Rf 0.26(95/5 CH2Cl2/CH3OH)，利用UV(254/366)观察。
荧光的调控确定了葡萄糖对本实施例中制备的三种化合物的荧光的调控。
图1示出了nBuF-hexa-Q二硼酸酯(“hexa-Q”)指示剂(0.015mM)，nBuF-二甲苯-Q二-硼酸酯(“二甲苯Q”)指示剂(0.049mM)和nBuF单-硼酸酯对比指示剂(0.029mM)在包含0-20mM葡萄糖的70/30MeOH/PBS溶液中的标准化的荧光发射(I/Io，在535nm)。利用Shimadzu RF-5301光谱荧光计记录光谱，其中激励在450nm；激励缝隙1.5nm；发射缝隙1.5nm；环境温度。误差线是每个数据点三重值的标准偏差。
数据表明nBuF单-硼酸酯指示剂化合物的荧光不受葡萄糖的存在的影响。NBuF-二甲苯-Q二硼酸酯指示剂化合物的荧光或多或少地受葡萄糖的影响，而nBuF-hexa-Q二-硼酸酯指示剂化合物的荧光在0-5mM的范围内大大地受葡萄糖的影响。据信，在没有葡萄糖的情况下，在hexa-Q化合物中相对柔韧的六亚甲基连接使得N-4-二甲氨基苄基猝灭基团能够充分地接近萘酰亚胺荧光基团，从而有效地猝灭后者的荧光。在有葡萄糖的情况下，两个硼酸识别单元将参与葡萄糖连接，因此将改变指示剂的分子构型，并使荧光基团和猝灭基团充分地分离，以便使荧光发射去猝灭(dequenched)。对于二甲苯-Q化合物可以看到同样的作用，但由于二甲苯连接剂不太柔韧，因此其作用程度要小得多，因此，在葡萄糖连接时，荧光基团和猝灭基团之间只允许有较小的分离。
对比化合物包含荧光基团但是没有猝灭基团。对比化合物在没有葡萄糖的情况下发射荧光，当添加葡萄糖时其荧光不受影响。
实施例2 氨基乙氧基F-hexa-C二-硼酸酯 氨基乙氧基F-hexa-C二-硼酸酯
N-2-[5-(N-4-二甲氨基苄基)-5-[2-(二羟硼基)苄基]-氨基己基]-[2-(二羟硼基)苄基]氨乙基-4-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基乙基]氨基-1，8-萘酰亚胺(氨基乙氧基F-hexa-Q二-硼酸酯)借助下列改进，用类似于N-2-[5-(N-4-二甲氨基苄基)-5-[2-(二羟硼基)苄基]-氨基己基]-[2-(二羟硼基)苄基]氨乙基-4-丁基氨基-1，8-萘酰亚胺(nBuF-hexa-Qbis-boronate)的方式制备该化合物。直至二胺中间物的二苄基硼化作用完成之后，才将1，8-萘酰亚胺部分的4-溴位置置换成2-(2-氨基乙氧基)乙氧基乙基)氨基基团。在与合成N-(2，2-二乙氧基乙基)-4-丁氨基-1，8萘酰亚胺中添加丁胺相同的条件下，通过添加2，2′-(乙二氧基)二(乙胺)而进行该最终步骤。
氨基乙氧基F-hexa-C二-硼酸酯 N-2-[5-苄基-5-[2-(二羟硼基)苄基]氨基己基]-[2-(二羟硼基)苄基]氨乙基-4-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基乙基]氨基-1，8-萘酰亚胺(aminoethoxyF-hexa-C bis-boronate)将N-苄基-1，6-二氨基己烷用作二胺偶联的配偶，用类似于N-2-[5-(N-4-二甲氨基苄基)-5-[2-(二羟硼基)苄基]-氨基己基]-[2-(二羟硼基)苄基]氨乙基-4-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基乙基]氨基-1，8-萘酰亚胺(氨基乙氧基F-hexa-Qbis-boronate)的方式制备该化合物。
荧光的调控确定了葡萄糖对本实施例中制备的三种化合物的荧光的调控。图2示出了氨基乙氧基F-hexa-Q二-硼酸酯指示剂(0.197mM)和氨基乙氧基F-hexa-C-二硼酸酯对比指示剂在包含0-20mM葡萄糖的70/30MeOH/PBS溶液中的标准化的荧光发射(I/Io在535nm)。利用ShimadzuRF-5301光谱荧光计记录光谱，其中激励在450nm；激励缝隙1.5nm；发射缝隙1.5nm；环境温度。误差线是每个数据点二重值的标准偏差。
数据表明hexa-C指示剂化合物的荧光不受葡萄糖存在的影响，而hexa-Q指示剂化合物的荧光在0-10mM范围内大大地受葡萄糖的影响。据信，在没有葡萄糖的情况下，在hexa-Q化合物中相对柔韧的六亚甲基连接使得N-4-二甲氨基苄基猝灭基团能够充分地接近萘酰亚胺荧光基团，从而有效地猝灭后者的荧光。在有葡萄糖的情况下，两个硼酸识别单元将参与葡萄糖连接，因此将改变指示剂的分子构型，并使荧光基团和猝灭基团充分地分离，以便使荧光发射去猝灭(dequenched)。
hexa-C化合物与hexa-Q化合物是同等的，但缺少有效猝灭萘酰亚胺荧光基团所需的二甲氨基基团。在没有葡萄糖的情况下，hexa-C化合物发射荧光，当添加葡萄糖时其荧光不受影响。
下列实施例3-5阐明了葡萄糖检测方法，其中指示系统包含硼酸识别单元和儿茶酚配位体单元。该方法的一般原理由下式阐明
其中·给体是荧光基团，而受体是荧光基团或猝灭基团；·对给体和受体进行选择，以便根据分子距离将来自给体的能量传递至受体；·L1、L2、L3和L4各自独立地是具有约3-20个连接原子的化学连接基，并且包含但不限于下列取代或/和非-取代的基团(脂族基团、芳族基团、氨基、酰胺基、磺基、羰基、酮、氨磺酰基等等)；·R是包含一个或两个苯基硼酸基团的葡萄糖识别单元；·RR是能够与R的苯基硼酸衍生物形成可逆酯键的化学基团，例如，芳族二醇(例如儿茶酚)、乳酸盐、α-羟酸、酒石酸、苹果酸、葡萄糖、二乙醇胺、聚羟基邻位二醇(所有这些物质可以是取代或未取代的)，等等；·L3-6和P1-2是可有可无的基团，并且可以独立地存在；·如连接基团L1-4所定义的那样，L5和L6是连接基团，或者是由例如丙烯酰胺、丙烯酸酯、聚乙二醇或其它亲水聚合物组成的聚合物链；和·P1和P2是亲水的或憎水的聚合物。
当R和RR能够在自由溶液中相互作用时，或者当适当地固定至亲水聚合物上时，给体和受体将彼此充分接近，以便能量能够相对有效地从给体转移至受体(例如，通过FRET、碰撞能量转移等等)。当葡萄糖添加至所述溶液中时，它将与RR竞争与R(硼酸酯)的连接，从而使RR-R＝RR+R的平衡向右移动。当游离于溶液中时或利用相对长且柔韧的连接剂固定至聚合物上时，R-给体和RR-受体部分能够彼此移开，并降低给体和受体之间的能量转移效率，从而使荧光发射增加。
实施例3在N-α-(3-硼酸根合-5-硝基)苯甲酰基-N-ε-(4-二甲氨基-3，5-二硝基)苯甲酰赖氨酸(猝灭剂-硼酸加合物)存在下，葡萄糖对磷酸盐缓冲盐水中N-(5-甲氧羰基-5-[3，4-二羟基苯甲酰氨基]戊基)-N′-(5-荧光素基)硫脲(荧光素-儿茶酚加合物)荧光发射的作用。
荧光素-儿茶酚加合物猝灭剂-硼酸加合物 N-α-(3，4-二羟基苯甲酰基)-N-εt-B0C-赖氨酸甲酯将3，4-二羟基苯甲酸(820毫克，5.3毫摩尔)和N-ε-t-BOC-赖氨酸甲酯(1.38克，5.31毫摩尔)溶解于50毫升EtOAc/THF(1/1，无水的)中。将二环己基碳二亚胺(1.24克，6毫摩尔)添加至该溶液中。对反应混合物搅拌24小时，过滤，并蒸发掉溶剂。将获得的固体溶解于EtOAc(50毫升)中并用磷酸盐缓冲液(200mM，pH＝6.5)2×50毫升进行萃取。用盐水对乙酸乙酯溶液进行洗涤，分离，用Na2SO4干燥，和蒸发，得到1.89克的固体(90％收率)。通过TLC提纯该化合物并用于下一步。
N-α-(3，4-二羟基苯甲酰基)-赖氨酸甲酯三氟醋酸盐将N-α-(3，4-二羟基苯甲酰基)-N-ε-t-BOC-赖氨酸甲酯(840毫克，2.12毫摩尔)与10毫升的CH2Cl2，3毫升的三氟乙酸，和1毫升的三异丙基硅烷混合。在室温搅拌过夜之后，对该溶液进行蒸发，用乙醚对得到的残余物进行洗涤，并在真空下进行干燥，得到808毫克(93％)。
HPLCHP 1100高压液相色谱仪，水5×100毫米NovaPak HR C18柱，0.100毫升注入，0.75毫升/分钟，2毫升注入回路，检测波长370nm，A＝水(0.1％HFBA)和B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B2分钟，在18分钟内10-80％B，在2分钟内80-100％B，100％B2分钟，停留时间10.78分钟。
N-(5-甲氧羰基-5-[3，4-二羟基苯甲酰氨基]戊基)-N’-(5-荧光素基)硫脲将N-α-(3，4-二羟基苯甲酰基)-赖氨酸甲酯三氟醋酸盐(60毫克，0.146毫摩尔)，异硫氰酸荧光素(50毫克，0.128毫摩尔)，和二异丙基乙胺(129毫克，1毫摩尔)与1毫升无水DMF混合。对反应混合物搅拌5小时，然后蒸发掉溶剂。采用二氧化硅(10克)色谱法提纯，其中使用CH2Cl2/MeOH(80/20体积)作为洗脱液。分离出产物-68毫克，(77％产率)。
FAB MS对于C35H31N3O10S，计算值为M＝685；测量值为M+1＝686。
HPLCHP 1100高压液相色谱仪，水5×100毫米NovaPak HR C18柱，0.100毫升注入，0.75毫升/分钟，2毫升注入回路，检测波长370nm，A＝水(0.1％HFBA)和B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B2分钟，在18分钟内10-80％B，在2分钟内80-100％B，100％B2分钟，停留时间16.59分钟。
N-α-(3-硼酸根合-5-硝基)苯甲酰基)-N-ε-t-BOC-赖氨酸甲酯将(3-羧基-5-硝基苯基)硼酸(536毫克，2.54毫摩尔)，N-ε-t-BOC-赖氨酸甲酯氢氯化物(776毫克，2.61毫摩尔)，和二苯基磷酰基叠氮化物(718毫克，2.6毫摩尔)与5毫升无水DMF混合。将二异丙基乙胺(1.3毫升，7.5毫摩尔)添加至DMF溶液中。然后，在室温对该溶液搅拌24小时。在真空下蒸发掉DMF，将残余物溶解于50毫升的EtOAc中，并用H2O(3×50毫升)对EtOAc溶液进行萃取。用盐水萃取之后，分离有机相，用Na2SO4干燥，并蒸发掉溶剂，得到880毫克的产物(76％收率)。照现在的样子，对该产物继续进行试验。
HPLCHP 1100HPLC色谱仪，水5×100mm NovaPak HR C18柱，0.050毫升注入，0.75毫升/分钟，1.5毫升注入回路，检测波长450nm，A＝水(0.1％HFBA)，B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B2分钟，10-80％B18分钟，80-100％B2分钟，100％B2分钟，停留时间17.87分钟。
N-α-(3-硼酸根合-5-硝基)苯甲酰基-赖氨酸甲酯三氟醋酸盐将N-α-(3-硼酸根合-5-硝基)苯甲酰基-N-ε-t-BOC-赖氨酸甲酯(800毫克，1.76毫摩尔)与10毫升的CH2Cl2，3毫升的三氟乙酸，和1毫升的三异丙基硅烷混合。在室温下搅拌过夜之后，对该溶液进行蒸发，用乙醚对得到的残余物进行洗涤，并在真空下进行干燥。得到715毫克(87％)。照现在的样子，对该产物继续进行试验。
N-α-(3-硼酸根合-5-硝基)苯甲酰基-N-ε-(4-二甲氨基-3，5-二硝基)苯甲酰赖氨酸甲酯。
在黑暗中，25℃下将N-(3-硼酸根合-5-硝基)苯甲酰基-赖氨酸甲酯三氟醋酸盐(0.198克，0.42毫摩尔)，DIEA(0.167克，0.225毫升，1.29毫摩尔，3.05克当量)，4-二甲氨基-3，5-二硝基苯甲酸(0.120克，0.47毫摩尔，1.11克当量)和二苯基磷酰基叠氮化物(0.130克，0.47毫摩尔，1.11克当量)在3毫升DMF中的溶液搅拌23小时。在这时候，添加50毫升EtOAc，并在100mM磷酸盐缓冲液(pH6.5)(2×20毫升)中洗涤，然后1×25毫升NaCl(饱和水溶液)对该溶液进行洗涤。在无水硫酸钠上对有机萃取物进行干燥，过滤并浓缩，以便得到粗的橙色固体。通过硅胶柱色谱法(10克重力级凝胶，0-5％CH3OH/CH2Cl2)对该残余物进行提纯，从而得到0.0974克(39％)的黄色/橙色固体。照现在的样子，对该产物继续进行试验。
TLCMerck硅胶60板，Rf 0.60(80/20 CH2Cl2/CH3OH)，利用UV(254/366)观察。
HPLCHP 1100HPLC色谱仪，水5×100mmNovaPak HR C18柱，0.050毫升注入，0.75毫升/分钟，1.5毫升注入回路，检测波长450nm，A＝水(0.1％HFBA)，B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B2分钟，10-80％B18分钟，80-100％B2分钟，100％B2分钟，停留时间18.91分钟。
N-α-(3-硼酸根合-5-硝基)苯甲酰基-N-ε-(4-二甲氨基-3，5-二硝基)苯甲酰赖氨酸。
在25℃，对N-α-(3-硼酸根合-5-硝基)苯甲酰基-N-ε-(4-二甲氨基-3，5-二硝基)苯甲酰赖氨酸甲酯(0.095克，0.16毫摩尔)在4毫升的1∶1Na2CO3(0.2M水溶液)∶EtOH中的溶液搅拌1小时，然后在45℃搅拌1.5小时。在这时候，在真空下对该混合物进行浓缩，然后添加25毫升5％TFA/CH2Cl2。用2×10毫升水对该混合物进行洗涤，再将25毫升5％的TFA/CH2Cl2添加至有机层。在无水硫酸钠上对有机萃取物进行干燥，过滤并浓缩，以便得到0.088克(95％)橙色粉末。
FAB MS甘油基体；对于C25H29BN6O13(单甘油加合物)，[M]+计算值为632；[M+1]+测量值为633。
HPLCHP 1100HPLC色谱仪，水5×100mmNovaPakHRC18柱，0.050毫升注入，0.75毫升/分钟，1.5毫升注入回路，检测波长450nm，A＝水(0.1％HFBA)，B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B2分钟，10-80％B18分钟，80-100％B2分钟，100％B2分钟，停留时间17.66分钟。
荧光调控图3示出了2μM的荧光素-儿茶酚加合物在包含30μM猝灭剂-硼酸加合物的PBS溶液中的荧光发射(在518nm处的I)。葡萄糖的浓度在0-160mM之间改变。利用Shimadzu RF-5301光谱荧光计记录光谱，其中激励在495nm；激励缝隙3nm；发射缝隙5nm；低PMT灵敏度，环境温度。通过添加葡萄糖猝灭能力将降低。
实施例4在N-α-(3-硼酸根合-5-硝基)苯甲酰基-N-ε-(4二甲氨基-3，5-二硝基)苯甲酰赖氨酸(猝灭剂-硼酸加合物)存在下，葡萄糖对磷酸盐缓冲盐水中的N-α-(3，4-二羟基苯甲酰基)-N-ε-(5-二甲氨基萘-1-磺酰)赖氨酸(DANSYL-儿茶酚加合物)的荧光发射的作用。
DANSYL-儿茶酚加合物 猝灭剂-硼酸加合物 N-α-(3，4-二羟基苯甲酰基)-N-ε-(5-二甲氨基-萘-1-磺酰)-赖氨酸甲酯
将N-α-(3，4-二羟基苯甲酰基)-赖氨酸甲酯三氟醋酸盐(205毫克，0.5毫摩尔，参见实施例3的合成)和丹磺酰氯(162毫克，06毫摩尔)与2毫升无水DMF混合。将二异丙基乙胺(224毫克，1.7毫摩尔)添加至DMF溶液中。在室温下对该溶液搅拌5小时然后，在真空下蒸发掉DMF。使残余物经受硅胶色谱法(CH2Cl2/MeOH，98/2体积)。所得到的产物是黄色固体-240毫克(90％产率)。
FAB MS对于C29H31N3O7S，计算值为M＝529；测量值为M+1＝530。
HPLCHP 1100高压液相色谱仪，水5×100毫米NovaPak HR C18柱，0.100毫升注入，0.75毫升/分钟，2毫升注入回路，检测波长370nm，A＝水(0.1％HFBA)和B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B2分钟，在18分钟内10-80％B，在2分钟内80-100％B，100％B2分钟，停留时间15.45分钟。
N-α-(3，4-二羟基苯甲酰基)-N-ε-(5-二甲氨基-萘-1-磺酰)-赖氨酸将N-α-(3，4-二羟基苯甲酰基)-N-ε-(5-二甲氨基-萘-1-磺酰)-赖氨酸甲酯(200毫克，0.38毫摩尔)和250毫克的Na2CO3与10毫升的EtOH/H2O(1/1体积)混合。在55℃对混合物搅拌6小时。在真空下蒸发掉溶剂，并添加1毫升的三氟乙酸，以中和过量的碱，将50毫升的EtOAc添加至混合物中，并用H2O(2×40毫升)对溶液进行萃取。分离有机相，用无水硫酸钠进行干燥，蒸发以便得到190毫克固体(产率97％)。
HPLCHP 1100高压液相色谱仪，水5×100毫米NovaPak HR C18柱，0.100毫升注入，0.75毫升/分钟，2毫升注入回路，检测波长370nm，A＝水(0.1％HFBA)和B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B2分钟，在18分钟内10-80％B，在2分钟内80-100％B，100％B2分钟，停留时间14.26分钟。
N-α-(3-硼酸根合-5-硝基)苯甲酰基-N-ε-(4-二甲氨基-3，5-二硝基)苯甲酰赖氨酸 参见用于合成的实施例。
荧光调控图4示出了在包含120μM猝灭剂-硼酸加合物的PBS中丹磺酰-儿茶酚加合物30μM溶液的荧光发射(在545nm处的I)。葡萄糖的浓度在0-120mM之间改变。利用Shimadzu RF-5301光谱荧光计记录光谱，其中激励在350nm；激励缝隙3nm；发射缝隙5nm；高PMT灵敏度，环境温度。通过添加葡萄糖猝灭能力将降低。
实施例5葡萄糖对包含N-α-(3，4-二羟基苯甲酰基)-N-ε-(5-二甲氨基萘-1-磺酰)-赖氨酸N-3-(甲基丙烯酰氨基)丙基羧酰胺(丹磺酰-儿茶酚单体)和N-α-(3-硼酸根合-5-硝基)苯甲酰基-N-ε-(4-二甲氨基-3，5-二硝基)苯甲酰赖氨酸N-3-(甲基丙烯酰氨基)丙基羧酰胺(猝灭剂-硼酸单体)的丙烯酰胺凝胶荧光发射的作用。
丹磺酰-儿茶酚单体 猝灭剂-硼酸单体
N-α-(3，4-二羟基苯甲酰基)-N-ε-(5-二甲氨基-萘-1-磺酰)-赖氨酸N-3-(甲基丙烯酰氨基)-丙基羧酰胺将N-α-(3，4-二羟基苯甲酰基)-N-(-(5-二甲氨基-萘-1-磺酰)-赖氨酸(75毫克，0.15毫摩尔；关于合成，参见实施例4)，3-氨基丙基甲基丙烯酰胺盐酸盐(30毫克，0.17毫摩尔)，二异丙基乙胺(0.1毫升，0.5毫摩尔)，和2毫升无水DMF混合。1-[3-(二甲氨基)-丙基]-3-乙基碳二亚胺氢氯化物(40毫克，0.2毫摩尔)溶解于2毫升的无水CH2Cl2中。混合DMF和CH2Cl2并在室温下搅拌20小时。在真空下蒸发掉溶剂，并使残余物经受二氧化硅(7克)色谱法，从而生产出18毫克的产物(19％收率)。
FAB MS对于C32H41N5O7S，计算值为M＝640；测量值为M+1＝640。
HPLCHP 1100高压液相色谱仪，水5×100毫米NovaPak HR C18柱，0.100毫升注入，0.75毫升/分钟，2毫升注入回路，检测波长370nm，A＝水(0.1％HFBA)和B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B2分钟，在18分钟内10-80％B，在2分钟内80-100％B，100％B2分钟，停留时间14.78分钟。
N-α-(3-硼酸根合-5-硝基)苯甲酰基-N-ε-(4-二甲氨基-3，5-二硝基)苯甲酰赖氨酸N-3-(甲基丙烯酰氨基)丙基-羧酰胺。
在25℃，在黑暗中，将3-氨丙基甲基丙烯酰胺盐酸盐(0.013克，0.073毫摩尔，1.2克当量)，DIEA(0.025克，0.034毫升，0.19毫摩尔，3.2克当量)，N-α-(3-硼酸根合-5-硝基)苯甲酰基-N-ε-(4-二甲氨基-3，5-二硝基)苯甲酰赖氨酸(0.035克，0.061毫摩尔；对于合成参见实施例3)，二苯基磷酰基叠氮化物(0.019克，0.015毫升，0.069毫摩尔，1.1克当量)和约2毫克BHT在1毫升无水DMF中的溶液搅拌23.5小时。在这时候，添加60毫升EtOAc，并用200mM磷酸盐缓冲液(pH6.5)(2×20毫升)洗涤，然后1×20毫升NaCl(饱和水溶液)对该溶液进行洗涤。在无水硫酸钠上对有机萃取物进行干燥，过滤并浓缩，以便得到橙色固体。用醚对该固体进行粉碎并干燥，以得到0.028克(65％)的橙色粉末。
FAB MS甘油基体；对于C32H41BN8O13(单甘油加合物)，计算值[M]+756；测量值[M+1]+757。
HPLCHP 1100HPLC色谱仪，水5×100mmNovaPakHRC18柱，0.050毫升注入，0.75毫升/分钟，1.5毫升注入回路，检测波长450nm，A＝水(0.1％HFBA)，B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B2分钟，10-80％B18分钟，80-100％B2分钟，100％B2分钟，停留时间17.98分钟。
包含N-α-(3，4-二羟基苯甲酰基)-N-ε-(5-二甲氨基萘-1-磺酰)-赖氨酸N-3-(甲基丙烯酰氨基)丙基羧酰胺和N-α-(3-硼酸根合-5-硝基)苯甲酰基-N-ε-(4-二甲氨基-3，5-二硝基)苯甲酰赖氨酸N-3-(甲基丙烯酰氨基)丙基羧酰胺的丙烯酰胺凝胶的制备制备丙烯酰胺(20％wt.)和N，N′-亚甲基二丙烯酰胺(0.6％wt.)在乙二醇中的溶液。将N-α-(3，4-二羟基苯甲酰基)-N-ε-(5-二甲氨基萘-1-磺酰)-赖氨酸N-3-(甲基丙烯酰氨基)丙基羧酰胺(0.75毫克，1.6×10-6摩尔)，N-α-(3-硼酸根合-5-硝基)苯甲酰基-N-ε-(4-二甲氨基-3，5-二硝基)苯甲酰赖氨酸N-3-(甲基丙烯酰氨基)丙基羧酰胺(3.5毫克，5×10-6摩尔)，和30毫升过硫酸铵水溶液(5％wt)与0.5毫升乙二醇单体溶液混合。将得到的溶液置于用氮清洁的干燥箱中。将N，N，N′，N′-四甲基乙二胺(30μL，5％wt)添加至单体制剂中，以加速聚合。将得到的制剂倒入由显微镜载玻片和100μ的不锈钢隔片构成的模具中。在氮气氛中保持8小时之后，将模具置于磷酸盐缓冲盐水(PBS)(10mM PBS，pH＝7.4)中，分离显微镜载玻片，并将水凝胶取出。用包含1mM月桂烷硫酸酯钠盐和1mM EDTA钠盐的100毫升PBS，对该水凝胶洗涤3天，溶液每天都发生改变，然后用DMF/PBS(10/90体积，3×100毫升)进行洗涤，最后用PBS(pH＝7.4，3×100毫升)进行洗涤。将得到的水凝胶聚合物存储于包含0.2％wt叠氮化钠和1mM EDTA钠盐的PBS(10mMPBS，pH＝7.4)中。
荧光调控图5示出了包含2mM丹磺酰-儿茶酚单体和10mM猝灭剂-硼酸单体的丙烯酰胺凝胶(20％)在PBS中的荧光发射(在532nm处的I)。将凝胶(100μm厚度)涂于PMMA比色环中。葡萄糖的浓度在0-200mM之间改变。利用Shimadzu RF-5301光谱荧光计记录光谱，其中激励在350nm；激励缝隙3nm；发射缝隙10nm；高PMT灵敏度，37℃。通过添加葡萄糖猝灭能力将降低。
实施例6 弱荧光 极弱荧光 强荧光葡萄糖对于在3，4-二羟基苯甲酸存在下蒽二-硼酸衍生物的荧光的作用PBS可溶的蒽二硼酸衍生物的制备 9，10-二[[2-(叔-丁氧基羰基)乙胺基]甲基]-蒽在黑暗中，在23℃，将β-丙氨酸叔-丁基酯盐酸盐(3.06克，16.8毫摩尔，5.09克当量)，DIEA(4.27克，5.75毫升，33.0毫摩尔，10.00克当量)和9，10-二(氯甲基)蒽(0.910克，3.31毫摩尔)在75毫升CHCl3中的溶液搅拌93小时。在这时候，对该溶液进行过滤，并用1×40毫升和2×60毫升的NaHCO3(饱和水溶液)进行洗涤。在无水硫酸钠上对有机萃取物进行干燥，过滤并浓缩，以便得到粗的黄色固体。通过硅胶柱色谱法(30克重力级凝胶，0-3％CH3OH/CH2Cl2)对该残余物进行提纯，从而得到1.06克(65％)的粘性黄-橙色物质。照现在的样子，对该产物继续进行试验。
TLCMerck硅胶60板，Rf 0.33(95/5 CH2Cl2/CH3OH)，利用UV(254/366)观察。
9，10-二[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(叔-丁氧基羰基)乙胺基]甲基]蒽在黑暗中，于23℃，将9，10-二[[2-(叔-丁氧基羰基)-乙胺基]甲基]蒽(1.60克，3.25毫摩尔)，DIEA(4.45克，6.00毫升，34.4毫摩尔，10.6克当量)和(2-溴甲基苯基)硼酸新戊基酯(4.80克，17.0毫摩尔，5.22克当量)在30毫升CHCl3中的溶液搅拌4.5小时。在这时候，将45毫升CHCl3添加至混合物中，用2×25毫升的NaHCO3(饱和水溶液)对该混合物进行洗涤。在无水硫酸钠上对有机萃取物进行干燥，过滤并浓缩，以便得到粗的带红色的油。通过氧化铝柱色谱法(100克激活的中性氧化铝，0-3％CH3OH/CH2Cl2)对该残余物进行提纯，从而得到约3.5克的橙色固体。使该产物溶解，然后形成一白沉淀(DIEA-HBr盐)。对该溶液进行过滤，浓缩滤液得到2.72克(93％)的橙色固体。照现在的样子，对产物(＞80％纯度，通过RP-HPLC)继续进行试验。
TLCMerck碱性氧化铝板，Rf 0.66(95/5 CH2Cl2/CH3OH)，利用UV(254/366)观察。
HPLC条件HP 1100HPLC色谱仪，Vydac 201TP 10×250mm柱，0.100毫升注入，2毫升/分钟，检测波长370nm，A＝水(0.1％HFBA)，B＝MeCN(0.1％HFBA)梯度10％B2分钟，在18分钟内10-80％B，在2分钟内80-100％B，100％B2分钟，停留时间23.9分钟。
9，10-二[N-(2-二羟硼基苄基)-N-[3-(丙酰基)氨基]-甲基]蒽在黑暗中，在23℃，将9，10-二[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(叔-丁氧基羰基)乙胺基]-甲基]蒽(0.556克，0.620毫摩尔)于在5毫升20％TFA/CH2Cl2中的溶液搅拌25小时。这时，在氮气流下对反应混合物进行浓缩。用3×10毫升的乙醚对该残余物进行粉碎。在真空中使残余的固体干燥，以得到0.351克(87％)的蓬松的黄色粉末。
FAB MS甘油基体；对于C42H46B2N2O10(二甘油加合物)，计算值[M]+760；测量值[M+1]+760。
HPLCHP 1100HPLC色谱仪，水5×100mm NovaPak HR C18柱，0.025毫升注入，0.75毫升/分钟，1.5毫升注入回路，检测波长360nm，A＝水(0.1％HFBA)，B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B2分钟，10-80％B18分钟，80-100％B2分钟，100％B2分钟，停留时间16.7分钟。
荧光调控图6显示了3，4-二羟基苯甲酸对在该实施例中制备的PBS中的蒽二硼酸衍生物(40μM)荧光强度(450nm)的作用。利用ShimadzuRF-5301光谱荧光计记录光谱，其中激励在370nn；激励缝隙3nm；发射缝隙3nm；高PMT灵敏度，环境温度。蒽二-硼酸衍生物发射低水平荧光，它将由于3，4-二羟基苯甲酸的存在而有效地猝灭。
图7显示了在3，4-二羟基苯甲酸(200μM)存在下，本实施例的蒽二硼酸衍生物(40μM)的标准化的荧光强度(430nm)随PBS中葡萄糖浓度的变化(菱形点)；以及相同指示剂(40μM)的标准化的荧光强度(430nm)随PBS中葡萄糖浓度的变化(方形点)。葡萄糖的浓度在0-25mM之间变化。利用Shimadzu RF-5301光谱荧光计记录光谱，其中激励在370nm；激励缝隙3nm；发射缝隙5nm；低PMT灵敏度，环境温度。在没有3，4-二羟基苯甲酸猝灭剂的情况下，将葡萄糖添加至蒽二硼酸衍生物中，将使荧光增强。在有3，4-二羟基苯甲酸猝灭剂的情况下，将葡萄糖添加至蒽二硼酸衍生物中，将使荧光显著增强。据信，该葡萄糖将从硼酸识别单元中替换3，4-二羟基苯甲酸猝灭剂，结果使荧光增加。在该实施例中，3，4-二羟基苯甲酸基不仅起检测系统猝灭部分的作用，而且还起与识别单元相互作用的配位体单元的作用。
实施例7 A.1，4-二[[4-(叔-丁氧基羰基)氨基丁氨基]甲基]苯
将对苯二甲醛(0.253克，1.89毫摩尔)，N-叔-Boc-丁二胺(0.71克，3.77毫摩尔)和硫酸钠(5.5克，40毫摩尔)与25毫升的无水甲醇混合。在室温下，对该混合物搅拌24小时，过滤掉硫酸钠，并添加NaBH4(1.5克，40毫摩尔)。4小时之后，用100毫升乙醚稀释混合物并进行过滤。使溶剂蒸发掉之后获得的残余物经硅胶柱色谱纯化，其中利用CH2Cl2/MeOH/Et3N(85/15/5体积％)作为洗脱液。所分离出的产物是白色固体(0.77克，86％收率)。在下一步中照现在的样子利用该材料。
B.1，4-二[N-[2-(频哪醇)二羟硼基苄基]-N-[[4-(叔-丁氧基羰基)氨基丁氨基]甲基]苯将2-溴甲基苯基硼酸、频哪醇酯(1.4克，4.7毫摩尔)、1，4-二[[4-(叔-丁氧基羰基)氨基丁氨基]甲基]苯(0.74克，1.56毫摩尔)，和N，N-二异丙基-N-乙胺(1.8毫升，10毫摩尔)溶解于20毫升的CH2Cl2中。在室温下对该溶液搅拌24小时，蒸发掉溶剂，并用己烷/乙醚(50/50体积，3×10毫升)对残余物进行洗涤。再通过柱色谱法(二氧化硅，90/10体积，CH2Cl2/MeOH)对产物进行提纯。得产品1.18克(收率83％)。
C.1，4-二[N-(2-二羟硼基苄基)-N-[4-氨基丁氨基]甲基]苯二(三氟乙酸)盐将1，4-二[N-[2-(频哪醇)二羟硼基苄基]-N-[[4-(叔-丁氧基羰基)氨基丁氨基]甲基]苯(1.1克，1.2毫摩尔)溶解于包含20％体积的TFA和5％体积的三异丙基硅烷的20毫升的CH2Cl2溶液中。对溶液搅拌12小时，并蒸发掉溶剂，在真空下于50℃对残余物干燥24小时。定量的收率。
FAB MS对于C42H64B2N4O4，计算值M+＝710(二频哪醇酯)，测量值M+2＝712。
HPLCHP 1100高压液相色谱仪，水5×100毫米NovaPak HR C18柱，0.100毫升注入，0.75毫升/分钟，2毫升注入回路，检测波长280nm，A＝水(0.1％HFBA)和B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B2分钟，在18分钟内10-80％B，在2分钟内80-100％B，100％B2分钟，停留时间14.6分钟。
D.3，4-二羟-9，10-二氧代-2-蒽磺酰氯将3，4-二羟基-9，10-二氧代-2-蒽磺酸钠盐(1.4克，3.9mM)与30毫升的氯磺酸混合，并在90℃加热5小时，然后，使该溶液冷却至0℃，并倒入100克冰中。在用CH2Cl2(3×100毫升)对冰溶融的溶液萃取之后，混合二氯甲烷萃取剂，用Na2SO4进行干燥并蒸发，以生产出0.87克的固体(收率66％)。
E.1-[N-(2-二羟硼基苄基)-N-[4-氨基丁氨基]甲基]-4-[N-(2-二羟硼基苄基)-N-[4-[(3，4-二羟-9，10-二氧代-2-蒽)磺酰氨基]丁氨基]甲基]-苯三氟乙酸盐将3，4-二羟-9，10-二氧代-2-蒽磺酰氯(0.095克，0.28毫摩尔)溶解于3毫升的无水的CH3CN中，并滴加至1，4-二[N-(2-二羟硼基苄基)-N-[4-氨基丁氨基]甲基]苯二(三氟乙酸盐)(1.06克，1.37毫摩尔)和N，N-二异丙基-N-乙胺(1毫升，5.8毫摩尔)在5毫升无水CH3CN中的溶液中。在搅拌4小时之后，蒸发掉溶剂并在真空下对残余物进行干燥。将残余物溶解于10毫升的CH3CN/TFA(80/20体积％)中并再次蒸发掉溶剂。将水(10毫升)添加至该残余物中，并对烧瓶进行20分钟的超声处理，接着过滤包含产物的褐色固体。进一步使用预备的HPLC提纯HP 1100高压液相色谱仪，水25×100毫米NovaPak HR C18柱，1.00毫升注入，5毫升/分钟流速，2毫升注入回路，检测波长470nm，A＝水(0.1％HFBA)和B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B2分钟，在18分钟内10-80％B，在2分钟内80-100％B，100％B2分钟，停留时间18.5分钟。得到产物198毫克(收率79％)。就在MeOH/PBS(1/1，体积比)溶液(pH＝7.4)中，对该化合物与D-葡萄糖的相互作用进行测试，通过对吸收光谱的监测对相互作用进行评估。
F.1-[N-(2-二羟硼基苄基)-N-[4-(甲基丙烯酰氨基)丁氨基]甲基]-4-[N-(2-二羟硼基苄基)-N-[4-[(3，4-二羟-9，10-二氧代-2-蒽)磺酰氨基]丁氨基]甲基]-苯将1-[N-(2-二羟硼基苄基)-N-[4-氨基丁氨基]甲基]-4-[N-(2-二羟硼基苄基)-N-[4-[(3，4-二羟基-9，10-二氧代-2-蒽)磺酰氨基]丁氨基]甲基]苯三氟乙酸盐(30毫克，3.34×10-5摩尔)溶解于1毫升的无水甲醇中。添加根据J.Am.Chem.Soc.(1999，121(15)，3617)制备的甲基丙烯酸NHS酯 (10毫克，5.46×10-5摩尔)，然后添加0.01毫升的Et3N。将该溶液搅拌10小时。在真空下蒸发掉溶剂，并用水对固体进行洗涤。RP-HPLC分析表明在固体中没有原材料。在真空下对得到的固体进行干燥，并照现在的样子聚合成水凝胶薄膜。
G.包含1-[N-(2-二羟硼基苄基)-N-[4-(甲基丙烯酰氨基)丁氨基]甲基]-4-[N-(2-二羟硼基苄基)-N-[4-[(3，4-二羟基-9，10-二氧代-2-蒽)磺酰氨基]丁氨基]甲基]-苯的N-N-二甲基丙烯酰胺水凝胶薄膜的制备制备N，N-二甲基丙烯酰胺(40％重量)和N，N′-亚甲基二丙烯酰胺(0.8％重量)和D-果糖(200mM)在DMF中的溶液。将1-[N-(2-二羟硼基苄基)-N-[4-(甲基丙烯酰氨基)丁氨基]甲基]-4-[N-(2-二羟硼基苄基)-N-[4-[(3，4-二羟基-9，10-二氧代-2-蒽)磺酰氨基]丁氨基]甲基]-苯(30毫克)溶解于包含单体和D-果糖的0.5毫升DMF溶液。将含水过硫酸铵(20μL，5％重量)与该配方混合。将得到的溶液置于用氮清洗的手套箱中。将N，N，N′，N′-四甲基乙二胺的水溶液(20μL，5％wt)添加至单体配方中，以加速聚合。将得到的制剂倒入由显微镜载玻片和100μM的不锈钢隔片构成的模具中。在氮气氛中保持8小时之后，将模具置于磷酸盐缓冲盐水(10mM pi，pH＝7.4)中，分离显微镜载玻片，并将水凝胶取出。用包含1mM月桂烷硫酸酯钠盐和1mM EDTA钠盐的磷酸盐缓冲盐水(PBS)100毫升，对该水凝胶洗涤3天，溶液每天都发生改变，然后用DMF/PBS(10/90体积，3×100毫升)进行洗涤，最后用PBS(pH＝7.4，3×100毫升)进行洗涤。将得到的水凝胶聚合物存储于含有0.2％wt叠氮化钠和1mM EDTA钠盐的PBS(10mM PBS，pH＝7.4)中。
H.D-葡萄糖对包含1-[N-(2-二羟硼基苄基)-N-[4-(甲基丙烯酰氨基)丁氨基]甲基]-4-[N-(2-二羟硼基苄基)-N-[4-[(3，4-二羟基-9，10-二氧代-2-蒽)磺酰氨基]丁氨基]甲基]-苯的N-N-二甲基丙烯酰胺凝胶的荧光和吸光率的作用在装备有可变温度附件的Shimadzu RF-5301 PC分光荧光计中进行该实验。将N，N-二甲基丙烯酰胺水凝胶附于一块以45度角胶合在PMMA荧光池中的玻璃片上。用包含各种浓度D-葡萄糖的PBS(pH＝7.4)溶液填充该池。在对吸光率和荧光强度进行测量之前，将该池在37℃平衡30分钟。测量荧光强度的激发波长设置在470nm，隙缝宽度是3/3nm，高灵敏度的PMT。利用HP 8453仪器对水凝胶薄膜的吸收光谱进行测量，在每次测量中用690nm处的吸光率进行空白校正。
结果示于图8-10中。图8示出了在含有不同葡萄糖浓度的PBS/甲醇中指示剂的吸收光谱。图9示出了含有不同葡萄糖浓度的指示剂凝胶(A(565nm)/A(430nm))的吸收率。图10示出了不同浓度葡萄糖在550nm处的标准化荧光(I/Io)。
权利要求
1.一种检测试样中多羟基待分析物的存在或浓度的方法，该方法包括a)将试样暴露给指示系统，所述系统具有i)能以可逆方式与所述待分析物形成共价键的第一识别单元，和能以可逆方式与结合至第一识别单元上的所述待分析物形成共价键的第二识别单元(A)，或在没有所述待分析物时能以可逆方式与第一识别单元相互作用的配位体单元(B)；所述配位体单元还可有可无地包含产生可检测特性的标记，所述可检测特性通过配位体单元与识别单元的相互作用来调控，其中包含所述第一识别单元的指示系统部分共价地或非-共价地连接至指示系统中包含所述第二识别单元或所述配位体单元的部分上；和ii)包含下列至少之一的检测系统产生可检测特性的供体/受体系统(A)，当所述指示系统暴露至所述待分析物中时，该系统以浓度-依赖的方式发生改变，或所述被标记的配位体单元(B)；和b)测量所述可检测特性的任何改变，由此测定在所述试样中所述待分析物的存在或浓度。
2.权利要求1的方法，其中指示系统至少有两个针对待分析物的识别单元。
3.权利要求2的方法，其中待分析物是糖，而每个识别单元独立地选自硼酸、硼酸根离子、亚砷酸、亚砷酸根离子、碲酸、碲酸根离子、锗酸、锗酸根离子及其组合。
4.权利要求3的方法，其中待分析物是葡萄糖，而每个识别单元包含一个或多个硼酸基。
5.权利要求1的方法，其中指示系统具有针对待分析物的识别单元，和配位体单元。
6.权利要求5的方法，其中待分析物是糖，而识别单元包含一个或多个下列物质硼酸、硼酸根离子、亚砷酸、亚砷酸根离子、碲酸、碲酸根离子、锗酸、或锗酸根离子。
7.权利要求6的方法，其中待分析物是葡萄糖，而识别单元包含一个或多个硼酸基。
8.权利要求5的方法，其中配位体单元是能与识别单元形成酯键的部分。
9.权利要求8的方法，其中配位体单元选自芳族二醇、乳酸盐、α-羟酸、酒石酸、苹果酸、二乙醇胺、β-氨基醇、葡萄糖和多羟基化合物以及含邻位羟基的化合物，所述这些物质可以是取代或未取代的。
10.权利要求1的方法，其中检测系统包含给体/受体系统。
11.权利要求10的方法，其中检测系统包含荧光基团和猝灭基团，其中当所述指示系统结合至所述待分析物上时，所述荧光基团被猝灭或被去猝灭。
12.权利要求1的方法，其中检测系统包含所述被标记的配位体单元。
13.权利要求12的方法，其中所述被标记的配位体单元包含荧光基团，并且所述荧光基团的荧光通过所述指示系统与所述待分析物的结合来进行调控。
14.权利要求10的方法，其中检测系统包含至少两个不同的荧光基团，并且其中所述荧光基团的荧光通过所述指示系统与所述待分析物的相互作用来进行调控。
15.权利要求1的方法，其中试样是生理性液体。
16.权利要求15的方法，其中生理性液体选自血、血浆、血清、间隙流体、脑脊髓液、尿、唾液、眼内的液体、淋巴、眼泪、汗和生理缓冲剂。
17.权利要求1的方法，其中指示系统暴露给溶液中的试样。
18.权利要求1的方法，其中指示系统固定在固相载体上或固定在其内部。
19.权利要求18的方法，其中固相载体是聚合物基体。
20.权利要求1的方法，其中指示系统与可植入装置相结合，并且其中步骤(a)在体内进行。
21.权利要求1的方法，其中测量步骤在基本上环境温度下进行。
22.权利要求21的方法，其中温度高至约80℃。
23.权利要求1的方法，其中指示系统包含选自如下化合物的残余物N-2-[5-(N-4-二甲氨基苄基)-5-[2-(二羟硼基)-苄基]氨基己基]-[2-(二羟硼基)苄基]氨乙基-4-丁氨基-1，8-萘酰亚胺；N-2-[4-(N-4-二甲氨基苄基)-[2-(二羟硼基)-苄基]氨甲基]苄基-[2-(二羟硼基)苄基]氨乙基-4-丁氨基-1，8-萘酰亚胺；N-2-[5-(N-4-二甲氨基苄基)-5-[2-(二羟硼基)-苄基]氨基己基]-[2-(二羟硼基)苄基]氨乙基-4-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基乙基)氨基-1，8-萘酰亚胺；N-(5-甲氧羰基-5-[3，4-二羟基苯甲酰氨基]戊基)-N’-(5-荧光素基)硫脲；N-α-(3-硼酸根合-5-硝基)苯甲酰基-N-ε-(4-二甲氨基-3，5-二硝基)苯甲酰赖氨酸；N-α-(3，4-二羟基苯甲酰基)-N-ε-(5-二甲氨基-萘-1-磺酰)-赖氨酸；N-α-(3，4-二羟基苯甲酰基)-N-ε-(5-二甲氨基-萘-1-磺酰)-赖氨酸N-3-(甲基丙烯酰氨基)-丙基甲酰胺；和N-α-(3-硼酸根合-5-硝基)苯甲酰基-N-ε-(4-二甲氨基-3，5-二硝基)苯甲酰赖氨酸N-3-(甲基丙烯酰氨基)丙基-羧酰胺。
24.一种包含选自如下化合物的残余物的指示系统N-2-[5-(N-4-二甲氨基苄基)-5-[2-(二羟硼基)-苄基]氨基己基]-[2-(二羟硼基)苄基]氨乙基-4-丁氨基-1，8-萘酰亚胺；N-2-[4-(N-4-二甲氨基苄基)-[2-(二羟硼基)-苄基]氨甲基]苄基-[2-(二羟硼基)苄基]氨乙基-4-丁氨基-1，8-萘酰亚胺；N-2-[5-(N-4-二甲氨基苄基)-5-[2-(二羟硼基)-苄基]氨基己基]-[2-(二羟硼基)苄基]氨乙基-4-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基乙基)氨基-1，8-萘酰亚胺；N-(5-甲氧羰基-5-[3，4-二羟基苯甲酰氨基]戊基)-N’-(5-荧光素基)硫脲N-α-(3-硼酸根合-5-硝基)苯甲酰基-N-ε-(4-二甲氨基-3，5-二硝基)苯甲酰赖氨酸；N-α-(3，4-二羟基苯甲酰基)-N-ε-(5-二甲氨基-萘-1-磺酰)-赖氨酸；N-α-(3，4-二羟基苯甲酰基)-N-ε-(5-二甲氨基-萘-1-磺酰)-赖氨酸N-3-(甲基丙烯酰氨基)-丙基甲酰胺；和N-α-(3-硼酸根合-5-硝基)苯甲酰基-N-ε-(4-二甲氨基-3，5-二硝基)苯甲酰赖氨酸N-3-(甲基丙烯酰氨基)丙基-羧酰胺。
全文摘要
本发明披露了利用指示系统检测待分析物(如糖类)的方法，所述指示系统在暴露给待分析物时，其分子结构会发生改变。结构的改变将影响与指示系统有关的可检测特性，例如荧光特性，由此能够对待分析物的存在或浓度进行检测。
文档编号G01N21/78GK1529815SQ02806007
公开日2004年9月15日 申请日期2002年1月4日 优先权日2001年1月5日
发明者乔治·Y.·丹尼洛夫, 亚里士多德·G.·卡利夫仁特诺斯, 亚历山大·V.·尼古拉特奇克, 埃德温·F.·厄尔曼, F. 厄尔曼, 乔治 Y. 丹尼洛夫, 多德 G. 卡利夫仁特诺斯, 大 V. 尼古拉特奇克 申请人:医药及科学传感器公司