专利名称：检测sars冠状病毒抗体的方法及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及人类医学卫生领域，尤其涉及一种检测SARS冠状病毒抗体的方法及其试剂盒。
背景技术：
2002年底在世界各地爆发了导致全球150多人死亡的非典型肺炎，这次流行的非典型肺炎是一种急性呼吸道传染病，国外称其为重症急性呼吸综合征(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)，主要通过近距离空气飞沫和密切接触传播，起病急、传播快，病死率高达4.9％。目前涉及到世界近30个国家和地区，全球患者已达3389多例，且发病人数仍有不断增加的趋势。
美国疾病控制和预防中心的专家利用“非典”患者的组织样本，借助电子显微镜分离并判定“非典”病原体可能是新型冠状病毒。几乎同时，包括中国、新加坡、加拿大、德国在内的几个实验室也都确认了这种新型冠状病毒的存在。
2003年4月16日，世界卫生组织宣布，经过全球10个国家和地区13个实验室的通力合作，在全球多个国家快速传染的非典型肺炎(英文名称为SARS，下文简称“非典”)的病原体最终被确认。这是一种冠状病毒，以前从未在人体中发现过。非典型肺炎病原，即SARS病毒的分离和确证，对于该病的临床诊断、治疗及预防至关重要，这也是本发明所要解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测SARS冠状病毒抗体的方法及其试剂盒。
其具体步骤如下1)利用纯化的全病毒裂解液包被一种固相支持物；2)将待检测的生物学样本加入经包被的固相支持物上，在适合形成抗原抗体免疫结合复合物的条件下孵育；3)清洗去除任何未结合的SARS冠状病毒抗体；4)加入经标记的针对人抗体的第二抗体，在适合形成抗原抗体免疫复合物的条件下孵育；5)清洗去除任何未结合的第二抗体；6)检测孵育混合物中抗原抗体免疫结合复合物的存在。
其试剂盒组成为
1)包被抗原SARS冠状病毒全病毒裂解液；2)抗原包被板采用国产96孔可拆板，并包被SARS冠状病毒全病毒裂解液；3)酶标抗体辣根过氧化物酶标记的第二抗体(IgG或IgM)；4)阴性对照及阳性对照血清含0.05％硫柳汞，0.01％叠氮钠；5)酶标抗体工作液用含20％羊血清，0.05％硫柳汞的稀释液将酶标抗体稀释至适当的效价；6)底物液A0.06％过氧化脲的0.01M pH4.5柠檬酸缓冲液；底物液B0.06％TMB0.01M pH4.5柠檬酸缓冲液；7)终止液1M硫酸；8)洗涤液PBS，含0.1％吐温-20；9)间接法检测SARS冠状病毒抗体试剂盒说明书一份。
本发明解决了临床对SARS冠状病毒感染者的快速诊断问题，具有较高的准确性，为临床检测该病提供了快速、准确的诊断方法。
图1是SARS冠状病毒全病毒裂解液抗原的SDS-PAGE结果示意图；图2是酶标第二抗体为IgG时cut-off态分布示意图。
具体实施例方式
本发明所述的生物学样本是指来自受试者(包括患者和阴性对照)的血液、血清、血浆、尿样、体液、唾液和其它分泌物或排泄物以及组织或细胞提取物。
针对人抗体的第二抗体可以是用放射性同位素标记的(即RIA)，也可以是用辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶进行标记的(即ELISA)。
所述第二抗体可以是抗人-IgG或/和-IgM或/和-IgA抗体。这些第二抗体可以从市场上购得，如绵羊抗人-IgG或/和-IgM、山羊抗人-IgG或/和-IgM、小鼠抗人-IgG或/和-IgM、大鼠抗人-IgG或/和-IgM、兔抗人-IgG或/和-IgM等。
利用不同的第二抗体可以检测出样本中特定的抗体是否存在，以及不同抗体的相对存在量。由于在SARS冠状病毒感染的不同时期IgG和IgM在人体内的相对量不同，利用不同的第二抗体进行多次检测有助于判定患者的病程。
所述的“固相支持物”包括本领域周知的有机和无机多聚物，诸如包括但不局限于葡聚糖、天然或经修饰的纤维素、聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺，琼脂糖，乳胶，容器内壁如试管、滴定板、玻璃杯等。
可使用本领域周知的多种方法包被固相支持物。例如利用双功能试剂活化，参见美国专利5399501。
所述的“适合形成抗原抗体免疫复合物的条件”为本领域周知，是指在适当的温度及时间条件下孵育抗原与含抗体的样品的混合物，例如在约0-50摄氏度，优选约4-30摄氏度下，标记约20分钟至约48小时，优选标记约20分钟至约4小时。
经孵育形成抗原抗体免疫复合物后，用本领域常用的适当洗涤溶液洗涤检测板数次，以清除未结合的经标记的抗原。所用清洗液一般为pH约5-8，优选为pH约7.4的磷酸盐缓冲溶液。
可采用多种本领域周知的方法定量检测抗原抗体复合物的形成。根据标记第二抗体所使用的方法，选择适当的定量检测方案。本发明一个优选的实施方案中，标记抗原时使用辣根过氧化物酶，所以使用以过氧化物溶液为A液及联苯胺类物质为B液的底物与带有含标记的辣根过氧化物酶的抗原抗体免疫复合物作用，显色后在波长为450nm(参比波长630nm)酶标仪读取吸光值。将所得读数与阴性对照的读数加以比较，判断所测样本的结果。
利用本发明的SARS冠状病毒全病毒裂解液作为抗原，通过免疫法检测个体生物学样本中SARS冠状病毒抗体的方法还包括本领域中常规使用的利用特定抗原检测抗体的其它方法。
本发明也涉及用于这些方法检测SARS冠状病毒抗体的检测试剂盒。根据本发明检测SARS冠状病毒抗体的试剂盒包括用纯化的本发明经修饰的重组非典型性肺炎病毒蛋白质作为抗原包被的固相支持物；和使用该试剂盒的说明。还包括如上文所述标记的第二抗体。该第二抗体可以是抗IgG抗体和/或抗IgM和/或抗IgA抗体。在上述检测试剂盒中，还可以含有提供判断检测结果的相应的范围。SARS冠状病毒全病毒裂解液是采用Vero-E6细胞接种病毒后培养，经超声裂解纯化而得到的。
下列实施例详细解释本发明，但这并不限制本发明的范围。实施例1、SARS冠状病毒全病毒裂解液的制备及鉴定1、将病毒直接接种Vero E6后，每天观察病变，当表现为聚集，圆形细胞，折光，并出现散在细胞脱落时，将细胞在-20C反复冻溶2此，离心取上清。
2、SARS冠状病毒纯化过程，得到SARS冠状病毒全裂解液。
1)上述上清进行超声破碎(功率150W，超声时间2秒，间歇时间4秒，60个循环)；2)13000RPM离心20分钟；
3)置入透析袋进行透析(cut-off10000)；4)采用PEG20000浓缩样品约6-7倍；5)将浓缩样品转移至洁净试管；6)超声破碎(功率150W，超声时间2秒，间歇时间4秒，60个循环)；7)13000RPM离心10分钟；除去不溶物；8)加入固体尿素至浓度为6M；9)超声破碎(功率150W，超声时间2秒，间歇时间4秒，60个循环)；10)13000RPM离心10分钟，除去不溶物。得到SARS冠状病毒全病毒裂解液。
3、纯度鉴定以VERO-E6 CELL超声粉碎的细胞液和全病毒裂解液同时进行SDS-PAGE电泳测定，浓缩胶浓度5％，分离胶浓度为10％，样品上样量为10μg。对照细胞及中毒细胞条带应有明显差异；比活用1μg/ml抗原包被的微孔板条，用质控P1号血清进行检定，定义A值等于0.2时抗原比活为一个单位(IU)，比活应大于10IU。SARS冠状病毒全病毒裂解液抗原的SDS-PAGE结果见附图1。实施例2、SARS冠状病毒全病毒裂解液包被固相支持物96孔板条选用吸附性良好的聚苯乙烯板(孔间，板间和批间差CV＜10％)，选用0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液(CB)为包被液，每孔加入按照实验设计浓度配好抗原的包被液100微升，室温包被过夜。然后弃去抗原液，包被板用含有0.5％TW-20的0.02M PBS洗涤液(PBS-T)洗两次，拍干，加入1％牛血清白蛋白(BSA)和1％脱脂奶粉的0.02M pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)室温封闭2小时。弃去封闭液，风干包被板，铝箔袋真空包装4℃保存。用内控SARS冠状病毒血清进行效价滴定，用间接法测定用于包被的SARS冠状病毒抗原效价，结果见表1，结果确定用于包被的SARS冠状病毒抗原的效价为1∶60。
表1.用于包被的SARS冠状病毒抗原效价滴定结果。
实施例3、酶标用抗人IgG、IgM的辣根过氧化物酶标记及鉴定酶标用抗人IgG、IgM经检定合格后用于酶标记。辣根过氧化物酶购自Sigma公司，RZ＞3.0。标记方法采用改良过碘酸钠法。
激活HRP称取5mg HRP，溶于1ml 0.2M pH5.6醋酸盐缓冲液中，加入新鲜配制的0.1M NaIO4 0.25ml，充分混匀，置于磁力搅拌器上充分反应，避光反应(150rpm)20分钟，用1mM pH4.4的醋酸盐缓冲液4℃充分透析24小时以除去小分子的杂质。
与抗人IgG/IgM抗体的交联上述激活后的HRP中加入1/4体积1.0M pH9.6碳酸盐缓冲液，调节pH值至9.6(HRP浓度变为4mg/ml)。取1.25mg抗人IgG/IgM加入1/4体积的1.0M pH9.6碳酸盐缓冲液调节pH值至9.6，将抗人IgG/IgM溶液缓慢加入到激活的HRP中，室温，避光反应2小时。
还原Shiff碱将上述交联后的产物中加入0.01ml 5mg/ml的NaBH4，充分混匀后4℃避光静置2小时。
除去小分子杂质将上述的交联产物对0.01MpH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)充分透析16小时。
去除游离未标记的HRP从透析袋取出液体，缓慢加入等体积的饱和(NH4)2SO4，充分混匀后4℃静置过夜，离心4000rpm 20分钟，收集沉淀，用0.01MpH7.4的PBS溶解沉淀，对0.01M pH7.4 PBS充分透析16小时。
标记抗体经Sephadex G-50柱层析，收集第一峰，合并样品管，浓缩。
保存加入等体积灭菌甘油，-20℃保存备用。
酶标记抗体外观澄清、无混浊、无沉淀。活性检定用HCV系统检测酶标记抗体的敏感性和特异性，结果见表2。结果表明该酶标抗体敏感性和特异性良好，可用于SARS系统。
表2.酶标记的抗体活性检定结果。
实施例4合适的抗原抗体反应条件及时间的确定在上述实施例确定的包被抗原及酶标第二抗体浓度下，采用如前述的酶标板和反应缓冲液，研究适于抗原抗体反应形成免疫结合复合物的条件。选用弱、中、强3个阳性血清及阴性对照，按照实施例6中详细描述的操作方法进行间接法实验。通过在37℃条件下分别反应20、30、60、90、120分钟，标记抗体反应20、30、60分钟，显色10分钟。
1)当酶标第二抗体为IgM时，所测的OD值在60分钟时达到最高值。故选择反应时间为60分钟。
2)当酶标第二抗体为IgG时，所测的OD值在30分钟时达到最高值。故选择反应时间为30分钟。实施例5间接法免疫检测样品的阳性阈值cut-off的确定1)酶标第二抗体为IgG按照实施例6所述免疫检测的方法，检测300份经间接ELISA法确定为阴性的正常义务献血员血清，取正态分布值进行统计分析。得均值为0.021，SD为0.004。设定阳性阈值为0.18+阴性对照均值。
检测1000份正常献血员随机血清标本，将S/Co比值进行正态统计分析，同时检测10份临床确诊SARS的患者血清标本，分析S/Co值，设定Cut-off值。检测1000份正常献血员随机血清标本，阴性对照OD值低于0.05按0.05计算，高于0.05按实际值计算，计算A值，将A值进行正态统计分析，均值为0.05，标准差(SD)为0.044。以均值+3倍标准差＝0.05+3×0.044＝0.182Cut-off值＝0.13+阴性对照A值其正态分布图见图2。
据此设定Cut-off值为判定界值。如大于Cutoff为阳性，反之为阴性。同时检测10份临床确诊为SARS的患者血清标本，均大于Cut-off值。
2)同理，酶标第二抗体为IgM时，计算得Cut-off值为0.14。实施例6、间接法检测SARS冠状病毒抗体1)每次试验设空白对照、阴性对照和阳性对照各1孔。空白孔不加液体；阴、阳性对照无需稀释直接取50μl加入阴、阳性对照孔中；其余检测孔加入样品稀释液，每孔100μl，再加入待测样品10μl。充分混匀，贴上封口胶，置37℃温育30分钟。
2)将50倍浓缩洗板液用双蒸水50倍稀释后用于洗涤板孔。
3)弃去各孔中样品，每孔加满洗液，静置数秒后弃去，重复5次，拍干。
4)每孔加入酶标抗人IgG工作液100μl，贴上封口胶。置37℃温育20分钟。
5)弃去各孔中液体，用洗板液反复洗涤5次，拍干。
6)每孔加入底物液A 50μl，再加入底物液B 50μl，轻拍混匀，置37℃避光温育10分钟。
7)显色完毕后，每孔加入终止液50μl，轻拍混匀，立即以空白孔调零，置酶标仪450nm波长下测定OD值(参考波长为630nm)。实施例7、SARS冠状病毒检测试剂盒的组成本发明优选的SARS冠状病毒检测试剂盒由以下几个部分组成包被抗原SARS冠状病毒全病毒裂解液；抗原包被板为国产96孔可拆板，按照实施例4所述包被SARS冠状病毒全病毒裂解液；酶标抗体辣根过氧化物酶标记的第二抗体(IgG或IgM)；阴性对照及阳性对照血清各0.2毫升，含0.05％硫柳汞，0.01％叠氮钠；酶标抗体工作液用含20％羊血清，0.05％硫柳汞的稀释液将酶标抗体稀释至适当的效价。
底物液A0.06％过氧化脲的0.01M pH4.5柠檬酸缓冲液；底物液B0.06％TMB0.01M pH4.5柠檬酸缓冲液；终止液1M硫酸洗涤液50×PBS，含0.1％吐温-20；抗SARS冠状病毒阳性血清OD值当在0.13(IgG)阴性对照均值以上。
抗SARS冠状病毒阴性血清OD值当在0.13(IgG)以下。
抗SARS冠状病毒阳性血清OD值当在0.11(IgM)阴性对照均值以上。
抗SARS冠状病毒阴性血清OD值当在0.11(IgM)以下。
间接法检测SARS冠状病毒抗体试剂盒说明书一份。
权利要求
1.一种检测SARS冠状病毒抗体的方法，其特征在于具体检测步骤如下1)利用纯化的全病毒裂解液包被一种固相支持物；2)将待检测的生物学样本加入经包被的固相支持物上，在适合形成抗原抗体免疫结合复合物的条件下孵育；3)清洗去除任何未结合的SARS冠状病毒抗体；4)加入经标记的针对人抗体的第二抗体，在适合形成抗原抗体免疫复合物的条件下孵育；5)清洗去除任何未结合的第二抗体；6)检测孵育混合物中抗原抗体免疫结合复合物的存在。
2.根据权利要求1所述的一种检测SARS冠状病毒抗体的方法，其特征在于所说的生物学样本是指来自受试者的血液、血清、血浆、尿样、体液、唾液和其它分泌物或排泄物以及组织或细胞提取物。
3.根据权利要求1所述的一种检测SARS冠状病毒抗体的方法，其特征在于所说的固相支持物包括有机和无机多聚物。
4.根据权利要求1所述的一种检测SARS冠状病毒抗体的方法，其特征在于所说的适合形成抗原抗体免疫复合物的条件，是指可以孵育抗原与含抗体的样品的混合物的适当的温度及时间条件，其中温度为0-50摄氏度，时间约20分钟至约48小时。
5.根据权利要求4所述的一种检测SARS冠状病毒抗体的方法，其特征在于所说的权利要求4中所述的条件，其中温度为4-30摄氏度，时间为20分钟至4小时。
6.根据权利要求1所述的一种检测SARS冠状病毒抗体的方法，其特征在于所说的第二抗体是抗IgG抗体和/或抗IgM或IgA抗体。
7.根据权利要求1所述的一种检测SARS冠状病毒抗体的方法，其特征在于所说的第二抗体是用放射性同位素标记的，或者是用辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶进行标记。
8.一种检测SARS冠状病毒抗体的试剂盒，其特征在于其试剂盒组成为1)包被抗原SARS冠状病毒全病毒裂解液；2)抗原包被板采用为国产96孔可拆板，并包被SARS冠状病毒全病毒裂解液3)酶标抗体辣根过氧化物酶标记的第二抗体(IgG或IgM或IgA)；4)阴性对照及阳性对照血清含0.05％硫柳汞，0.01％叠氮钠；5)酶标抗体工作液用含20％羊血清，0.05％硫柳汞的稀释液将酶标抗体稀释至适当的效价；6)底物液A0.06％过氧化脲的0.01M pH4.5柠檬酸缓冲液；底物液B0.06％TMB0.01M pH4.5柠檬酸缓冲液；7)终止液1M硫酸；8)洗涤液PBS，含0.1％吐温-20；9)间接法检测SARS冠状病毒抗体试剂盒说明书一份。
9.根据权利要求8所述的一种检测SARS冠状病毒抗体的试剂盒，其特征在于所说的SARS冠状病毒全病毒裂解液是采用Vero-E6细胞接种病毒后培养，经超声裂解纯化而得到的。
全文摘要
本发明提供了公开了一种检测SARS冠状病毒抗体的方法及其试剂盒。具体检测步骤如下(1)利用纯化的全病毒裂解液包被一种固相支持物；(2)将待检测的生物学样本加入经包被的固相支持物上，在适合形成抗原抗体免疫结合复合物的条件下孵育；(3)适度清洗去除任何未结合的SARS冠状病毒抗体；(4)加入经标记的针对人抗体的第二抗体，在适合形成抗原抗体免疫复合物的条件下孵育；(5)适度清洗去除任何未结合的第二抗体；(6)定量检测孵育混合物中抗原抗体免疫结合复合物的存在。本发明解决了临床对SARS冠状病毒感染者的快速诊断问题，具有较高的准确性，为临床检测该病提供了快速、准确的诊断方法。
文档编号G01N33/536GK1469126SQ0311666
公开日2004年1月21日 申请日期2003年4月26日 优先权日2003年4月26日
发明者汪建, 祝庆余, 方健秋, 秦鄂德, 文洁, 于曼, 牟峰, 司炳银, 陈唯军, 刘斯奇, 胡咏武, 殷剑宁, 王俊, 杨焕明, 汪 建 申请人:杭州华大基因研发中心, 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所