专利名称：一种血液的细菌内毒素定量检测方法—同系统模型法的制作方法
技术领域：
本发明涉及细菌内毒素定量检测方法。
细菌内毒素检测所使用的试剂是鲎试剂(TAL或LAL)。TAL中含有能被极微量细菌内毒素激活的因子C、因子B、凝固酶原以及凝固蛋白原。在适宜条件下(温度、pH值以及无干扰物质等)，细菌内毒素能使TAL产生凝集反应。
细菌内毒素检测的方法学分类如下I.限量检测法(凝胶法)II.定量检测法 细菌内毒素定量检测法的原理是使用光电检测仪，把内毒素与TAL凝集反应所产生的浊度/色度变化转变为光密度(OD值)的变化，建立内毒素浓度与OD值及相关参数关系的数学模型(即标准曲线)，从而定量地测定各种样品的内毒素含量。在此方法过程中，最重要的步骤是正确地建立标准曲线。
以下以动态时间浊度法为例，介绍用已有技术建立标准曲线的方法。
取一支(瓶)标准内毒素，按标示效价用细菌内毒素检查用水(W)把它稀释成至少三个等比浓度C1、C2及C3，分别与TAL在光电检测仪上反应，得到三条相应的动态反应曲线S1、S2及S3，为了试验的准确性，每一浓度反应至少重复两试管。如果人为地设置一个光密度衰减的数值，比如92％OD，就可以得到每一标准内毒素浓度(C)与TAL反应，使光密度衰减到92％OD所需要的时间(T)。如
图1所示。
把参数T1-C1，T2-C2及T3-C3分别描在双对数坐标上(LogT-LogC)，得到三个坐标点。对此三点作回归分析，便得到一直线logT＝b-klogC。我们称此直线为TAL与标准内毒素反应的标准曲线，见图2。这就是反应时间(T)与内毒素浓度(C)关系的数学模型，有此模型就可以定量地检测未知的内毒素浓度。例如有一未知内毒素含量的样品(S)与TAL反应，得到一动态反应曲线Sx，达到92％OD的反应时间是Tx，如图3所示。利用已建立的数学模型(C-T标准曲线)就可以定量地求出样品S的内毒素含量Cx，见图4。
已有的内毒素定量检测方法存在着一个严重的缺陷即制备标准曲线时是用水(W)来把标准内毒素稀释到所需要的浓度，然后与TAL反应(以下称内毒素与TAL的反应为T/E反应)。也就是说，T/E反应是以水为介质的体系中进行的。但当检测样品的内毒素时，T/E反应是在以样品为介质的体系中进行的，此时如果样品体系中存在着干扰T/E反应的因素，反应结果就会与W体系中的反应结果有差异。一般来说，T/E反应在样品体系中进行与在W体系中进行都有差异，主要表现在如下两方面1、反应速度的差异以使用动态时间浊度法检测人血浆的内毒素为例。
1.1 T/E反应在W体系中进行的结果选择用W稀释好的三个等比的标准内毒素浓度0.05、0.01及0.002Eu/ml(记为E0.05、E0.01及E0.002)分别与TAL在光电检测仪上反应，每一浓度重复两反应管，同时做两管阴性对照。相应的动态反应曲线见图5Ea、Eb、Ec及EN。
1.2T/E反应在样品(S)体系中进行的结果取一健康人血浆(S)，用W按1∶10稀释后作相应的处理，以此样品作为介质，记为S10。取标准内毒素，用S稀释成三个等比浓度0.05、0.01及0.002Eu/ml(记为S10E0.05、S10E0.01、S10E0.002)，分别与上述同批号的TAL在光电检测仪上反应，每一浓度重复两反应管，同时作两管S对照。相应的动态反应曲线见图5Sa、Sb、Sc及SN。
比较EN及SN可看出，其本身都不含可测的内毒素。
比较Ea/Sa、Eb/Sb、Ec/Sc可看出，同样浓度的标准内毒素在两种体系中的反应速度是不同的，内毒素浓度越低，反应速度(即反应时间T)的差异越大。
2、反应趋势的差异仍然以使用动态时间浊度法检测人血浆的内毒素为例。
图6中的Ea、Eb及Ec是标准内毒素与TAL的动态反应曲线，S是某患者血液样品与TAL的动态反应曲线。从前面的介绍我们已知道1)光密度的衰减值是人为设置的，例如，可以设92％OD，也可以设90％OD，关键是在检测样品时所取的OD衰减值必须与建立标准曲线时一致。2)动态时间浊度法的标准曲线是表示反应时间(T)与内毒素浓度(C)关系的数学模型，即根据反应时间T的快慢来决定所测样品的内毒素多少。
在图6中，如果我们把OD衰减值设为92％，可以看出，样品的反应时间是与Ea相同，这表示样品S的内毒素含量与标准内毒素Ea应相等。但是如果我们把OD衰减值设到85％，可以看出，S的反应时间是与Eb相同，这意味着S的内毒素含量与标准内毒素Eb相等！同样的S，为什么取OD衰减值不同，会有不同的内毒素含量呢？原因是T/E反应在两种体系中进行的反应趋势不同所致！比较它们的动态反应曲线可以明显看出各曲线的趋向差异。
上述的比较分析表明了已有的细菌内毒素定量检测方法的严重缺陷，即用一个反应体系建立的数学模型去衡量另一个不同体系的反应！这是十分不合理的。
本发明血液的细菌内毒素定量检测方法—同系统模型法，该方法是在样品体系中建立标准曲线，用此标准曲线去计算鲎试剂与样品反应的结果，定量地求出样品的内毒素含量。
该模型建立的方法及步骤如下(1)、使用参考标准内毒素(RSE)或国际标准内毒素(ISE)或国家标准内毒素(NSE)或工作标准内毒素(CSE)作为标准内毒素来制备标准曲线；使用标准内毒素时应按其使用要求来复溶及稀释；(2)、确定制备标准曲线所需要的标准内毒素浓度系列，这个系列至少要有三个稀释浓度；(3)、取样品用水稀释制备成检测浓度溶液，这样的溶液份数与步骤(2)的标准内毒素系列的浓度个数相等；每份溶液在稀释过程中加入标准内毒素，使样品溶液的浓度为检测浓度，所含标准内毒素的浓度为步骤(2)的标准内毒素系列浓度之一。此外还需制备1份不含标准内毒素的检测浓度样品溶液；(4)、对按步骤(3)所述制备的样品溶液进行相应的处理；(5)、取鲎试剂分别与按步骤(3)及(4)所述制备的样品溶液在光电检测仪上进行反应；(6)、对步骤(5)所得的反应数据作回归分析，建立标准曲线；(7)、使用所建立的标准曲线去检测读同种血液样品在同样检测浓度及经同样条件处理后与鲎试剂在光电检测仪上反应的数据，从而求出样品的内毒素含量。
制备标准曲线的条件与血液样品检测的条件一致。
使用所有的细菌内毒素定量检测方法检测血液内毒素，包括终点浊度法、动态浊度法、终点比色法以及动态比色法。
一般样品对BET的干扰都仅是一种或两种因素的干扰，如某些成份，离子浓度，Ph值等，对这些干扰因素可以采取针对性措施较容易地消除，但血液以及血液制品对BET的干扰是多因素的。复杂的综合作用除了可能激活G因子旁路使反应增强外，有些成份对BET有强烈的抑制作用。例如人们一直试图消除人血白蛋白(HSA)对BET的干扰但效果不理想，原因在于我们总希望采取针对性措施来消除HSA对BET干扰的因素有多少种以及它们的干扰机理如何。本系统模型法提出一个解决这类样品对BET干扰的新观念，即除了已知这类样品对BET干扰的因素外(如G因子旁路影响)，把其它未知因素统统纳入整个系统来考虑，把诸因素的综合影响看作是整个系统发生偏差，只要消除系统偏差，就消除了这类样品对BET的干扰。在某反应体系中建立数学模型，并在相同的体系中检测样品，使由于体系性质不同而导致的差异(即干扰)得到消除。
图3是样品动态反应曲线图；图4是由图3得到达到预设OD值的时间，通过标准曲线读出待测样品的内毒素浓度Cx；图5是T/E反应在两个体系中进行的比较图；图6是建立标准曲线的动态反应曲线与样品的动态反应曲线的比较图；图7是以样品为介质的T/E反应动态曲线图；图8是由图7得到的标准曲线图；图9是TAL与标准内毒素的动态反应曲线图；图10是由图9得到的标准曲线图；图11是样品A的反应动态曲线图；图12是样品B的反应动态曲线图。
b)取一支(瓶)标准内毒素(RSE、ISE、NSE或CSE)按使用说明复溶及旋涡混合好备用。
c) 确定样品的检测浓度。例如血液样品的检测浓度为1∶10稀释(S10)。
d)使用检测浓度的样品把标准内毒素稀释成所需的浓度。例如动态时间浊度法的S10E0.05、S10E0.01及S10E0.002。也可以用样品(S)与标准内毒素互释得到含所需浓度内毒素的检测浓度样品。此外还制备一份不含标准内毒素的检测浓度样品S10，如果需要的话，把S10E0.05、S10E0.01及S10E0.002以及S10作相应的处理。
e)取TAL分别与制备好的样品在光电检测仪上反应，如S10E0.05、S10E0.01、S10E0.002及S10，每一样品至少重复两反应管。此外还需要设两阴性对照管，动态反应曲线见图7，反应的标准曲线见图8。
f)对实验数据作回归分析，得到一条标准曲线。例如logT＝KlogC，表示T/E反应在检测浓度样品中进行的反应时间(T)与内毒素浓度(C)关系的数学模型。
用上述方法建立的数学模型来测定同种类未知内毒素含量的血液样品，便可消除前述的反应速度差异，反应趋势差异以及由体系差异导致的一切干扰现象。
2、注意事项a) 建立同系统模型时样品的处理必须与日常检测时一致。如血浆样品在日常检测前需先加热处理，则建立模型时的样品在加入标准内毒素后也应作加热处理后才与TAL反应。比如其它处理方式，如氯仿抽提、高氯酸法等，也要求一致。
b) 建立同系统模型时的样品检测浓度必须与日常检测时样品的检测浓度一致。如上述建立人血浆系统模型时的样品检测浓度是1∶10稀释S10，在日常检测时的样品检测浓度也应是1∶10稀释S10。
c) 用于建立同系统模型的样品在检测浓度状态下自身内毒素含量越少越好，最好是不含可测内毒素(如上述动态时间法，即S10的反应曲线在60分钟内不与所设定的OD衰减线相交)。内毒素含量高的样品不适宜用于制备标准曲线。对于人血液检测，就使用健康人血液样品来制备标曲线。
d) 以同系统模型法建立的标准曲线被应用于各种细菌内毒素定量检测方法时，如终点浊度法，终点比色法、动态浊度法、动态比色法时，同样必须遵循各种方法的具体要求，如线性要求、回收率要求等等。
3、同系统模型法的应用实例—人血液细菌内毒素定量检测3.1 实验材料1)用于建立标准曲线的样品健康人血液一份，记为S；2)待测样品患者血液两份，分别记为A和B；3)标准内毒素(CSE)，鲎试剂(TAL)及实验用水(W)均使用湛江安度斯生物有限公司产品；4)光电检测仪；3.2 实验方法及步骤1)取血液样品各1ml，分别置于无热原试管中以500-1500rpm离心5-15分钟，然后分离出血浆(同样记为S、A及B)；2)取CSE1支，按使用说明书溶解以及旋涡混合；3)用W把S作1∶10稀释(记为S10)，在稀释过程中加入CSE，使S10分别含有的CSE浓度为0.002，0.01，0.05Eu/ml(记为E0.002、E0.01及E0.05)，即S10E0.002、S10E0.01、S10E0.05，同时需要制备一份S10。
4)用W把A和B分别作1∶10稀释，记为A10和B10。同时，按照步骤3)中的方法制备A10E0.01和B10E10。
5)把即S10E0.002、S10E0.01、S10E0.05、S10、A10、A10E0.01、B10、及B10E0.01置入65-85℃水浴中加热5-15分钟；6)取TAL按细菌内毒素检查的操作过程分别与上述处理后的样品在光电检测仪上反应。
3.3 实验结果1)标准内毒素的动态反应曲线见图92)标准曲线见图103)样品A与样品B的反应曲线见图11和图124)检测报告见表1表1EDS-99细菌内毒素测定系统测定报告—动态浊度法检验日期 010724PM 检验员FJJ 测定时间 15:53:00鲎试剂批号0101120鲎试剂灵敏度 0.03 EU/ml反应器温度37℃BET水批号 0106260标准内毒素批号EC-6 室温 26℃
3.4 结果分析1)定量法BET要求a.标准曲线的相关系数r＞0.980；b.回收率要求在50％-200％之间；c.NC(阴性对照)的内毒素含量小于标准曲线的最低点浓度。
2)本实验标准曲线的相关系数|r|＝0.99992，由检测结果表1可看出，样品A的回收率为88.82％，样品B的回收率为90.82％，NC的内毒素含量为0.0007EU/ml，小于标准曲线的最低点浓度0.002EU/ml。所以本实验有效。
权利要求
1.一种血液的细菌内毒素定量检测方法—同系统模型法，该方法是在样品体系中建立标准曲线，用此标准曲线去计算鲎试剂与样品反应的结果，定量地求出样品的内毒素含量。
2.据权利要求1所述的同系统模型法，其特征在于该模型建立的方法及步骤如下(1)、使用参考标准内毒素(RSE)或国际标准内毒素(ISE)或国家标准内毒素(NSE)或工作标准内毒素(CSE)作为标准内毒素来制备标准曲线；使用标准内毒素时应按其使用要求来复溶及稀释；(2)、确定制备标准曲线所需要的标准内毒素浓度系列，这个系列至少要有三个稀释浓度；(3)、取样品用水稀释制备成检测浓度溶液，这样的溶液份数与步骤(2)的标准内毒素系列的浓度个数相等；每份溶液在稀释过程中加入标准内毒素，使样品溶液的浓度为检测浓度，所含标准内毒素的浓度为步骤(2)的标准内毒素系列浓度之一。此外还需制备1份不含标准内毒素的检测浓度样品溶液；(4)、对按步骤(3)所述制备的样品溶液进行相应的处理；(4)、取鲎试剂分别与按步骤(3)及(4)所述制备的样品溶液在光电检测仪上进行反应；(6)、对步骤(5)所得的反应数据作回归分析，建立标准曲线；(7)、使用所建立的标准曲线去检测读同种血液样品在同样检测浓度及经同样条件处理后与鲎试剂在光电检测仪上反应的数据，从而求出样品的内毒素含量。
3.据权利要求2所述的同系统模型法，其特征在于制备标准曲线的条件与血液样品检测的条件一致。
4.据权利要求2或3所述的同系统模型法，其特征在于使用所有的细菌内毒素定量检测方法检测血液内毒素，包括终点浊度法、动态浊度法、终点比色法以及动态比色法。
全文摘要
本发明涉及一种内毒素定量检测方法。该内毒素定量检测方法—同系统模型法，要解决的技术问题是由体系性质不同而导致的差异(即干扰)。本系统模型法提出一个解决这类样品对BET干扰的新观念，即除了已知这类样品对BET干扰的因素外(如G因子旁路影响)，把其它未知因素统统纳入整个系统来考虑，把诸因素的综合影响看作是整个系统发生偏差，只要消除系统偏差，就消除了这类样品对BET的干扰。在某反应体系中建立数字模型，并在相同的体系中检测样品，使由于体系性质不同而导致的差异(即干扰)得到消除。
文档编号G01N33/52GK1469124SQ0312679
公开日2004年1月21日 申请日期2003年6月4日 优先权日2003年6月4日
发明者冯聚锦 申请人:湛江安度斯生物有限公司