专利名称：致病性鳗弧菌的pcr快速检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明属于水产动物疾病的诊断技术，特别是养殖动物的致病性鳗弧菌的PCR快速检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
弧菌是海洋水环境微生态系的成员，在海水和海洋生物中广泛存在。病原性弧菌能引起养殖生物流行病的爆发，导致死亡。鳗弧菌是其中一种非常重要的弧菌性病原，能够引起养殖鱼类的皮肤溃烂、肌体出血和死亡，危害十分巨大。对于致病性鳗弧菌的检测方法，目前主要有生理生化鉴定技术、荧光抗体技术、酶联免疫吸附试验和16srRNA基因探针杂交技术。但这些方法存在一些缺点和不足。生理生化检测技术十分耗时耗力，并且结果不稳定；荧光抗体技术需要较昂贵的仪器设备；酶联免疫吸附实验敏感性不高，还易受干扰因素的影响；16srRNA基因在生物物种中非常保守，因此16srRNA基因探针杂交技术特异性不强。PCR是一种具有敏感性高、特异性强的靶DNA快速检测方法，样品中含有少量的细菌就能检出。然而，采用PCR试剂盒对鳗弧菌的快速检测目前未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种致病性鳗弧菌的PCR快速检测试剂盒及其检测方法。
本发明技术方案如下致病性鳗弧菌的PCR快速检测试剂盒，包括提供两对对致病性鳗弧菌DNA特异的引物对1和2、引物对3和4，以及提供一种使用该试剂盒快速测检和监测多种样品中致病性鳗弧菌的方法，以实现对致病性鳗弧菌检测的准确、标准化，为健康养殖提供科学的依据。
本发明的主要原理为试剂A、B和C将样品中的细菌进行裂解，释放出细菌DNA，PCR试剂管含多聚酶链式反应试剂，通过加入致病性鳗弧菌特异DNA片段引物和Tag酶等成分，对样品释放出的DNA进行特异性的扩增。由于我们设计的引物为致病性鳗弧菌所特有，因此，如果样品中含有致病性鳗弧菌，那么它的DNA的特异片段在经过扩增后，浓度将达到108mol(克分子)以上，在电泳和溴化乙锭染色后，紫外光检测就可以探测到一定分子量的目的条带。如果没有鳗弧菌，则不能扩增到同样分子量的目的条带。
其中所述快速检测鳗弧菌的PCR试剂盒的配方如下(1)DNA提取试剂含缓冲试剂A、细胞裂解试剂B和C；试剂ApH为8.0，含有三羟基甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸(EDTA)，它们的浓度分别为10～50mM、1～10mM；试剂BpH为8.0，含有蛋白酶、三羟基甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸(EDTA)，它们的浓度分别为1～10mg/ml、10～50mM、1～10mM；试剂C含有十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)、氯化钠，浓度分别为1～10g/ml、5～10M；(2)PCR试剂管成分为2.5～5.0μl 10×buffer(10×buffer为10倍浓度的缓冲溶液A)，2.0～4.0μl dNTP(dATP，dTTP，dCTP，dGTP的混合物，每种浓度2.5mM)，25mM 2.0～4.0μl MgCl2，引物对10μM 0.5～1μl引物1和10μM 0.5～1μl引物2，引物对20μM 0.5～1μl引物3和20μM 0.5～1μl引物4，14～31μl灭菌去离子水；(3)Taq酶5～10μl，3U/μl；(4)普通琼脂糖1～1.2g；可配制成1～1.2％的使用浓度；(5)5～10μg/μl溴化乙锭溶液0.5～1.0ml，可配制成为0.5～1.0μg/ml的使用浓度；(6)0.25～0.75％(g/ml)溴酚蓝上样缓冲液30～100μl；所述的引物对1和2、引物对3和4是DNA片段，碱基序列分别为5’TTCATGTACCGACGCGAGT3’和5’AAGATTTGAAAATGTCGCTC3’、5’CGTATTTCATTCAGATAGTGA3’和5’GTGGGTACTGATTGCGTAG3’；所述PCR试剂的最佳成份为5.0μl 10×buffer，3U/ul 1.0ul Taq酶，4.0μl dNTP(dATP，dTTP，dCTP，dGTP的混合物，每种浓度2.5mM)，25mM4.0μl MgCl2，10μM 1μl引物1，10μM 1μl引物2，20μM 1μl引物3和20μM1μl引物4，31μl灭菌去离子水。
采用快速检测鳗弧菌的PCR试剂盒的检测方法如下(1)样品处理取0.1～0.5g或0.1～0.5ml样品，100～400μl试剂A悬浮样品，并将样品充分混匀；10000～12000g离心2～5分钟；(2)DNA提取弃上清，用100～200μl试剂A悬浮沉淀，再加入20～50μl试剂B，或取上清，加入20～50μl试剂B；在55～65℃浴中保温5～10分钟，再加入10～50μl试剂C；55～65℃浴中保温5～10分钟，10000～12000g离心8～10分钟，取上清并加入上清体积2倍的无水乙醇沉淀DNA；室温放置5～10分钟，10000-12000g离心5～10分钟；去上清，70～75％乙醇洗涤沉淀1～2次，让乙醇彻底挥发，将沉淀溶于10～50μl灭菌双蒸水中，即为DNA提取液，2～8℃保存备用；(3)多重PCR扩增在一PCR试剂管内加入0.5～1μl的DNA提取液，0.5～1.0μl 3U/μl Taq酶，3000～5000g离心2～5秒钟混匀，置PCR仪进行扩增；94～96℃解链2～5分钟，然后94～96℃变性40秒～1分钟，55～60℃复性30秒～1分钟，72℃延伸40秒～1分钟，如此进行循环25～35次，最后72℃延伸6～10分钟；(4)PCR扩增产物分析取5～10μl扩增后的样品，与2-6μl 0.25～0.75％溴酚蓝上样缓冲液混合，在含有溴化乙锭浓度为0.5～1.0ug/ml的1.0～1.2％的琼脂糖中进行电泳和染色，在透射紫外灯下观察，如果样品孔有422bp和300bp核酸条带，说明样品有致病性鳗弧菌感染或污染，反之则没有。
本发明具有如下优点本发明在设计特异引物并成功建立致病性鳗弧菌的多重PCR检测技术的基础上，进一步研制成简单快速敏感的PCR检测试剂盒，与其它的弧菌病原检测技术和其它的病原检测技术相比，本发明方法的显著的特点是1)检测十分快速，3-6小时即可得知检测结果，而其它方法则至少需要24小时或一个星期以上；2)检测灵敏度极高，检测下限低至10-100个左右的细菌，其它方法必须经过一定时间的纯培养增殖达到105个细菌后才能进行检测；3)可以应用于多种样品的检测，如可以检测养殖动物遭受鳗弧菌感染的情况，也可以监测养殖水体环境中鳗弧菌，还可以检测养殖饲料和鲜活饵料是否遭受鳗弧菌污染。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，但不作为对本发明的限制。
实施例1按以下配方制作快速检测鳗弧菌的试剂盒试剂ApH为8.0，含10mM Tris、1mM EDTA；
试剂BpH为8.0，含10mg/ml蛋白酶、10mM Tris、1mM EDTA；试剂C含10g/ml CTAB、5M氯化钠；PCR试剂管成份为5.0μl 10×buffer，4.0μl dNTP(dATP，dTTP，dCTP，dGTP的混合物，每种浓度2.5mM)，25mM 4.0μl MgCl2，10μM 1μl引物1，10μM 1μl引物2，20μM 1μl引物3，20μM 1μl引物4，31μl灭菌去离子水；Taq酶10μl，3U/μl；(6)普通琼脂糖1.2g；(7)10μg/μl溴化乙锭溶液0.5ml；(8)0.25％溴酚兰上样缓冲液100μl。
按照以下程序进行检测(1)样品处理取0.5g鱼组织，用400μl试剂A悬浮样品，充分匀浆，12000g离心5分钟；(2)DNA提取弃上清，用200μl试剂A悬浮沉淀，加入50μl试剂B，在65℃浴中保温10分钟，再加入试剂C 50μl，65℃浴中保温10分钟，12000g离心10分钟，取上清并加入600μl的无水乙醇沉淀DNA；室温放置5分钟，12000g离心5分钟，去上清，70％乙醇洗涤2次，让乙醇彻底挥发，将沉淀溶于30μl灭菌双蒸水中，即为DNA提取液，4℃保存备用；(3)PCR扩增在一PCR试剂管内加入1μl DNA提取液、1.0μl 3U/ul Taq酶，3000g离心5秒钟混匀，置PCR仪进行扩增96℃解链5分钟，然后96℃变性1分钟，60℃复性1分钟，72℃延伸40秒，如此进行循环30次，最后72℃延伸6分钟；(4)扩增产物分析取6μl扩增后的样品，与3μl 0.25％溴酚蓝上样缓冲液混合，在含有溴化乙锭浓度为0.5ug/ml的1.0％的琼脂糖中进行电泳和染色，在透射紫外灯下观察，如果样品孔有422bp和300bp核酸条带，说明样品有致病性鳗弧菌感染或污染，反之则没有。
其中电泳液组成、电泳方法及染色方法参考分子克隆实验指南(第二版)，p307，p309-313，p314。
实施例2按以下配方制作快速检测鳗弧菌的试剂盒试剂ApH为8.0，含25mM Tris、5mM EDTA；
试剂BpH为8.0，含5mg/ml蛋白酶、25mM Tris、5mM EDTA；试剂C5g/ml CTAB、7.5M氯化钠；PCR试剂管成份为2.5μl 10×buffer，2.0μl dNTP(dATP，dTTP，dCTP，dGTP的混合物，每种浓度2.5mM)，25mM 2.0μl MgCl2，10μM 0.5ul引物1，10μM 0.5μl引物2，20μM 0.5μl引物3，20μM 0.5μl引物4，15μl灭菌去离子水；(5)Taq酶5μl，3U/μl；(6)普通琼脂糖1.0g；(7)5μg/μl溴化乙锭溶液1.0ml；(8)0.5％溴酚兰上样缓冲液50μl。
按照以下程序进行检测(1)样品处理取0.5g饵料，用200μl试剂A悬浮样品，充分匀浆，11000g离心3分钟；(2)DNA提取弃上清，用100μl试剂A悬浮沉淀，加入30μl试剂B，在60℃浴中保温8分钟，再加入试剂C 20μl，60℃浴中保温8分钟，12000g离心8分钟，取上清并加入300ul的无水乙醇沉淀DNA；室温放置8分钟，12000g离心8分钟，去上清，70％乙醇洗涤2次，让乙醇彻底挥发，将沉淀溶于50μl灭菌双蒸水中，即为DNA提取液，8℃保存备用；(3)多重PCR扩增在一PCR试剂管内加入1μl DNA提取液，1.0μl 3U/μl Taq酶，4000g离心3秒钟混匀，置PCR仪进行扩增，96℃解链5分钟，然后96℃变性1分钟，60℃复性1分钟，72℃延伸40秒，如此进行循环30次，最后72℃延伸6分钟；(4)扩增产物分析取10μl扩增后的样品，与5μl 0.5％溴酚蓝上样缓冲液混合，在含有溴化乙锭浓度为0.8ug/ml的1.0％的琼脂糖中进行电泳和染色，在透射紫外灯下观察，如果样品孔有422bp和300bp核酸条带，说明样品有鳗弧菌感染或污染，反之则没有。
实施例3按以下配方制作快速检测鳗弧菌的试剂盒(1)试剂ApH8.0，含50mM Tris、10mM EDTA；(2)试剂BpH8.0，含8mg/ml蛋白酶，50mM Tris、10mM EDTA；(3)试剂C1g/ml CTAB、10M氯化钠；
(4)PCR试剂管成份为5.0μl 10×buffer，4.0μl dNTP(dATP，dTTP，dCTP，dGTP的混合物，每种浓度2.5mM)，25mM 4.0μl MgCl2，10μM 1μl引物1，10μM 1μl引物2，20μM 1μl引物3，20μM 1μl引物4，31μl灭菌去离子水；(5)Taq酶8μl，3U/μl；(6)普通琼脂糖1.1g；(7)8μg/μl溴化乙锭溶液0.8ml；(8)0.75％溴酚兰上样缓冲液30μl。
按照以下程序进行检测(1)样品处理取0.1ml水样，用100μl试剂A，充分混匀，10000g离心2分钟；(2)DNA提取取上清，加入50μl试剂B，在55℃浴中保温5分钟，再加入试剂C 50μl，55℃浴中保温5分钟，12000g离心5分钟，取上清并加入400ul的无水乙醇沉淀DNA；室温放置10分钟，12000g离心10分钟，去上清，75％乙醇洗涤1次，让乙醇彻底挥发，将沉淀溶于20μl灭菌双蒸水中，即为DNA提取液，2℃保存备用；(3)多重PCR扩增在一PCR试剂管内加入1μl DNA提取液、1.0μl 3U/μl Taq酶，5000g离心2秒钟混匀，置PCR仪进行扩增96℃解链5分钟，然后96℃变性1分钟，60℃复性1分钟，72℃延伸40秒，如此进行循环30次，最后72℃延伸6分钟；(4)扩增产物分析取10μl扩增后的样品，与2μl 0.75％溴酚蓝上样缓冲液混合，在含有溴化乙锭浓度为1.0ug/ml的1.1％的琼脂糖中进行电泳和染色，在透射紫外灯下观察，如果样品孔有422bp和300bp核酸条带，说明样品有鳗弧菌感染或污染，反之则没有。
权利要求
1.一种致病性鳗弧菌的PCR快速检测试剂盒，其特征是试剂包括1)DNA提取试剂含缓冲试剂A、细胞裂解试剂B和C；试剂ApH为8.0，含有三羟基甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸，它们的浓度分别为10～50mM、1～10mM；试剂BpH为8.0，含有蛋白酶、三羟基甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸，它们的浓度分别为1～10mg/ml、10～50mM、1～10mM；试剂C含有十六烷基三甲基溴化胺、氯化钠，浓度分别为1～10g/ml、5～10M；2)PCR试剂管成分为2.5～5.0μl 10×buffer，2.0～4.0μl dNTP(dATP，dTTP，dCTP，dGTP的混合物，每种浓度2.5mM)，25mM 2.0～4.0μl MgCl2，引物对10μM 0.5～1μl引物1和10μM 0.5～1μl引物2，引物对20μM 0.5～1μl引物3和20μM 0.5～1μl引物4，14～31μl灭菌去离子水；3)Taq酶5～10μl，3U/μl；4)普通琼脂糖1～1.2g，可配制成1～1.2％的使用浓度；5)5～10μg/μl溴化乙锭溶液0.5～1.0ml，可配制成为0.5～1.0μg/ml的使用浓度；6)0.25～0.75％(g/ml)溴酚蓝上样缓冲液30～100μl。
2.根据权利要求1所述致病性鳗弧菌的PCR快速检测试剂盒，其特征在于所述的引物对1和2、引物对3和4是DNA片段，碱基序列分别为5’TTCATGTACCGACGCGAGT3’和5’AAGATTTGAAAATGTCGCTC3’、5’CGTATTTCATTCAGATAGTGA3’和5’GTGGGTACTGATTGCGTAG3’。
3.根据权利要求1所述致病性鳗弧菌的PCR快速检测试剂盒，其特征在于所述PCR试剂的最佳成分为5.0μl 10×buffer，3U/ul 1.0ul Taq酶，4.0μl dNTP(dATP，dTTP，dCTP，dGTP的混合物，每种浓度2.5mM)，25mM 4.0μl MgCl2，10μM 1μl引物1，10μM 1μl引物2，20μM 1μl引物3和20μM 1μl引物4，31μl灭菌去离子水。
4.一种使用致病性鳗弧菌的PCR快速检测试剂盒的检测方法，其特征在于检测程序如下
1)样品处理取0.1～0.5g或0.1～0.5ml样品，用100～400μl试剂A悬浮样品，并将样品充分混匀；10000～12000g离心2～5分钟；2)DNA提取弃上清，用100～200μl试剂A悬浮沉淀，再加入20～50μl试剂B，或取上清，加入20～50μl试剂B；在55～65℃浴中保温5～10分钟，再加入10～50μl试剂C；55～65℃浴中保温5～10分钟，10000～12000g离心8～10分钟，取上清并加入上清体积2倍的无水乙醇沉淀DNA；室温放置5～10分钟，10000～12000g离心5～10分钟；去上清，70～75％乙醇洗涤沉淀1～2次，让乙醇彻底挥发，将沉淀溶于10～50μl灭菌双蒸水中，即为DNA提取液，2～8℃保存备用；3)多重PCR扩增在一PCR试剂管内加入0.5～1μl的DNA提取液，0.5～1.0μl 3U/μl Taq酶，3000～5000g离心2～5秒钟混匀，置PCR仪进行扩增；94～96℃解链2～5分钟，然后94～96℃变性40秒～1分钟，55～60℃复性30秒～1分钟，72℃延伸40秒～1分钟，如此进行循环25～35次，最后72℃延伸6～10分钟；4)PCR扩增产物分析取5～10μl扩增后的样品，与2-6μl 0.25～0.75％溴酚蓝上样缓冲液混合，在含有溴化乙锭浓度为0.5～1.0ug/ml的1.0～1.2％的琼脂糖中进行电泳和染色，在透射紫外灯下观察，如果样品孔有422bp和300bp核酸条带，说明样品有致病性鳗弧菌感染或污染，反之则没有。
全文摘要
本发明公开一种致病性鳗弧菌的PCR快速检测试剂盒及其检测方法。本发明的内容包括由缓冲试剂A、细胞裂解试剂B和C、PCR试剂管、Taq酶、普通琼脂糖、溴化乙锭溶液、溴酚蓝上样缓冲溶液组成的PCR检测试剂盒以及一套检测操作程序。本发明突出的优点是建立多重PCR反应，可快速、准确、敏感地检测出样品中的致病性鳗弧菌，为水产养殖动物的疾病诊断提供简单快速准确的方法，也可应用于对养殖水体和饲料的质量监测。
文档编号G01N33/569GK1595155SQ03133939
公开日2005年3月16日 申请日期2003年9月10日 优先权日2003年9月10日
发明者莫照兰, 张培军, 陈师勇, 邹玉霞, 张振冬, 王春玲, 肖鹏, 徐永立 申请人:中国科学院海洋研究所