免疫原性减弱的枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白的制作方法

专利名称：免疫原性减弱的枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白的制作方法
技术领域：
本发明提供鉴定枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白中CD4+T-细胞表位的方法。本发明还旨在生产改变的肽，当其被整合进野生型枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白时则产生改变的免疫应答，优选在人体内为弱免疫应答。特别地，本发明提供手段，包括适于减弱ALCALASE_酶免疫原性的方法和组合物。
背景技术：
用于工业、药物和商业用途的蛋白质渐趋主导并越来越重要。然而，这使得大量个体对这些蛋白质致敏，导致对这些蛋白质的变态反应普遍发生。例如，在特定个体中一些蛋白酶与超敏反应相关联。因此，尽管蛋白酶在工业(例如，在洗衣洗涤剂、化妆品、织物处理，等中)上有用，并且在该领域中为了提供改进的蛋白酶(例如，在典型洗衣条件下能更有效去除污渍的枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)已经做了广泛研究，蛋白酶在工业上的使用还是有问题的。
已经做了许多工作来缓解这些问题。已经开发的用于减弱蛋白酶应用免疫原性潜力的策略包括，通过控制和降低车间内携带有经空气传播的蛋白酶的粉尘颗粒和/或气溶胶的浓度来减少潜在接触的改良生产工艺，减少实际来自蛋白酶产品的粉尘或气溶胶的量的改良颗粒成型工艺，以及减少终产品中潜在的变应原性/免疫原性污染物水平的改良回收工艺。然而，相对来说降低蛋白酶自身变应原性/免疫原性的努力却不太成功。作为选择，已经努力尝试封闭蛋白酶上被超敏个体免疫球蛋白E(IgE)识别的表位(参见，PCT公开号No.WO 92/10755；WO 94/10191；WO 96/17929；WO 99/49056；和WO 01/07578)，或通过在问题蛋白酶上附加聚合物或肽/蛋白质来放大或改变抗原决定簇的本性。
尽管一些研究已经提供了降低特定蛋白质变应原性/免疫原性的方法以及鉴定一些个体中引起变态反应的表位的方法，但是用于鉴定这些表位的检测方法通常涉及测定事先已经暴露于这些抗原的个体血清中的IgE和IgG。然而，一旦已引发一种Ig反应，则致敏就已经产生。因此，需要鉴定产生增强免疫应答的蛋白质，还需要生产产生减弱免疫应答的蛋白质。
发明概述本发明提供鉴定枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白中CD4+T-细胞表位的方法。本发明还旨在生产改变的肽，当其被整合进野生型枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白时则产生改变的免疫应答，优选在人体内为弱免疫应答。特别地，本发明提供手段，包括适于减弱ALCALASE_酶的免疫原性的方法和组合物。本发明还旨在生产改变的肽，当其被整合进野生型枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白序列时再也不能引发CD4+T-细胞应答或者至少使变态应答减弱。特别地，本发明提供手段，包括适于减弱野生型枯草杆菌蛋白酶Carlsberg的免疫原性的方法和组合物。
在一种实施方式中，本发明提供ALCALASE_酶的T-细胞表位。这些表位提供在本文所列的各序列(参见，附图2和3)中，包括但不限于第5号肽(SEQ ID NO6)；第26号肽(SEQ ID NO27)；第37号肽(SEQ ID NO38)；第50号肽(SEQ ID NO51)；第51号肽(SEQ ID NO52)以及第79号肽(SEQ ID NO80)。在另一种实施方式中，本发明提供适于置换入ALCALASE_酶的已鉴定表位的改变序列。
在进一步的实施方式中，本发明提供鉴定T-细胞表位和T-细胞非-表位的检测系统，包括但不限于具有将分化的树突细胞与人CD4+和/或CD8+T-细胞结合以及与目的肽(例如，衍生自ALCALASE_酶的肽)结合的步骤的方法。更确切地，提供产生免疫应答减弱的目的肽，其中T-细胞表位通过以下步骤被识别(a)从单一血液来源获得树突细胞溶液和CD4+和/或CD8+T-细胞溶液；(b)促进树突细胞分化；(c)将分化的树突细胞溶液、CD4+T-细胞和/或CD8+T-细胞溶液与目的肽合并(例如，至少含有ALCALASE_一部分的肽)；和(d)测定步骤(c)中T-细胞的增殖。(参见例如，WO99/53038；和Strickler等人，J.Immunother.，23654-660)。
在发明的另一实施方式中，提供了一系列与ALCALASE_酶全部或部分对应的肽寡聚体。例如，构建了一个覆盖ALCALASE_酶相关部分或全部的肽文库。一方面，制备肽的方式是向肽文库中引入重叠，例如，制备与ALCALASE_酶氨基酸序列第1～15位对应的第一个肽、与ALCALASE_酶氨基酸序列第4～18位对应的第二个肽、与ALCALASE_酶氨基酸序列第7～21位对应的第三个肽、与ALCALASE_酶氨基酸序列第10～24位对应的第四个肽，直到产生与整个ALCALASE_酶分子对应的代表性肽。通过在本文所提供的检测方法中分别分析各肽，有可能精确鉴定由T-细胞识别的表位的位置。上述例子中，某一特定肽与其相邻肽相比反应更强使得在将表位锚定区限定至三个氨基酸变得容易。确定了这些表位的定位后，有可能在各表位内改变一或更多个氨基酸。之后可将经修饰的表位整合进野生型枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白主链。在特别优选的实施方式中，得到的修饰枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白产生不同的T-细胞应答，优选为与野生型蛋白产生的T-细胞应答相比减弱的T-细胞应答。此外，本发明提供鉴定天然具有令人满意的低T-细胞表位效力并能以天然产生形式进行利用的蛋白质的方法。
本领域已知的各种体外和体内检测方法可用于确定根据本发明获得的修饰蛋白质的减弱的免疫应答。体内检测包括但不限于HLA II类应答，更确切的是HLA-DR3/DQ2小鼠T-细胞应答。适宜的体外检测包括但不限于人外周血单核细胞(PBMC)检测(参见例如，Herman等人，J.Immunol.，1636275-6282；Sonderstrup等人，Immunol.Rev.，172335-343；Taneja和David，Immunol.Rev.，16967-79；Taurog等人，Immunol.Rev.169209-223；Cosgrove，等人，Cell 661051-1066；和Grusby等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，903913-3917)。
本发明进一步提供免疫原性减弱的修饰的枯草杆菌蛋白酶Carlsberg组合物。特别是，本发明提供ALCALASE_酶组合物，其中含有如本文所述可以降低针对ALCALASE_酶的免疫应答的表位。
本发明还提供鉴定微生物枯草杆菌蛋白酶的至少一个T-细胞表位的方法，包括步骤(i)从单一人血液来源获得树突细胞溶液和原初CD4+和/或CD8+ T-细胞溶液；(ii)分化树突细胞以产生分化的树突细胞溶液；(iii)将分化的树突细胞和原初CD4+和/或CD8+ T-细胞溶液与枯草杆菌蛋白酶Carlsberg肽片段合并；和(iv)测定步骤(iii)中T-细胞的增殖。在一些优选实施方式中，微生物枯草杆菌蛋白酶Carlsberg来自芽孢杆菌(Bacillus)属的成员。在特别优选的实施方式中，芽孢杆菌选自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、B.alkalophilus、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、B.clausii、B.halodurans、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。在另一种可选择的优选实施方式中，微生物枯草杆菌蛋白酶Carlsberg含有至少一部分sEQ ID NO1所示序列。
本发明进一步提供减弱微生物枯草杆菌蛋白酶Carlsberg免疫原性的方法，包括步骤(a)通过步骤(i)和(ii)来鉴定蛋白质中至少一个T-细胞表位(i)将粘着的单核细胞衍生的树突细胞与含有T-细胞表位的至少一种肽接触，其中树突细胞已通过在体外暴露于至少一种细胞因子而分化；以及(ii)将树突细胞和肽与原初T-细胞接触，其中原初T-细胞与粘着的单核细胞衍生的树突细胞获自同一来源，且由此T-细胞在对肽的应答中增殖；和(b)修饰枯草杆菌蛋白酶Carlsberg以中和T-细胞表位从而产生变体蛋白，这样变体蛋白质诱导低于原初T-细胞基线增殖或基本上与基线增殖相等的增殖。在一些优选实施方式中，微生物枯草杆菌蛋白酶Carlsberg衍生自芽孢杆菌属成员。在特别优选的实施方式中，芽孢杆菌选自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、B.alkalophilus、解淀粉芽孢杆菌、B.clausii、B.halodurans、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、和苏云金芽孢杆菌。在另一种可选择的优选实施方式中，微生物枯草杆菌蛋白酶Carlsberg至少含有部分SEQ ID NO1所示序列。在一些实施方式中，通过用来自微生物枯草杆菌蛋白酶同源物的相似序列置换T-细胞表位的氨基酸序列来修饰微生物枯草杆菌蛋白酶Carlsberg表位，其中置换本质上模拟形成T-细胞表位的三级结构。在另一可选的实施方式中，通过改变选自SEQ ID NO2、SEQ ID NO90、SEQ ID NO15、SEQ ID NO30、和SEQ ID NO40的至少一个表位来修饰微生物枯草杆菌蛋白酶Carlsberg。在更进一步的实施方式中，通过置换氨基酸序列中与表位中至少一个残基对应的残基来修饰表位。在另一附加实施方式中，通过删除氨基酸序列中与表位中至少一个残基对应的残基来修饰表位。在另一可选的实施方式中，通过向至少一个表位中添加氨基酸来修饰表位。
本发明还提供修饰的枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶(即，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)。在一些优选实施方式中，这些枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体在至少一个表位含有至少一个改变，这些表位含有选自SEQ ID NO2、SEQ ID NO90、SEQ ID NO15、SEQ IDNO30、和SEQ ID NO40的氨基酸序列。事实上，本发明提供无数枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体。在特别优选的实施方式中，这些变体酶与野生型枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶相比呈现减弱的免疫原性/变应原性。这些变体酶可用在从个人/消费者护理物品到工业生产和用途的大量产品和方法中。
附图简述附

图1提供在ALCALASE_酶中发现的枯草杆菌蛋白酶Carlsberg的成熟蛋白序列(SEQ ID NO1)。该附图中，第106位的成熟多肽起点以加有下划线的残基表示(AQTVP)。
附图2提供分别对应于SEQ ID NO2～89的并且根据序列SEQID NO1合成的第1～88号肽的氨基酸序列。
附图3提供附图2中所示肽的检测结果。
发明详述本发明提供鉴定枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白中CD4+T-细胞表位的方法。本发明还旨在生产改变的肽，当其被整合进野生型枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白时则产生改变的免疫应答，优选在人体内为弱免疫应答。特别地，本发明提供手段，包括适于减弱ALCALASE_酶的免疫原性的方法和组合物。本发明还旨在生产改变的肽，当其被整合进野生型枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白序列时再也不能引发CD4+T-细胞应答或者至少使变态应答减弱。特别地，本发明提供手段，包括适于减弱野生型枯草杆菌蛋白酶Carlsberg的免疫原性的方法和组合物。
定义若本文中另有定义，则本文中所使用的所有科技术语具有与本发明有关领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。例如，Singleton和Sainsbury，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology，第二版，John Wiley和Sons，NY(1994)；以及Hale和Marham，TheHarper Collins Dictionary of Biology，Harper Perennial，NY(1991)向本领域技术人员提供了本发明所使用许多术语的一般字典。尽管任何与本发明所述类似或相同的方法和材料可用于本发明的实践，本文描述了优选的方法和材料。因此，以下马上要定义的术语通过参考整个说明书将得到更充分的描述。同时，如本文中所使用的，单数“a”、“an”以及“the”包括复数含义，除非上下文中已经清楚的指明。
如本文所使用的，“芽孢杆菌属”包括本领域技术人员已知的所有成员，包括但不限于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、B.alkalophilus、解淀粉芽孢杆菌、B.clausii、B.halodurans、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、和苏云金芽孢杆菌。已知芽孢杆菌属不断进行着分类学上的改编。因此，该属将可能包括重新分类的种，包括但不限于，例如嗜热脂肪芽孢杆菌这样的生物——其现在被命名“Geobacillus stearothermophilus”。在有氧条件下产生抗性内生孢子是芽孢杆菌属的定义特征，尽管该特征也被用于近来命名的脂环酸杆菌属(Alicyclobacillus)、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、Aneurinibacillus、Anoxybacillus、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、Filobacillus、Gracilibacillus、Halobacillus、Paenibacillus、Salibacillus、热杆菌属(Thermobacillus)、Ureibacillus、和Virgibacillus。
本文所使用的术语“野生型枯草杆菌蛋白酶Carlsberg”包括i)熟知的枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白，例如可从Novo商业获得的ALCALASE_酶(SEQ ID NO1)；可从Genencor商业获得的MAXATASE_酶；和可从Kali-Chemie商业获得的OPTIMASE_酶；ii)具有与ALCALASE_相似的催化活性、以及与SEQ ID NO1至少大约80％，85％，90％，95％，97％，98％或99％氨基酸序列同一性的枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白，且优选具有与SEQ IDNO1至少90％的氨基酸同一性；和iii)枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白变体。
本文所使用的术语“ALCALASE_”是指丝氨酸蛋白酶，即源自SwissProt登记号为P00780的地衣芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶Carlsberg。这个蛋白质具有379个氨基酸残基。前蛋白包括105个氨基酸残基，成熟蛋白包括274个氨基酸残基(参见，附图1，SEQ IDNO1；以及参见，Jacobs等人，Nucleic Acids Res.，138913-8926；及Smith等人，J.Biol.Chem.，2432184-2191)。
如本文所使用的，术语“修饰的野生型枯草杆菌蛋白酶Carlsberg”、“修饰的ALCALASE_”和“修饰的变体”是指其中至少一个重要的野生型枯草杆菌蛋白酶Carlsberg和特别是ALCALASE_的T-细胞表位已被改变的蛋白质。
如本文所使用的，“野生型”和“天然”蛋白质是那些在自然界中发现的蛋白质。术语“野生型序列”和“野生型基因”在本文中可互换使用，指天然的或在宿主细胞中自然产生的序列。在一些实施方式中，野生型序列是指作为蛋白质工程计划起点的目的序列。可通过本领域技术人员公知的技术获得编码天然出现(即，前体)蛋白质的基因。这些方法通常包括合成具有目的蛋白质编码区推定序列的标记探针，从表达该蛋白质的生物制备基因组文库，和通过探针杂交从文库中筛选目的基因。之后对阳性杂交克隆进行作图和测序。
“重组体”、“重组枯草杆菌蛋白酶”和“重组蛋白酶”是指这样一种蛋白质、枯草杆菌蛋白酶或蛋白酶，其中编码蛋白质、枯草杆菌蛋白酶或蛋白酶的DNA序列被修饰以产生在天然产生的氨基酸序列中编码取代、缺失或插入一或更多个氨基酸的DNA序列变体(或突变体)。适宜的可以产生如此修饰、并可与本文中公开的那些方法组合的方法，包括但不限于那些公开于US专利4 760 025(US RE 34 606)、US专利5 204 015和US专利5 185 258的方法，所有这些专利引入本文作为参考。
“非-人枯草杆菌蛋白酶”以及编码它们的DNA序列获自许多原核和真核生物。适宜的原核生物例子包括革兰氏阴性生物(例如，大肠杆菌(E.coli)和假单孢菌属物种(Pseudomonas sp.))，以及革兰氏阳性细菌(例如，微球菌(Micrococcus sp.)和芽孢杆菌(Bacillus sp.))。可以从中获得枯草杆菌蛋白酶及其基因的真核生物例子包括真菌，例如啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)和曲霉属物种(Aspergillussp.)。
本文所使用的术语“样品”以其最宽泛的含义使用。然而，在优选实施方式中，该术语用作指含有用于分析、鉴定、修饰、和/或与其它肽进行比较的肽(例如，肽组(pepset)中的含有目的蛋白质序列的肽)的样品(例如，等分样品)。因此，在大多数情况下，该术语用于指包括目的蛋白质或肽的材料。
如本文所使用的，“背景水平”和“背景应答”指任一测试蛋白质数据组中针对任一给定肽的应答者的平均百分数。通过对该组中所有肽的应答者的百分数取平均值来测定该值。例如，3％的背景应答表示，当对100名供体进行测试时，对一个数据组中的任一肽而言平均将有3名阳性(SI大于2.95)应答。
如本文所使用的，“抗原呈递细胞”(“APC”)指免疫系统中在其表面呈递抗原的细胞，由此抗原可被T-细胞表面的受体识别。抗原呈递细胞包括但不限于树突细胞、交错突细胞、激活的B-细胞和巨噬细胞。
如本文所使用的，术语“T淋巴细胞”和“T-细胞”，包括T淋巴细胞系中从T-细胞前体(包括未发生T细胞受体基因重排的Thy1阳性细胞)到成熟T细胞(即，对CD4或CD8呈现单一阳性，表面TCR阳性细胞)的任何细胞。
如本文所使用的，“CD4+T-细胞”和“CD4 T-细胞”指辅助T-细胞，而“CD8+T-细胞”和“CD8 T-细胞”指细胞毒性T-细胞。
本文所使用的“T-细胞增殖”指在有或无抗原存在下、与抗原呈递细胞共培养期间产生的T-细胞数量。
本文所使用的“基线T-细胞增殖”，指在无肽或蛋白质抗原存在时在个体中正常观测到的对抗原呈递细胞的应答中T-细胞增殖的程度。为了本文的目的，基线T-细胞增殖水平以各个体每样品为基础定为在无抗原存在时对抗原呈递细胞产生的应答中T-细胞的增殖。
如本文所使用的，“T-细胞表位”是指，在引发对含有该抗原(即，免疫原)的肽的免疫原性应答中被T-细胞受体识别的肽或蛋白质特征。尽管无意将本发明限制于任何特定的机制，通常相信T-细胞对T-细胞表位的识别是通过这样一种机制其中T-细胞识别抗原的肽片段，所述肽片段结合于由抗原呈递细胞表达的I类或II类MHC(即，HLA)分子(参见例如，Moeller，Immunol.Rev.，98187)。
如本文所使用的，“改变的T-细胞表位”指氨基酸序列不同于前体肽或目的肽的表位，这样变体目的肽在人或另一动物中产生不同的免疫应答。预期改变的免疫应答包括改变的免疫原性和/或变应原性(即，抑或增强抑或减弱的整体免疫原性应答)。在一些实施方式中，改变的T-细胞表位含有氨基酸的取代和/或缺失，该氨基酸选自已鉴定的表位中的那些残基。在另一可选的实施方式中，改变的T-细胞表位在表位中含有一或更多个残基的添加。
如本文所使用的，“弱显著的T-细胞表位”指这样的表位，其中在所测试的供体库中其应答率大于背景应答率，但低于三倍的背景应答率。
如本文所使用的，术语“B淋巴细胞”和“B-细胞”包括B-细胞系中从B-细胞前体，例如前B-细胞(已开始重排Ig重链基因的B220+细胞)，到成熟B-细胞和浆细胞的任何细胞。
如本文所使用的，“B-细胞增殖”是指在有或无抗原存在下，与抗原呈递细胞培养期间产生的B-细胞的数量。
如本文所使用的，“基线B-细胞增殖”，指在无肽或蛋白质抗原存在时在个体中正常观测到的对抗原呈递细胞的应答中B-细胞增殖的程度。为了本文的目的，基线B-细胞增殖水平以各个体每样品为基础定为在无抗原存在时B-细胞的增殖。
如本文所使用的，“B-细胞表位”是指，在对含有该抗原(即，免疫原)的肽的免疫原性应答中被B-细胞受体识别的肽或蛋白质特征。
如本文所使用的，“改变的B-细胞表位”指与前体肽或目的肽不同的表位氨基酸序列，这样变体目的肽在人或另一动物中产生不同的(即，改变的)免疫原性应答。预期改变的免疫原性应答包括改变的免疫原性和/或变应原性(即，抑或增强抑或减弱的整体免疫原性应答)。在一些实施方式中，改变的B-细胞表位含有氨基酸的取代和/或缺失，该氨基酸选自已鉴定的表位中的那些残基。在另一可选的实施方式中，改变的B-细胞表位在表位中含有一或更多个残基的添加。
如本文所使用的，术语“显著表位”是指这样的表位(即，T-细胞或B-细胞表位)，其中所测试个体库中的应答率等于或大于约三倍的背景应答率。
本文所使用的“改变的免疫原性应答”是指增强或减弱的免疫原性应答。当蛋白质和肽引起比亲体(例如，前体)蛋白质或肽(例如，目的蛋白质)更强的T-细胞和/或B-细胞应答时，它们表现“增强的免疫原性应答”。这一增强应答的最终结果是增强的针对变体蛋白或肽的抗体应答。当蛋白质和肽引起比亲体(例如，前体)蛋白质或肽更弱的T-细胞和/或B-细胞应答时，它们表现“减弱的免疫原性应答”。在优选实施方式中，这一降低的应答的最终结果是减弱针对变体蛋白质或肽的抗体应答。在一些优选实施方式中，亲体蛋白质是野生型蛋白质或肽。
如本文所使用的，“体内免疫原性减弱”是指通过检测判定的至少部分在活体生物内进行的(例如，要求使用活动物)免疫应答的减弱。典型的“体内”检测包括在小鼠模型中测定改变的免疫原性应答。
如本文所使用的，“体外免疫原性减弱”是指通过在活体生物外的人工环境下进行的(即，不需要使用活动物)检测判定的免疫原性应答的减弱。典型的体外测试包括人外周血单核细胞对目的肽的增殖应答。
如本文所使用的，“目的蛋白质”是指将用于分析、鉴定和/或修饰的蛋白质(例如，蛋白酶)。天然存在的，以及重组蛋白质可用于本发明。当然，任何想要表征和/或调节人(或其它动物)对其的免疫应答的蛋白质可用于本发明。在一些实施方式中，包括激素、细胞因子、抗体、酶、结构蛋白和结合蛋白的蛋白质可用于本发明。在一些实施方式中，激素，包括但不限于胰岛素、促红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)和黄体生成素(LH)可用于本发明。在进一步的实施方式中，细胞因子，包括但不限于干扰素(例如，IFN-α和IFN-β)、白介素(例如，IL-1～IL-15)、肿瘤坏死因子(例如，TNF-α和TNF-β)、和GM-CSF可用于本发明。在其它的实施方式中，抗体(即，免疫球蛋白)，包括但不限于任何类别的人和人源化抗体、抗体片段(例如，单链抗体)可用于本发明。仍在其它实施方式中，结构蛋白质，包括但不限于食物变应原(例如，Ber e1[巴西坚果变应原]和Ara H1[花生变应原])可用于本发明。在另外的实施方式中，蛋白质是工业和/或药物酶。在一些实施方式中，优选的酶类别包括但不限于蛋白酶、纤维素酶、脂酶、酯酶、淀粉酶、苯酚氧化酶、氧化酶、通透酶、支链淀粉酶、异构酶、激酶、磷酸酶、内酰胺酶和还原酶。
如本文所使用的，“蛋白质”是指任何含有氨基酸并被本领域技术人员认作蛋白质的组合物。术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”在本文中可互换使用。氨基酸可以用它们的全名(例如，丙氨酸)或公认的单字母(例如，A)、或三字母(例如，ala)缩写指代。其中肽是蛋白质的一部分，本领域技术人员理解该术语在上下文中的使用。术语“蛋白质”包括成熟形式的蛋白质，以及相关蛋白质的-原(pro)和前-原(prepro)形式。蛋白质的前-原形式包括具有可操作性连接于蛋白质氨基末端的原序列(prosequence)、和可操作性连接于原序列氨基末端的“前-”或“信号”序列的蛋白质成熟形式。在优选实施方式中，蛋白质是蛋白酶。在一些特定的优选实施方式中，该蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶，而在另一可选的优选实施方式，该蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶Carlsberg。
如本文所使用的，“野生型”和“天然”蛋白质是那些在自然界中发现的蛋白质。术语“野生型序列”和“野生型基因”在本文中可互换使用，指天然的或在宿主细胞中自然产生的序列。在一些实施方式中，野生型序列是指作为蛋白质工程计划起点的目的序列。
如本文所使用的，“蛋白酶”指天然存在的蛋白酶，以及重组蛋白酶。蛋白酶是羰基水解酶，其一般切割蛋白质或肽的肽键。天然存在的蛋白酶包括但不限于，如α-氨酰基肽水解酶、肽基氨基酸水解酶、酰胺基水解酶、丝氨酸羧肽酶、金属羧肽酶、巯基蛋白酶、羧基蛋白酶和金属蛋白酶这样的例子。也包括丝氨酸、金属、巯基和酸蛋白酶，以及内切和外切-蛋白酶。当然，在一些优选实施方式中，可以使用丝氨酸蛋白酶例如胰凝乳蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶。这两个丝氨酸蛋白酶都具有一个包括天冬氨酸、组氨酸和丝氨酸的催化三联体。在枯草杆菌蛋白酶蛋白酶中，这些氨基酸从羧基端读起的相对顺序是天冬氨酸-组氨酸-丝氨酸，而在胰凝乳蛋白酶中，这些氨基酸从羧基端读起的相对顺序是组氨酸-天冬氨酸-丝氨酸。尽管枯草杆菌蛋白酶典型获自细菌、真菌或酵母，本文所使用的“枯草杆菌蛋白酶”是指具有如上述所定义的枯草杆菌蛋白酶催化三联体的丝氨酸蛋白酶。此外，人枯草杆菌蛋白酶是具有枯草杆菌蛋白酶催化活性的人源蛋白质，例如人源蛋白酶的kexin家族。枯草杆菌蛋白酶是本领域技术人员熟知的，例如，解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(BPN’)、迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、枯草杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(参见例如，US专利No.4 760 025(RE 34 606)、US专利No.5 204015、US专利No.5 185 258、欧洲专利No.0 328 299、和WO89/06279)。在本发明的一些优选实施方式中，该术语用于指枯草杆菌蛋白酶，而在特别优选的实施方式中，该术语是指ALCALASE_酶。
如本文所使用的，“蛋白质”是指任何含有氨基酸并被本领域技术人员认作蛋白质的组合物。术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”在本文中可互换使用。其中肽是蛋白质的一部分，本领域技术人员理解该术语在上下文中的使用。术语“蛋白质”包括成熟形式的蛋白质，以及相关蛋白质的-原和前-原形式。蛋白质的前-原形式包括具有可操作性连接于蛋白质氨基末端的原序列、和可操作性连接于原序列氨基末端的“前-”或“信号”序列的蛋白质成熟形式。如本文所使用的，功能相似的蛋白质被视作“相关的蛋白质”。在一些实施方式中，这些蛋白质衍生自不同的属和/或种(例如，枯草芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶和迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶)，包括生物类别间的差异(例如，细菌枯草杆菌蛋白酶和真菌枯草杆菌蛋白酶)。在另外的实施方式中，相关蛋白质得自同一个种。当然，本发明无意限制任何来源的相关蛋白质。
如本文所使用的，术语“衍生物”指通过同时在C-和N-末端或两者之一添加一或更多个氨基酸、在氨基酸序列中一或更多个不同位点取代一或更多个氨基酸、和/或在蛋白质的两个或一个末端或在氨基酸序列中的一或更多个位点缺失一或更多个氨基酸、和/或在氨基酸序列中的一或更多个位点插入一或更多个氨基酸而衍生自前体蛋白质(例如，天然蛋白酶)的蛋白质(例如，蛋白酶)。优选通过修饰编码天然蛋白质的DNA序列、将该DNA序列转化入宿主细胞、并表达修饰的DNA序列以形成衍生的蛋白酶来制备蛋白酶衍生物。
一种相关(及衍生的)蛋白质类型为“变体蛋白质”。在优选实施方式中，变体蛋白与亲体蛋白质以及变体蛋白相互之间的区别仅在于少数几个氨基酸残基。差异氨基酸的数量可以是一个或更多，优选1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、或更多个氨基酸残基。在一种优选实施方式中，变体间的差异氨基酸数量介于1至10之间。在特别优选的实施方式中，相关蛋白质和特定的变体蛋白包含至少50％、60％、65％。70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、或99％的氨基酸序列同一性。此外，本文所使用的相关蛋白质和变体蛋白是指，在突出区域(prominent region)的数量上区别于另一相关蛋白质或亲体蛋白质的蛋白质。例如，在一些实施方式中，变体蛋白具有区别于亲体蛋白质的1、2、3、4、5、或10个相应突出区域。在一种实施方式中，变体的突出相应区域仅产生背景水平的免疫原性应答。
如本文所使用的，“相应”是指在蛋白质或肽中计数位置的残基，或与另一蛋白质或肽中计数位置的残基类似、同源或等同的残基。
如本文所使用的，“相应区域”通常是指在相关蛋白质或亲体蛋白质中的类似位置。
如本文所使用的，术语“类似序列”指蛋白质中提供与目的蛋白质相似功能、三级结构和/或保守残基的序列。在特别优选的实施方式中，类似序列涉及位于表位或其附近的序列。例如，在包含α螺旋或β折叠结构的表位区域，在类似序列中的氨基酸取代优选保持相同的特定结构。该术语也指核苷酸序列，以及氨基酸序列。
如本文所使用的，“同源蛋白质”指与目的蛋白质(即，蛋白酶)具有相似催化活性、结构、抗原性、和/或免疫原性应答的蛋白质(例如，蛋白酶)。同源物或目的蛋白质(例如，蛋白酶)不必是进化上相关联的。因此，该术语包括获自不同种的功能相同的蛋白质。在一些优选实施方式中，令人满意的是对与目的蛋白质具有相似三级和/或一级结构的同源物进行鉴定，因为用同源物中的类似部分取代目的蛋白质中的表位不会导致由于该变化而带来的蛋白质破坏。因此，在大多数情况下，非常同源的蛋白质为表位置换提供了最理想的来源。作为选择，寻找给定蛋白质的人类似物是比较有利的。
在优选实施方式中，本文所使用的“同源物”意指与ALCALASE_酶有相似催化活性、结构和/或用途的酶。在一些优选实施方式中，本发明的ALCALASE_酶同源物具有与野生型ALCALASE_酶基本上相似的三级和/或一级结构。显著的ALCALASE_酶表位可以用来自同源酶的类似片段进行取代。这种类型的取代能减弱由亲体枯草杆菌蛋白酶中的变化所引起的破坏。在大多数情况下，非常同源的蛋白质提供最令人满意的表位置换来源。
如本文所使用的，“同源基因”是指至少一对来自不同、但通常相关物种的基因，它们彼此对应且彼此一致或非常相似。该术语包括通过物种形成(即，新物种的发展)而分离的基因(例如，直向同源基因)，以及由遗传复制而分离的基因(例如，平行进化同源基因)。
如本文所使用的，“直向同源物”和“直向同源基因”指不同物种中通过物种形成从共同的祖先基因(即，同源基因)进化而来的基因。典型地，直向同源物在进化过程中保持相同的功能。直向同源物的鉴定可用于在新测序基因组中对基因功能的可靠预测。
如本文所使用的，“平行进化同源物”和“平行进化同源基因”指基因组中通过复制相关联的基因。尽管直向同源物在进化过程中保持相同的功能，平行进化同源物却进化出新功能，尽管一些功能常与最初的功能相关联。平行进化同源基因的例子包括但不限于，编码胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶和凝血酶的基因，它们都是丝氨酸蛋白酶并一起出现在同一物种中。
序列间的同源程度可通过本领域公知的适宜方法进行测定(参见例如，Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.，2482；Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.，48443；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444；programs such asGAP，BESTFIT，FASTA，and TFASTA in the Wisconsin GeneticsSoftware Package(Genetics Computer Group，Madison，WI)；和Devereux等人，Nucl.Acid Res.，12387-395)。
例如，PILEUP是一个测定序列同源性水平的有用程序。PILEUP通过渐进的、成对比对从一组相关序列生成多重序列比对。它还能绘制用于生成该比对的聚类关系(clustering relationship)的树形图。PILEUP使用了Feng和Doolittle的渐进比对方法的简化形式(Feng和Doolittle，J.Mol.Evol.，35351-360)。该方法与Higgins和Sharp所描述的相似(Higgins和Sharp，CABIOS 5151-153)。有用的PILEUP参数包括默认缺口权重3.00，默认缺口长度权重0.10，和加权末端缺口。另一个有用的算法例子是由Altschul等人描述的BLAST算法(Altschul等人，J.Mol.Biol.，215403-410，；和Karlin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5787)。一个特别有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序(参见，Altschul等人，Meth.Enzymol.，266460-480)。参数“W”、“T”、和“X”决定比对的敏感度和速度。BLAST程序默认使用字长(wordlength，W)为11、BLOSUM62记分阵列(scoring matrix)(参见，Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915)比对(B)为50、期望值(E)为10、M’5、N’-4、和两条链的比较。
如本文所使用的，“核酸序列同一性百分数(％)”定义为候选序列中与序列中核苷酸残基一致的核苷酸残基百分数。
如本领域已知，本文所使用的术语“杂交”指一条核酸链通过碱基残基不保守的情况下，对一或更多个氨基酸的取代限于产生变体的置换，该变体具有与自然界中发现的氨基酸序列不对应的氨基酸序列。在残基保守的情况下，这样的取代不应产生天然存在的序列。本发明提供的衍生物进一步包括改变蛋白酶特征的化学修饰。
在一些优选实施方式中，蛋白质基因连接进适宜的表达质粒。之后将克隆的蛋白质基因转化或转染宿主细胞以表达蛋白质基因。质粒可以在宿主中复制，只要它含有质粒复制所必需的公知元件或该质粒被设计成可以整合进宿主染色体中。必需元件是为有效的基因表达提供的(例如，与目的基因可操作性相连的启动子)。在一些实施方式中，这些必需元件可以是基因自己的同源启动子——如果它可以被识别的话(即，被宿主转录)、外源或由蛋白质基因的内源终止子区域提供的转录终止子(真核宿主细胞的多聚腺苷酸化区域)。在一些实施方式中，还包括选择基因，例如抗生素抗性基因，它能使被质粒感染的宿主细胞在含有抗菌剂的培养基中持续培养。
本发明包括具有改变的免疫原性的蛋白酶，其与衍生自所述及的特定微生物菌株的蛋白酶等价。作为“等价”意指，该蛋白酶是由在中等或高严谨条件下能够与具有附图1所示任一序列的多核苷酸杂交的多核苷酸编码的，并仍然保持对人T-细胞的改变的免疫原性应答。作为“等价”意指，该蛋白酶与表位序列和具有该表位的蛋白酶变体(例如，具有修饰的氨基酸序列)具有至少55％、至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少97％或至少99％的同一性。
如本文所使用的，术语“杂合蛋白酶”和“融合蛋白酶”指从至少两种不同或“亲体”蛋白质工程化而得的蛋白质。在优选实施方式中，这些亲体蛋白质彼此为同源物。例如，在一些实施方式中，优选的杂合蛋白酶或融合蛋白酶包含一种蛋白质的N-末端和该蛋白质的同源物的C-末端。在一些优选实施方式中，两个末端结合以对应于全长的活性蛋白。在另一种可选择的优选实施方式中，同源物基本上相似但不具有相同的T-细胞表位。因此，在一种实施方式中，本发明提供在残基不保守的情况下，对一或更多个氨基酸的取代限于产生变体的置换，该变体具有与自然界中发现的氨基酸序列不对应的氨基酸序列。在残基保守的情况下，这样的取代不应产生天然存在的序列。本发明提供的衍生物进一步包括改变蛋白酶特征的化学修饰。
在一些优选实施方式中，蛋白质基因连接进适宜的表达质粒。之后将克隆的蛋白质基因转化或转染宿主细胞以表达蛋白质基因。质粒可以在宿主中复制，只要它含有质粒复制所必需的公知元件或该质粒被设计成可以整合进宿主染色体中。必需元件是为有效的基因表达提供的(例如，与目的基因可操作性相连的启动子)。在一些实施方式中，这些必需元件可以是基因自己的同源启动子——如果它可以被识别的话(即，被宿主转录)、外源或由蛋白质基因的内源终止子区域提供的转录终止子(真核宿主细胞的多聚腺苷酸化区域)。在一些实施方式中，还包括选择基因，例如抗生素抗性基因，它能使被质粒感染的宿主细胞在含有抗菌剂的培养基中持续培养。
本发明包括具有改变的免疫原性的蛋白酶，其与衍生自所述及的特定微生物菌株的蛋白酶等价。作为“等价”意指，该蛋白酶是由在中等或高严谨条件下能够与具有附图1所示任一序列的多核苷酸杂交的多核苷酸编码的，并仍然保持对人T-细胞的改变的免疫原性应答。作为“等价”意指，该蛋白酶与表位序列和具有该表位的蛋白酶变体(例如，具有修饰的氨基酸序列)具有至少55％、至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少97％或至少99％的同一性。
如本文所使用的，术语“杂合蛋白酶”和“融合蛋白酶”指从至少两种不同或“亲体”蛋白质工程化而得的蛋白质。在优选实施方式中，这些亲体蛋白质彼此为同源物。例如，在一些实施方式中，优选的杂合蛋白酶或融合蛋白酶包含一种蛋白质的N-末端和该蛋白质的同源物的C-末端。在一些优选实施方式中，两个末端结合以对应于全长的活性蛋白。在另一种可选择的优选实施方式中，同源物基本上相似但不具有相同的T-细胞表位。因此，在一种实施方式中，本发明提供在C-末端具有一个或更多个T-细胞表位的目的蛋白酶，但是用在C-末端具有更弱的T-细胞表位、或更少或无T-细胞表位的同源物的C-末端取代其C-末端。因而，熟练技术人员理解，通过得以在同源物中鉴定T-细胞表位，可以形成大量产生不同免疫原性应答的变体。此外，可以理解内部区域以及多于一个同源物可用于产生本发明的变体。
本发明的变体包括蛋白质变体的成熟形式，以及这些蛋白质变体的-原和前-原形式。前-原形式是优选的结构，因为这有利于蛋白质变体的表达、分泌和成熟。
如本文所使用的，“原序列”指结合于蛋白质成熟形式氨基末端部分的氨基酸序列，当将其去除后导致蛋白质“成熟”形式的出现。自然界中发现了许多蛋白水解酶作为翻译后的酶原(proenzyme)产物，并且它们在无翻译后加工的情况下以这种方式表达。一种产生蛋白质变体例如蛋白酶变体的优选原序列是推定的地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶Carlsberg原序列，尽管其它原序列可用于本发明。
如本文所使用的，“信号序列”和“前导序列”指任何结合于蛋白质N-末端部分、或蛋白质原N-末端部分并可能参与蛋白质成熟或原形式的分泌的氨基酸序列。该信号序列的定义是功能性的，意欲包括所有由蛋白质基因N-末端部分编码、在天然条件下参与蛋白质分泌的完成的氨基酸序列。本发明利用这样的序列来实现本文所述的蛋白质变体的分泌。
如本文所使用的，蛋白质变体的“前-原”形式由以下组成具有与蛋白质氨基末端可操作性相连的原序列、以及与原序列氨基末端可操作性相连的“前导”或“信号”序列的蛋白质成熟形式。
本文所使用的术语“调控元件”指控制核酸序列表达的某些方面的遗传元件。例如，启动子是促进一段可操作性连接的编码区域转录的调控元件。其它的调控元件包括剪接信号、多聚腺苷酸化信号和终止信号。
如本文所使用的，“表达载体”指含有与能够实现DNA在适宜宿主中表达的适宜控制序列可操作性相连的DNA序列的DNA构建体。这样的控制序列包括实现转录的启动子、可选的控制如此转录的操纵子序列、编码适宜的mRNA核糖体结合位点的序列和控制转录及翻译终止的序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒、或仅仅是潜在的基因组插入物。一旦转化进入适宜的宿主，载体即可独立于宿主基因组进行复制和发挥功能，或在一些例子中可以自己整合进基因组。本说明书中，“质粒”和“载体”有时可以互换使用，因为质粒是当前最常用的载体形式。然而，本发明意图包括已知或将被本领域所知的具有等价功能的其它表达载体形式。
如本文所使用的，“宿主细胞”通常为已用本领域公知的方法(参见例如，US专利4 760 025(RE 34 606))操作过以使它们不能分泌具有酶促活性的内源蛋白酶的原核或真核宿主。一种表达蛋白质的优选宿主细胞为芽孢杆菌菌株BG2036，该菌株为具酶促活性的中性蛋白质和碱性蛋白酶(枯草杆菌蛋白酶)缺陷型。菌株BG2036的构建详细描述于US专利5 264 366。其它表达蛋白质的宿主细胞包括枯草芽孢杆菌I168(也描述于US专利4 760 025(RE 34 606)和US专利5 264 366)，以及任何适宜的芽孢杆菌菌株，包括地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、和其它芽孢杆菌等种内的菌株。
将用本领域已知的重组DNA技术构建的载体转化或转染进宿主细胞。转化的宿主细胞能够复制编码变体蛋白质的载体或者表达想要的蛋白质变体。若载体编码蛋白质变体的前-或前-原形式，则这样的变体被表达时通常从宿主细胞分泌到宿主细胞培养基中。
上下文中涉及将核酸序列插入细胞的术语“被导入”意指，转化、转导或转染。转化方法包括原生质体转化、氯化钙沉淀、电穿孔、裸露DNA和类似的本领域已知方法。(参见，Chang和Cohen(1979)Mol.Gen.Genet.168111-115；Smith等人，(1986)Appl.and Env.Microbiol.51634；以及Ferrari等人的综述文章，(1989)Genetics，pages 57-72 in Bacillus ed.C.Harwood，Plenum PublishingCorporation)。
在涉及蛋白酶的实施方式中，可以通过检测蛋白酶与各种商业底物，包括但不限于酪蛋白、角蛋白、弹性蛋白和胶原蛋白，的相互作用来测定蛋白酶变体的活性并与目的蛋白酶相比较。当然，可用本领域已知的任何适宜方法测定蛋白酶活性。测定蛋白酶活性的典型检测方法包括但不限于琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-对硝基苯胺(SAAPFpNA)(引用)检测；和2，4，6-三硝基苯磺酸钠盐(TNBS)检测。在SAAPFpNA检测中，蛋白酶切割肽与对硝基苯胺间的键从而产生在405nm处吸收的可见黄色。在TNBS颜色反应方法中，检测使底物成为带有自由氨基基团的多肽的酶水解。这些氨基基团与TNBS反应形成黄色复合物。这样，反应的颜色越深，测定的活性越强。可以用本领域公知的各种分析仪或分光光度计测定该黄颜色。
可用本领域技术人员公知的方法测定蛋白酶变体的其它特征。代表性特征包括但不限于温度稳定性、碱稳定性、和特定蛋白酶在不同的底物或缓冲液或产品剂型中的稳定性。
结合本文中公开的酶稳定性检测程序，可以鉴定经随机突变获得的突变体，它们体现出在保持酶促活性的同时或者增强或者降低的碱或温度稳定性。
可用已知方法或本文描述的方法测定碱稳定性。根据与前体蛋白质相比突变体酶促活性半衰期至少约5％或更大的增强或降低(在大多数实施方式中，优选为增强)来证明碱稳定性的显著改变。
可用已知方法或本文描述的方法测定温度稳定性。根据与前体蛋白质相比当暴露于相对高温和中性pH时突变体催化活性半衰期至少约5％或更大的增强或降低(在大多数实施方式中，优选为增强)来证明碱稳定性的显著改变。
如本文所使用的，“个人护理产品”意指用于清洁毛发、皮肤、头皮、牙齿的产品，包括但不限于洗发水、护肤液、淋浴胶(shower gels)、局部保湿物(topical moisturizers)、牙膏、和/或其它局部清洁剂。在一些特定的优选实施方式中，这些产品用于人类，尽管在其它实施方式中，这些产品也可用于非人动物(例如，兽医用途)。
如本文所使用的，“护肤组合物”意指局部应用以清洁和/或保湿皮肤的产品。这样的组合物包括但不限于保湿沐浴液、淋浴胶、护肤液、保湿面霜、卸装品(make up-removers)和洗液。
如本文所使用的，“清洁组合物”是可用于从基质，例如织物、器皿、隐形眼镜、其它固体基质、毛发(洗发水)、皮肤(肥皂和面霜)、牙齿(漱口水、牙膏)等，上去除不想要的化合物的组合物。
本文所使用的术语“清洁组合物材料”指，根据想要的特定清洁组合物类型以及产品形式(例如，液体、颗粒、喷剂组合物)所选择的任何液体、固体或气体材料，该材料与组合物中所用的蛋白酶相容。考虑所要清洁的表面、物件或织物、以及根据使用过程中(例如，洗涤去污剂使用过程中)的清洁条件而想要的组合物形式，很容易对清洁组合物材料作出特定的选择。
本文所使用的术语“硬质表面清洁组合物”指用于清洁固体表面例如地板、墙壁、浴室瓷砖、以及类似物品的去污剂组合物。这样的组合物可以任何形式提供，包括但不限于固体、液体、乳状液，等。
如本文所使用的，“餐具洗涤组合物”指用于清洁餐具的所有形式的组合物，包括但不限于，颗粒和液体形式。
如本文所使用的，“织物清洁组合物”指用于清洁织物的所有形式的去污剂组合物，包括但不限于颗粒、液体和条状形式。如本文所使用的，“织物”指任何纺织材料。
如本文所使用的，术语“相容”意指，清洁组合物材料不会减弱蛋白酶的蛋白水解酶活性以至于蛋白酶在通常的使用状况下失效。特定的清洁组合物材料在下文中举例说明。
如本文所使用的，“有效量的蛋白酶”指达到特定用途(例如，个人护理产品、清洁组合物，等)中所必需的酶活性所必需的蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg)的量。这样的有效量是本领域普通技术人员易于确定的，并且基于许多因素，例如所使用的特定的酶、清洁用途、清洁组合物的特定组成、以及是否需要液体或干(例如，颗粒、条状)组合物，及类似因素。
如本文所使用的，“非织物清洁组合物”包括固体表面清洁组合物、餐具洗涤组合物、口腔清洁组合物、假牙清洁组合物、和个人清洁组合物。
如本文所使用的，“口腔清洁组合物”指洁齿剂(dentifrices)、牙膏、牙胶、牙粉、漱口水、口腔喷雾剂、口胶、口香糖、糖锭、小袋、药片、生物胶、预防药膏、牙科处理液，及其类似物。
如本文所使用的，“药学上可接受的”意指该术语描述的药品、药剂和/或惰性组分适于与人或其它动物组织接触使用而不产生过多毒性、不相容、不稳定、刺激、变态反应及其类似，并且具有相称的合理利益/风险比率。
本发明的许多蛋白质变体能用于配制各种去污剂组合物。许多已知化合物是适宜在含有本发明蛋白质突变体的组合物中使用的表面活性剂。这些化合物包括非离子、阴离子、阳离子、阴离子或两性离子去污剂(参见例如，US专利No 4 404 128和US专利No.4 261 868)。一种适宜的去污剂配方描述于US专利5 204 015。本领域人员熟悉可用于清洁组合物的不同剂型。除典型的清洁组合物之外，易于理解本发明的蛋白质变体可用于天然或野生型蛋白质所使用的任何目的中。因此，这些变体可用于，例如，条状或液体肥皂用途、器皿护理配方、表面清洁用途、隐形眼镜清洁液或产品、肽水解、废物处理、纺织用途，用作蛋白质生产中的融合-切割酶，等。当然，本发明的变体无意限制于任何特定的用途。例如，除降低的变应原性/免疫原性外，本发明的变体可包括在去污剂组合物中的增强的性能(与前体相比而言)。如本文所使用的，在去污剂中增强的性能定义为，在标准洗涤循环后用通常的评估所测定的，使对特定酶敏感的污渍(例如，草汁或血液)更强力的清除。
蛋白质，尤其是本发明的蛋白酶可配制成pH介于6.5和12.0之间、重量含量约为.01至5％(优选0.1％-0.5％)的粉末或液体去污剂。在一些实施方式中，这些去污剂清洁组合物进一步包括其它酶，例如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂酶或内切糖苷酶、以及助洗剂和稳定剂。
向常规的清洁组合物添加蛋白质并不会造成特别的用途限制。换句话说，任何适于去污剂的温度和pH也适于本发明组合物，只要该pH在上述范围内，和温度低于所述的蛋白质变性温度。此外，本发明的蛋白质可以用于不含去污剂的清洁组合物，也可以抑或单独抑或与助洗剂和稳定剂组合使用。
在一种实施方式中，本发明提供包括本发明变体蛋白的处理纺织品的组合物。该组合物可用于处理例如丝或毛织品(参见例如，US再公开专利No.216 034；欧洲专利No.134 267；US专利No.4 533 359；和欧洲专利No.344 259)。可为这些应用通过本领域熟知的方法根据蛋白水解活性和它们的稳定性筛选这些变体。
如上所示，本发明的蛋白质与由它们的前体DNA编码的天然蛋白质相比表现修饰的免疫原性应答(例如，抗原性和/或免疫原性)。在一些优选实施方式中，蛋白质(例如，蛋白酶)表现减弱的变应原性/免疫原性。本领域技术人员易于认识到，本发明蛋白酶的用途大部分可根据蛋白质的免疫特性决定。例如，表现减弱的免疫原性应答的蛋白酶可用于清洁组合物中。有效量的本文所述一或更多种蛋白酶变体可用在用于清洁需要去除蛋白质污渍的大量表面的组合物中。这样的清洁组合物包括用于清洁硬质表面的去污剂组合物、用于清洁织物的去污剂组合物、器皿洗涤组合物、口腔清洁组合物、和假牙清洁组合物。
根据本发明方法分级的一或更多种变应原性/免疫原性减弱的有效量的相关和/或变体蛋白可用于各种应用于角质材料例如指甲和毛发的组合物，包括但不限于那些用作毛发喷雾组合物、洗发水和/或调理组合物、应用于毛发生长调节目的的组合物、和用于头发和头皮以治疗皮脂溢、皮炎和/或头皮屑的组合物。
本文描述的有效量的一或更多种蛋白酶变体可用于适于局部应用于皮肤和毛发的组合物中。这些组合物可以是霜剂、洗液、胶体及其类似，也可以配制成水性组合物或可配制成连续水相中的一或更多种油相的乳液。
此外，变应原性/免疫原性减弱的相关和/或变体蛋白可用于其它用途，包括药物用途、药物递送用途，以及其它健康护理应用。
护肤活性剂在一些实施方式中，本发明提供的组合物包括护肤活性剂，其水平为约0.1％至约20％重量比，优选约1％至约10％重量比，更优选约2％至约8％重量比。本文中适于使用的护肤活性剂的非限制性实施例包括维生素B3成分、泛酰醇、维生素E、醋酸维生素E、视黄醇、丙酸视黄酯、棕榈酸视黄酯、视黄酸、维生素C、可可碱、α-羟酸、法尼醇、植三醇(phytantriol)、水杨酸、palmityl peptapeptide-3及其混合物。
B3化合物如本文所使用的，“维生素B3化合物”意指具有以下分子式的化合物 其中R为-CONH2(即，烟酰胺)、-COOH(即，烟酸)或-CH2OH(即，烟酰醇(nicotinyl alcohol))；及其衍生物；以及前述任一的盐。前述维生素B3化合物衍生物的示范性例子包括烟酸酯，包括非血管扩张性的烟酸酯、烟酰氨基酸、羧酸的烟酰醇酯、烟酸N-氧化物和烟酰胺N-氧化物。
适宜的烟酸酯包括C1-C22醇，优选C1-C16醇，更优选C1-C6醇的烟酸酯。醇类为适宜的直链或支链的、环形或非环形的、饱和或不饱和的(包括芳香族)、以及取代或非取代的。酯类优选为非血管扩张性的。如本文所使用的，“非血管扩张性的”意指该酯类在目标组合物中被应用于皮肤后通常不出现明显的发红反应(即，一般群体中的大多数不会出现明显的发红发应，尽管这样的化合物可能会导致裸眼不可见的血管扩张)。非血管扩张性的烟酸酯包括生育酚烟酸酯(tocopherol nicotinate)和肌醇六烟酸酯(inositol hexanicotinate)；优选为生育酚烟酸酯。WO 98/22085中给出了更加完整的对维生素B3化合物的说明。优选的维生素B3化合物是烟酰胺和生育酚烟酸酯。
类视黄醇另一种适宜的护肤活性剂是类视黄醇。如本文所使用的，“类视黄醇”包括所有在皮肤中具有维生素A生物活性的自然的和/或合成的维生素A类似物或类似视黄醇的化合物、以及这些化合物的几何异构体和立体异构体。当本文的组合物中包括类视黄醇时，它典型含有约0.005％至约2％、更优选0.01％至约2％类视黄醇。视黄醇的优选使用量为约0.01％至约0.15％；视黄醇酯的优选使用量为自约0.01％至约2％(例如，约1％)。
类视黄醇优选为视黄醇、视黄醇酯(例如，视黄醇的C2-C22烷基酯，包括棕榈酸视黄酯、乙酸视黄酯、丙酸视黄酯)、视黄醛、和/或视黄酸(包括所有反式视黄酸和/或13-顺式-视黄酸)，更优选为除视黄醇酸以外的类视黄醇。这些化合物是本领域熟知的，而且可从许多商业途径获得(例如，Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)，和Boehringer Mannheim(Indianapolis，IN))。优选的类视黄醇包括视黄醇、棕榈酸视黄酯、乙酸视黄酯、丙酸视黄酯、视黄醛、视黄酸，及其组合。更优选的类视黄醇包括视黄醇、丙酸视黄酯、视黄酸和棕榈酸视黄酯。类视黄醇可以是基本纯化的材料、或从自然(例如，植物)来源经适宜的物理和/或化学方法获得的提取物。
载体进一步预期本发明的组合物能以安全而有效的剂量用于皮肤病学可接受的、适于局部应用于皮肤和/或毛发的载体中，主要材料和可选的其它材料在载体中混合以使主要材料和可选的其它材料能以合适的浓度运送至皮肤或毛发。这样，载体作为主要材料的稀释剂、分散剂、溶剂等以确保主要材料能够以适宜浓度均匀地应用并分布于所选择的靶物上。
本-发明所使用的载体类型依赖于对该组合物所希望的产物形式。本发明无意将载体限制于任何特定的形式，尽管其最常见为固体、半固体或液体。适宜的载体是液体、半固体，例如霜、洗剂、胶、棒、软膏、糊剂和泡沫(mousses)。优选载体形式为洗剂、霜或胶，更优选为具有足以阻止颗粒沉淀的稠度或流动点的载体。载体本身可以是惰性的，或其自身可以是皮肤病学上有益的。载体可以直接应用于皮肤和/或毛发，或其可通过纺织或非纺织条或布应用。它也可以是贴剂(patch)、面膜(mask)、或包装带(wrap)形式。它也可以烟雾状或别的形式喷至皮肤和/或毛发。载体还应当是与本文所述主要成分可物理和化学相容的，且不应当过度损害与本发明组合物相关的稳定性、效力或其它用途益处。
优选的载体包含皮肤病学可接受的亲水稀释剂。适宜的亲水稀释剂包括水、有机亲水稀释剂例如C1-C4一元醇以及低分子量的二元醇和多元醇，包括丙二醇、聚乙二醇(例如MW 200-600)、聚丙二醇(例如MW 425-2025)、丙三醇、丁二醇、1，2，4-丁三醇、山梨醇酯、1，2，6-hexametriol、乙醇、异丙醇、山梨醇酯、乙氧基醚、丙氧基醚及其组合。优选稀释剂为液体。水是优选的稀释剂。优选组合物含有至少约20％的亲水稀释剂。
适宜的载体还包括含有亲水相和疏水相(例如，脂、油或含油物质)的乳状液，亲水相优选为水相。正如本领域技术人员所熟知的，根据组合物成分，亲水相分散于疏水相中或反之，以各自形成亲水或疏水的分散和连续相。在乳状液技术中，熟知的术语“分散相”意指以小颗粒或小滴悬浮于连续相中或被连续相包围的形式存在的相。分散相也叫内部相或非连续相。乳状液可以是或者包括(例如，在三相或其它多相乳状液中)水包油乳状液或油包水乳状液例如硅氧烷包水乳状液。水包油乳状液典型地含有约1％至约60％(优选约1％至约30％)的分散疏水相和约1％至约99％(优选约40％至约90％)的连续亲水相；油包水乳状液典型地含有约1％至约98％(优选约40％至约90％)的分散亲水相和约1％至约50％(优选约1％至约30％)的连续疏水相。
湿润剂在一些实施方式中，本发明的组合物含有优选以约0.01％至约20％，更优选约0.1％至约15％和特别是约0.5％至约10％水平存在的湿润剂。优选的湿润剂包括但不限于选自多元醇、尿素、D或DL泛酰醇、泛酸钙、蜂王胶、panthetine、pantotheine、泛酰基乙基醚、潘氨酸、吡哆素、泛酰乳糖维生素B复合物、己烷-1，2，6，-三元醇、胍或其衍生物，及其混合物。
此处适于使用的多元醇包括聚烷撑二醇且更优选为烷撑多元醇及其衍生物，包括丙二醇、二丙二醇、聚丙二醇、聚乙二醇及其衍生物，山梨醇、羟丙基山梨醇、赤藓醇、苏糖醇、季戊四醇、木糖醇、葡萄糖醇、甘露醇、己二醇、丁二醇(例如，1，3-丁二醇)、己三醇(例如，1，2，6-己三醇)、三羟甲基丙烷、新戊二醇、丙三醇、乙氧基丙三醇、丙烷-1，3二醇、丙氧基丙三醇及其混合物。上述任一多元醇的烷氧基衍生物也适于此处使用。本发明优选多元醇选自丙三醇、丁二醇、丙二醇、二丙二醇、聚乙二醇、己三醇、乙氧基丙三醇和丙氧基丙三醇，及其混合物。
此处适用的有用的湿润剂是2-吡咯烷酮-5-羧酸钠(NaPCA)、胍；乙醇酸和乙醇酸盐(例如铵和四烷基铵)；乳酸和乳酸盐(例如铵和四烷基铵)；任一品种形式的真性芦荟(例如，真性芦荟胶)；透明质酸及其衍生物(例如，盐衍生物，例如透明质酸钠)；乳酰胺单乙醇胺；乙酰胺单乙醇胺；尿素；泛酰醇及其衍生物；及其混合物。
至少部分(高至约5％组合物重量比)湿润剂可以整合为与微粒化交联疏水丙烯酸盐或甲基丙烯酸盐共聚物的混合物的形式，其自身存在的量优选为约0.1％至约10％，它可被加入或者水相或者分散相中。该共聚物在辅助提供有效的保湿有益效果时对于降低光泽和控油尤其有价值，其在WO96/03964中得以进一步描述，该文在此引作参考。
润肤剂在一些实施方式中，本发明的水包油乳状液实施方式包括约1％至约20％，优选约1.5％至约15％，更优选约0.1％至约8％，和甚至更优选约0.5％至约5％的皮肤病学可接受的润肤剂。润肤剂可润滑皮肤、增强光滑和柔软、防止或减弱干燥、和/或保护皮肤。润肤剂典型为水不相容的、油性的或蜡质材料，且高分子量的润肤剂可使局部施用组合物具有粘性。已知有大量的适宜润肤剂，并可在此处使用。例如，Sagarin，Cosmetics，Science and Technology，第二版，Vol.1，第32-43页(1972)，包含了许多适宜用作润肤剂的材料的例子。此外，在申请WO 00/24372中讨论的所有例子也应当视为适于在本发明中使用，尽管下面进一步列出了优选的例子i)具有约7至约40个碳原子的直链和支链碳氢化合物，例如十二烷、角鲨烷、胆固醇、氢化聚异丁烯、异十六烷、异二十烷、isooctahexacontane、isohexapentacontahectane、和C7-C40异链烷烃，其为C7-C40支链碳氢化合物。适于此处使用的支链碳氢化合物选自isopentacontaoctactane、凡士林、及其混合物。适于此处使用的是以商标名Permethyl(RTM)销售的支链脂肪族碳氢化合物，可从Presperse Inc.，South Plainfield，N.J.商业获得。
ii)C1-C30羧酸、C12-15烷基苯甲酸、和C2-C30二羧酸的C1-C30醇酯，例如，异壬基异壬酸酯、异硬脂基新戊酸酯、异癸基辛酸酯、异癸基异壬酸酯、十三烷基异壬酸酯、十四烷基辛酸酯、辛基壬酸酯、辛基异壬酸酯、十四烷基十四烷酸酯、十四烷基新戊酸酯、十四烷基辛酸酯、异丙基十四烷酸酯、十四烷基丙酸酯、异丙基硬脂酸酯、异丙基异硬脂酸酯、甲基异硬脂酸酯、二十二烷基山嵛酸酯、二辛基马来酸酯、二异丙基己二酸酯、和二异丙基二亚油酸酯及其混合物。
iii)糖类的C1-C30单和聚酯及相关材料。这些酯衍生自糖类或多元醇部分和一或更多个羧酸部分。根据组成的酸和糖，这些酯在室温下可以是液体或固体形式。例子包括，葡萄糖四油酸酯、半乳糖四油酸酯、山梨醇四油酸酯、蔗糖四油酸酯、蔗糖五油酸酯、蔗糖六油酸酯、蔗糖七油酸酯、蔗糖八油酸酯、山梨醇己酯——其中羧酸酯部分是摩尔比率为1∶2的棕榈油酸和花生酸，和蔗糖辛酯——其中酯化羧酸部分是摩尔比率为1∶3∶4的月桂酸、亚油酸和山嵛酸。其它材料包括蔗糖棉籽油或大豆油脂肪酸酯。这种材料的其它例子描述于WO96/16636。一种特别优选的材料是一种已知称作INCI的sucrosepolycottonseedate。
iv)植物油和氢化植物油。植物油和氢化植物油的例子包括，红花油、椰子油、棉籽油、鲱鱼油、棕榈仁油、棕榈油、花生油、大豆油、葡萄籽油、亚麻子油、稻糠油、松油、芝麻油、葵花子油、来自上述来源的部分或完全氢化的油、及其混合物。
v)可溶或胶状可溶保湿剂。例子包括，透明质酸和淀粉接枝聚丙烯酸钠，例如描述于US专利NO 4 076 663的可从CelaneseSuperabsorbent Materials，Portsmith，VA获得的Sanwet(RTM)IM-1000，IM-1500和IM-2500。
优选此处使用的润肤剂为异十六烷、isooctacontane、凡士林、异壬基异壬酸酯、异癸基辛酸酯、异癸基异壬酸酯、十三烷基异壬酸酯、十四烷基辛酸酯、辛基异壬酸酯、十四烷基十四烷酸酯、甲基异硬脂酸酯、异丙基硬脂酸酯、C12-15烷基苯甲酸酯及其混合物。特别优选此处使用的润肤剂为异十六烷、异壬基异壬酸酯、甲基异硬脂酸酯、异丙基异硬脂酸酯、凡士林、或其混合物。
乳化剂/表面活性剂在一些实施方式中，本发明的组合物含有乳化剂和/或表面活性剂，通常辅助分散相在连续水相中分散和悬浮。如果产品是用于皮肤清洁时，表面活性剂也有用。下文中为方便起见，乳化剂包括在术语“表面活性剂”中。因此，“表面活性剂”指无论用作乳化剂或其它表面活性目的例如皮肤清洁的表面活性试剂。只要所选择的试剂是与组合物必需成分化学和物理相容的，则已知的或常规的表面活性剂可用于本发明的组合物并提供令人满意的特性。适宜的表面活性剂包括非硅氧烷衍生的物质，及其混合物。申请WO 00/24372中讨论的所有表面活性剂被视为适于在本发明中使用。
在一些实施方式中，本发明的组合物包括约0.05％至约15％的表面活性剂或表面活性剂混合物。所选择的确切的表面活性剂或表面活性剂混合物依赖于组合物及其它存在成分的pH。
此处有用的非离子表面活性剂是那些可被宽泛定义为长链醇(例如C8-30醇)与糖类或淀粉聚合物(即，糖苷)的缩合产物的表面活性剂。其它有用的非离子表面活性剂包括脂肪酸与烯化氧的缩合产物(即，脂肪酸的环氧烷酯)。这些原料具有通式RCO(X)nOH，其中R为C10-30烷基基团，X为-OCH2CH2-(即，衍生自乙二醇或氧化物)或-OCH2CHCH3-(即，衍生自丙二醇或氧化物)，且n为自约6至约200的整数。其它的非离子表面活性剂是2摩尔脂肪酸与烯化氧的缩合产物(即，脂肪酸的环氧烷二酯)。这些原料具有通式RCO(X)nOOCR，其中R为C10-30烷基基团，X为-OCH2CH2-(即，衍生自乙二醇或氧化物)或-OCH2CHCH3-(即，衍生自丙二醇或氧化物)，且n为自约6至约100的整数。此处使用的乳化剂最优选为基于脱水山梨醇脂肪酸酯和蔗糖脂肪酸酯的脂肪酸酯混合物，尤其是脱水山梨醇硬脂酸酯和蔗糖可可酯(sucrose cocoate)。这可从ICI商业获得，商标名为Arlatone 2121。甚至更适宜的例子包括十六醇(cetearylalcohols)、十六烷基葡糖苷(cetearyl glucosides)的混合物，例如来自Seppic的商标名为Montanov 68的、来自Henkel的商标名为Emulgade PL68/50的那些。
在一些实施方式中，此处有用的替代性或附加的亲水表面活性剂包括如本领域已知的广泛的任意一种阳离子、阴离子、两性离子、和兼性表面活性剂(参见例如，US专利No.5 011 681、US专利No.4 421769、和US专利No.3 755 560)。大量的阴离子表面活性剂可用于本发明的组合物(参见例如，US专利No.3 929 678)。典型的阴离子表面活性剂包括烷氧基羟乙基磺酸酯(例如，C12-C30)，烷基和烷基醚硫酸酯及其盐、烷基和烷基醚磷酸酯及其盐、烷基甲基牛磺酸酯(例如，C12-C30)，和脂肪酸的皂化物(例如，碱金属盐，例如钠或钾盐)。
两性和兼性表面活性剂也可用于本发明的组合物。可用于本发明组合物的两性和兼性表面活性剂的例子是被宽泛描述为脂肪族仲胺或叔胺的那些表面活性剂，其中的脂肪族基团可以是直链或支链的，且一个脂肪族取代基含有约8至约22个碳原子(优选C8-C18)且一个含有阴离子水溶性基团(例如，羧基、磺酸、硫酸盐、磷酸或膦酸)。例子包括烷基亚氨醋酸酯、亚氨基二链烷酸盐和氨基链烷酸盐、咪唑啉鎓盐和铵衍生物。其它合适的两性和兼性表面活性剂包括那些选自甜菜碱、磺基甜菜碱、羟基磺基甜菜碱、以及支链和非支链烷酰基肌氨酸酯，及其混合物。
在一些实施方式中，本发明的乳状液进一步包括含有硅氧烷的乳化剂或表面活性剂。大量硅氧烷乳化剂可用于本发明。这些硅氧烷乳化剂是典型的经有机修饰的有机多分子硅醚，本领域技术人员也已知为硅氧烷表面活性剂。有用的硅氧烷乳化剂包括聚二甲基硅氧烷共聚醇。这些原料是已经经过修饰以包括聚醚侧链例如聚环氧乙烷侧链、聚环氧丙烷侧链、这些侧链的混合物、以及含有衍生自环氧乙烷和环氧丙烷二者的部分的聚醚侧链的聚二甲基硅氧烷。其它例子包括烷基修饰的聚二甲基硅氧烷共聚醇(即，含有C2-C30侧链的化合物)。其它有用的聚二甲基硅氧烷共聚醇还包括带有各种阳离子、阴离子、两性离子、和兼性侧链部分的原料。
聚合增稠剂在一些实施方式中，本发明的组合物含有至少一种聚合增稠剂。此处有用的聚合增稠剂优选其数均分子量大于20000，更优选大于50000且特别是大于100000。在一些实施方式中，本发明的组合物含有占组合物重量约0.01％至约10％、优选约0.1％至约8％和最优选约0.5％至约5％的聚合增稠剂或其混合物。
此处使用的优选聚合增稠剂包括非离子增稠剂和阴离子增稠剂或其混合物。适宜的非离子增稠剂包括聚丙烯酰胺聚合物、交联聚(N-乙烯吡咯烷酮)、多糖、天然或合成胶、聚乙烯吡咯烷酮、和聚乙烯醇。适宜的阴离子增稠剂包括丙烯酸/乙基丙烯酸酯共聚物、羧基乙烯基聚合物和烷基乙烯基醚与马来酸酐的交联共聚物。此处使用的特别优选的增稠剂是非离子聚丙烯酰胺聚合物，例如聚丙烯酰胺和异链烷烃和laureth-7，可获自Seppic Corporation，商标名为Sepigel 305，以及由B.F.Goodrich公司出售的、商标为CARBOPOLTM树脂的丙烯酸/乙基丙烯酸酯共聚物和羧基乙烯基聚合物，或其混合物。在一些实施方式中，适宜的CARBOPOLTM树脂是经过疏水修饰的。其它适宜的树脂描述于WO98/22085。预计这些树脂的混合物也可用于本发明。
硅油在一些实施方式中，本发明组合物含有至少一个硅油相。硅油相通常占组合物的约0.1％至约20％、优选约0.5％至约10％、更优选约0.5％至约5％。该或各硅油相优选含有一或更多种硅氧烷组分。
在一些实施方式中，硅氧烷组分是流体，包括直链、支链和环状硅氧烷。此处有用的适宜硅氧烷流体包括包含聚烷基硅氧烷流体、聚芳香硅氧烷流体、环形或线形聚烷基硅氧烷、聚烷氧基化的硅氧烷、氨基和季铵化修饰的硅氧烷、聚烷基芳基硅氧烷和聚醚硅氧烷共聚物及其混合物。硅氧烷流体可以是挥发性的或非挥发性的。硅氧烷流体通常具有小于约200 000的重均分子量。适宜的硅氧烷流体分子量约为100 000或更低，优选约50 000或更低，最优选约10 000或更低。优选硅氧烷流体选自重均分子量范围在约100至约50 000且优选约200至约40 000之间的硅氧烷流体。有代表性的，在25℃下硅氧烷流体的粘度范围是自约0.65至约600 000mm2·s-1，优选自约0.65至约10 000mm2·s-1。可根据Dow Corning Corporate Test MethodCTM0004所述的用玻璃毛细粘度计测定粘度。可用于本发明的适宜的聚二甲基硅氧烷包括例如可从General Electric Company获得的SF和Viscasil(RTM)系列以及从Dow Corning获得的Dow Corning 200系列。基本上是非挥发性的聚烷基芳基硅氧烷(例如，聚甲基苯基硅氧烷)也是有用的，其粘度在25℃下为约0.65至30 000mm2·s-1。这些硅氧烷是可获得的，例如，获自General Electric公司的SF 1075甲基苯基流体或获自Dow Corning的556化妆品级流体。此处适宜使用的环状聚二甲基硅氧烷具有一个整合了约3至约7个(CH3)2SiO部分的环结构。
硅橡胶纯胶料也可用于本发明。本文中术语“硅橡胶纯胶料”意指重均分子量超过约200 000且优选约200 000至约4 000 000的高分子量硅氧烷。本发明包括非挥发性聚烷基以及聚芳香基硅氧烷胶。在优选实施方式中，硅油相含有硅橡胶纯胶料或包括硅橡胶纯胶料的硅氧烷混合物。典型地，硅橡胶纯胶料在25℃下的粘度超过约1 000 000mm2s-1。硅橡胶纯胶料包括本领域已知的聚二甲基硅氧烷(参见例如，US专利No.4 152 416)，以及描述于General Electric Silicone RubberProduct Data Sheets SE 30、SE 33、SE 54和SE 76的硅橡胶纯胶料。硅橡胶纯胶料的特定例子包括聚二甲基硅氧烷、(聚二甲基硅氧烷)-(甲基乙烯基硅氧烷)共聚物、聚(二甲基硅氧烷)(二苯)(甲基乙烯基硅氧烷)共聚物及其混合物。此处可用的优选硅橡胶纯胶料是选自聚二甲基硅氧烷醇、聚二甲基硅氧烷共聚醇、聚二甲基硅氧烷及其混合物的分子量为约200 000至约4 000 000的硅橡胶纯胶料。
优选此处的硅氧烷相含有作为硅橡胶纯胶料-流体混合物一部分整合进组合物的硅橡胶纯胶料。当该硅橡胶纯胶料作为硅橡胶纯胶料-流体混合物的一部分整合时，该硅橡胶纯胶料优选占硅橡胶纯胶料-流体混合物重量的约5％至约40％、特别是约10％至20％。此处适宜的硅橡胶纯胶料-流体混合物是主要由下列物质组成的混合物i)选自聚二甲基硅氧烷醇、氧代硅氧烷和聚二甲基硅氧烷、及其混合物的硅氧烷，分子量为约200 000至约4 000 000；和(ii)为硅氧烷流体的载体，载体粘度为约0.65mm2·s-1至约100mm2·s-1，
其中i)和ii)的比率为约10∶90至约20∶80，以及其中基于硅橡胶纯胶料的成分的终粘度为约100mm2·s-1至约100 000mm2·s-1，优选自500mm2·s-1至约10 000mm2·s-1。
适宜在此处的硅油相中使用的其它硅氧烷组分是交联聚有机硅氧烷聚合物，任意分散于液体载体中。一般，交联聚有机硅氧烷聚合物，与其载体(如果有的话)一起占组合物的0.1％至约20％，优选约0.5％至约10％，更优选约0.5％至约5％。这样的聚合物含有与交联剂交联的聚有机硅氧烷聚合物。适宜的交联剂包括WO98/22085中描述的那些。此处可用的适宜的交联聚有机硅氧烷聚合物的例子包括甲基乙烯基聚二甲基硅氧烷，甲基乙烯基二苯聚二甲基硅氧烷，和甲基乙烯基苯基甲基二苯聚二甲基硅氧烷。
适于在此处的硅油相中使用的另一类硅氧烷组分包括含有至少一个聚二有机硅氧烷部分和一个聚氧化亚烷基部分的聚二有机硅氧烷-聚氧化亚烷基共聚物。适宜的聚二有机硅氧烷部分及其共聚物包括描述于WO98/22085中的那些。可以从Wacker-Chemie GmbH，Munich获得商标为Belsil(RTM)、以及从Th.Goldschmidt Ltd.，England获得商标为Abil(RTM)的适宜的聚二有机硅氧烷-聚亚烷基共聚物，例如Belsil(RTM)6031和Abil(RTM)B88183。一种用于此处的特别优选的共聚物流体混合物包括Dow Corning DC3225C，它的CTFA命名为聚二甲基硅氧烷/聚二甲基硅氧烷共聚醇。
防晒剂在更进一步的实施方式中，本发明提供包含有机防晒剂的组合物。在一些实施方式中，适宜的防晒剂包括UVA吸收特性和/或UVB吸收特性。防晒剂活性的确切量根据想要的组合物防晒系数(SunProtection Factor，即“SPF”)、以及想要的UV保护水平而变化。本发明的组合物优选包含至少为10，优选至少为15的SPF。通常将SPF用作预防红斑的防晒剂的光保护度量。SPF定义为，在被保护的皮肤上产生最小量红斑与在同一个体的未保护皮肤上产生相同最小量红斑所需紫外线能量的比率(参见，Fed.Reg.，43，No 166，第38206-38269页，8月25日，1978年)。使用的防晒剂的量典型地是约2％至约20％，更典型的是约4％至约14％。适宜的防晒剂包括但不限于，出现在Wenninger和McEwen(eds.)，CTFA International CosmeticIngredient Dictionary和Handbook，第七版，第2卷，第1672(TheCosmetic，Toiletry，和Fragrance Association，Inc.，Washington，D.C，1997)页中的那些。
在一些实施方式中，本发明的组合物包含吸收UVA的防晒剂活性物质，它吸收波长从约320nm至约400nm的UV射线。适宜的吸收UVA的防晒剂活性物质选自二苯甲酰甲烷衍生物、邻氨基苯甲酸盐衍生物，例如甲基邻氨基苯甲酸盐和高甲基、1-N-乙酰邻氨基苯甲酸，及其混合物。二苯甲酰甲烷防晒剂活性物质描述于US专利No 4 387089，以及Lowe和Shaath(eds)，SunscreensDevelopment.Evaluation，and Regulatory Aspects，Marcel Dekker，Inc(1990)中。优选吸收UVA的防晒剂活性物质以能够提供宽光谱的UVA保护的量存在，或者独立存在，或者与可以存在的其它UV保护性活性物质组合。
适宜的UVA防晒剂活性物质是二苯甲酰甲烷防晒剂活性物质及其衍生物。它们包括但不限于，2-甲基二苯甲酰甲烷、4-甲基二苯甲酰甲烷、4-异丙基二苯甲酰甲烷、4-叔丁基二苯甲酰甲烷、2，4-二甲基二苯甲酰甲烷、2，5-二甲基二苯甲酰甲烷、4，4’-二异丙基苯甲酰甲烷、4-(1，1-二甲基乙基)-4，-甲氧二苯甲酰甲烷、2-甲基-5-异丙基-4’-甲氧二苯甲酰甲烷、2-甲基-5-叔丁基-4’-甲氧-二苯甲酰甲烷、2，4-二甲基-4’-甲氧二苯甲酰-甲烷、2，6-二甲基-4’-叔丁基-4’甲氧二苯甲酰甲烷、及其混合物。优选的二苯甲酰防晒剂活性物质包括4-(1，1-二甲基乙基)-4’-甲氧二苯甲酰甲烷、4-异丙基二苯甲酰甲烷、及其混合物。一种优选的防晒剂活性物质是4-(1，1-二甲基乙基)-4’-甲氧二苯甲酰甲烷。
防晒剂活性物质4-(1，1-二甲基乙基)-4’-甲氧二苯甲酰甲烷，也已知称作丁基甲氧二苯甲酰甲烷或Avobenzone，其可从GivaudanRoure(International)S.A.(Basel，Switzerland)商业获得，商标为PARSOL_1789，以及可从Merck&Co.，Inc(WhitehouseStation，NJ)商业获得，商标为EUSOLEX_ 9020。防晒剂4-异丙基二苯甲酰甲烷，也已知为异丙基二苯甲酰甲烷，可从Merck商业获得，商标为EUSOLEX_ 8020。
在进一步的实施方式中，本发明的组合物包含吸收UVB的防晒剂活性物质，它吸收波长从约290nm至约320nm的UV射线。组合物含有安全、且能独立或者与可存在于组合物中的其它UV保护性活性物质组合而有效提供UVB保护的UVB防晒剂活性物质化合物量。在一些实施方式中，组合物含有重量比为约0.1％至约16％，更优选约0.1％至约12％，和最优选约0.5％至约8％的UVB吸收有机防晒剂。
大量UVB防晒剂活性物质适宜在此处使用。这样的有机防晒剂活性物质的非限制性例子包括在US专利No.5 087 372、US专利No.5073 371、US专利No.5 073 372、和Segarin等人，Cosmetics Scienceand Technology，第VIII章，pages 189 et seq中所描述的那些。另外的有用防晒剂包括那些在US专利No.4 937 370和US专利No.4 999186中所描述的。优选的UVB防晒剂活性物质选自2-乙基己基-2-氰基-3，2-乙基己基N，N-二甲基-对-氨基苯甲酸酯、对-氨基苯甲酸、羟苯甲酮(oxybenzone)、高薄荷基水杨酸酯、辛基水杨酸酯、4，4′-甲氧-叔-丁基二苯甲酰甲烷、4-异丙基二苯甲酰甲烷、3-亚苄基樟脑、3-(4-甲基亚苄基)樟脑、3-二苯基丙烯酸酯(指，氰双苯丙烯酸辛酯)、2-苯基-苯并咪唑-5-磺酸(PBSA)、肉桂酸酯及其衍生物例如2-乙基己基-对-甲氧肉桂酸酯和辛基-对-甲氧肉桂酸酯、TEA水杨酸酯、辛基二甲基PABA、樟脑衍生物及其衍生物、及其混合物。优选的有机防晒剂活性物质是2-乙基己基-2-氰基-3，3-二苯基丙烯酸酯(指，氰双苯丙烯酸辛酯)、2-苯基-苯并咪唑-5-磺酸(PBSA)、辛基-对-甲氧肉桂酸酯、及其混合物。酸性防晒剂的盐和酸中和形式在此也是有用的。
在本发明的一些实施方式中，组合物进一步包括对稳定UVA防晒剂有效以防止UVA防晒剂在暴露于UV射线时光降解从而保持其UVA保护效力的物质。已经列举了大量可以提供这些稳定特性的化合物。预计选择这些化合物以在整体上同时补充UVA防晒剂和组合物。适宜的稳定剂包括但不限于，描述于US专利Nos 5 972 316；5 968 485；5 935 556；5 827 508和WO 00/06110中的那些。用于本发明的优选稳定剂例子包括2-乙基己基-2-氰基-3，3-二苯基丙烯酸酯(指，氰双苯丙烯酸辛酯)、乙基-2-氰基-3，3-二苯基丙烯酸酯、2-乙基己基-3，3-二苯基丙烯酸酯、乙基-3，3-二(4-甲氧苯基)丙烯酸酯、及其混合物。2-乙基己基-2-氰基-3，3-二苯基丙烯酸酯是最优选的。
在一些实施方式中，向本发明有用的任一组合物中加入一种物质以改善皮肤，特别是那些可增强被水洗脱或者擦掉的抗性的组合物。提供该益处的优选物质是乙烯和丙烯酸的共聚物(参见例如，US专利No.4 663 157)。
除有机防晒剂外，在一些实施方式中，本发明的组合物还含有无机物理阳光阻挡物质。适宜的物理阳光阻挡物质的非限制性例子描述于CTFA International Cosmetic Ingredient Dictionary，第六版，1995，第1026-28和1103页；和Sayre等人，J.Soc.Cosmet.Chem.，41103-109(1990)。优选的无机物理阳光阻挡物质包括氧化锌和二氧化钛，及其混合物。
使用时，物理阳光阻挡物质存在的量使本发明组合物在皮肤上是透明的(即，非增白的)，优选小于或等于约5％。若使用二氧化钛，它可以具有锐钛矿、金红石或无定形结构。物理阳光阻挡物质颗粒(例如，二氧化钛和氧化锌)，可以是未包被的或用各种物质包被的，这些物质包括但不限于氨基酸、铝化合物例如氧化铝、硬脂酸铝、月桂酸铝及类似；羧酸及其盐、卵硬脂酸及其盐；磷脂类例如卵磷酯；有机硅氧烷化合物；无机硅氧烷化合物例如二氧化硅和硅酸盐；及其混合物。优选的二氧化钛可从Tayca(日本)商业获得，它由Tri-K Industries(Emerson，NJ)以MT微离子化系列(例如，MT 100SAS)销售。在一些实施方式中，本发明的组合物含有重量百分比为约0.1％至约10％，更优选约0.1％至约4％，和最优选约0.5％至约2.5％的无机防晒剂。
抗微生物和抗真菌活性物质在一些实施方式中，本发明的组合物含有抗微生物和/或抗真菌活性物质。此处有用的抗微生物和抗真菌活性物质的非限制性例子包括但不限于β-内酰胺类药物、喹诺酮类药物、环丙沙星、诺氟沙星、四环素、红霉素、丁胺卡那霉素、2，4，4′-三氯-2′-羟基二苯基醚、3，4，4′-三氯酰苯胺(banilide)、苯氧基乙醇、苯氧基丙醇、苯氧基异丙醇、强力霉素、卷曲霉素、氯己定、氯四环素、土霉素、克林霉素、乙胺丁醇、扑痫酮羟乙基磺酸盐、甲硝唑、戊双脒、庆大霉素、卡那霉素、lineomycin、甲烯土霉素、乌洛托品、米诺环素、新霉素、乙基紫苏霉素、巴龙霉素、链霉素、妥布霉素、咪康唑、四环素盐酸盐、红霉素、锌红霉素、红霉素丙酸酯十二烷硫酸盐、硬脂酸红霉素、丁胺卡那霉素硫酸盐、强力霉素盐酸盐、卷曲霉素硫酸盐、氯己定葡萄糖酸盐、氯己定盐酸盐、氯四环素盐酸盐、土霉素盐酸盐、克林霉素盐酸盐、乙胺丁醇盐酸盐、甲硝唑盐酸盐、戊双脒盐酸盐、庆大霉素硫酸盐、卡那霉素硫酸盐、lineomycin盐酸盐、甲烯土霉素盐酸盐、乌洛托品马尿酸盐、乌洛托品杏仁酸盐、米诺环素盐酸盐、新霉素硫酸盐、乙基紫苏霉素硫酸盐、巴龙霉素硫酸盐、链霉素硫酸盐、妥布霉素硫酸盐、咪康唑盐酸盐、amanfadine盐酸盐、amanfadine硫酸盐、octopirox、对氯间二钾苯酚、制霉菌素、托萘酯、克霉唑、西吡氯铵(CPC)、吡罗克酮乙醇胺、二硫化硒、酮康唑、三氯卡班、三氯生、吡硫锌、伊曲康唑、亚细亚酸、扁柏酚、mipirocin、clinacycin盐酸盐、苯甲酰过氧化物、苄基过氧化物、二甲胺四环素、苯氧基异丙醇、及其混合物，以及欧洲专利No.0 680 745中所述的那些。
其它任选的成分在另外一些实施例中，许多任选的成分，例如中和试剂、香料和调色剂可用于本发明的组合物中。优选的任一附加成分都增强产品对皮肤的柔软/光滑效果。此外，优选的是，这样的成分不会对产品的美学特性产生负面影响。因此，在本发明有用的组合物中高水平的蛋白质例如胶原蛋白和弹性蛋白通常为不优选的。
在一些实施方式中，本发明的组合物还包含自约0.01％至约10％，优选约0.1％至约5％的泛醇保湿剂。在优选实施方式中，泛醇保湿剂选自D-泛醇([R]-2，4-二羟基-N-[3-羟基丙基])-3，3-二甲基丁酰胺)、DL-泛醇、泛酸钙、蜂王胶、panthetine、pantotheine、panthenyl乙醚、潘氨酸、维生素B6、和泛酰基乳糖。
适宜在中和亲水凝胶试剂中的酸性基团时使用的中和剂此处包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化胺、单乙醇胺、三乙醇胺、氨基甲基丙醇、tris-缓冲液和三乙醇胺。
其它的任选物质包括角质层分离剂；水溶性或可溶防腐剂，优选约0.1％至约5％，例如Germall 115，羟基苯甲酸的甲基、乙基、丙基和丁基酯，苯甲醇，可从Lonza获得的商标为Glydant Plus的DMDM乙内酰脲碘丙基丁基碳酸盐，EDTA，Euxyl(RTM)K400，Bromopol(2-溴-2-硝基丙烷-1，3-二醇)和苯氧基丙醇；抗菌物例如Irgasan(RTM)和苯氧基乙醇(优选0.1％至约5％)；可溶或胶溶的保湿剂，例如透明质酸和淀粉接枝聚丙烯酸钠，例如描述于US专利No.4 076 663、可从Celanese Superabsorbent Materials，Portsmith，VA获得的Sanwet(RTM)IM-1000、IM-1500和IM-2500；维生素例如维生素A、维生素C、维生素E及其衍生物，及其前体(buildingblocks)例如植烷三醇和维生素K，及其组分例如脂肪醇十二碳三烯醇；α-和β-羟酸；真性芦荟；鞘氨醇和植物鞘氨醇、胆固醇；皮肤增白剂；N-乙酰半胱氨酸；调色剂；抗菌剂，例如TCC/TCS，也已知为三氯生和三氯卡班；香料和香料增溶剂。α-羟酸的例子包括乙醇酸、乳酸、苹果酸、柠檬酸、与羟乙酸铵连接的乙醇酸、α-羟基乙酸、α-羟基辛酸、α-羟基己酸、羟基己酸、混合果酸、三-α-羟基果酸、三联果酸、甘蔗提取物、α-羟基和植物材料，例如那些在交联的脂肪酸α-nutrium中含有l-α-羧酸和glycomer的。α-羧酸的优选例子是乙醇酸和乳酸。优选α-羧酸的使用水平高达10％。
在一些实施方式中，向本发明的组合物中加入安全和有效量的抗炎剂，优选占组合物的约0.1％至约5％，更优选自约0.1％至约2％。抗炎剂增强本发明的皮肤外观益处(例如，这样的试剂可以促使皮肤张力或色彩更加一致)。组合物中使用的抗炎剂的确切量依赖于所使用的特定抗炎剂，因为这样的试剂在效力上差别很大。
在进一步的实施方式中，本发明的组合物进一步包括抗氧化剂/自由基清除剂。抗氧化剂/自由基清除剂对于提供抵御UV射线的保护以及抵御其它能导致皮肤损伤的环境因素尤其有用，UV射线能增强角质层的鳞片状或细纹变化。适宜的量为占组合物的约0.1％至约10％，更优选约1％至约5％。抗氧化剂/自由基清除剂包括化合物，例如抗坏血酸(维生素C)及其盐。
在本发明的一些实施方式中螯合剂的加入，对于提供抵御UV射线的保护以及抵御其它能导致皮肤损伤的环境因素尤其有用，UV射会导致角质层的过度鳞片化或皮肤细纹改变。适宜的量为占组合物约0.01％至约1％，更优选约0.05％至约0.5％。此处有用的典型螯合剂为描述于US专利No.5 487 884中的那些。在本发明主题组合物中有用的螯合剂优选包括乙二胺四乙酸(EDTA)，糠偶酰二肟，及其衍生物。
在更进一步的实施方式中，本发明的组合物还含有皮肤亮泽剂(skin lightening agent)。使用时，优选组合物中含有约0.1％至约10％，更优选约0.2％至约5％，还优选自约0.5％至约2％的皮肤亮泽剂。适宜的皮肤亮泽剂包括那些在本领域已知的皮肤亮泽剂，包括曲酸、熊果苷、抗坏血酸及其衍生物(例如，抗坏血酸镁磷酸酯)。适宜此处使用的其它皮肤亮泽剂包括WO 95/34280和WO 95/23780中描述的那些；各自引入本文作为参考。
其它的任选物质包括水溶性或可溶防腐剂，优选约0.1％至约5％，例如Germall 115，羟基苯甲酸的甲基、乙基、丙基和丁基酯，苯甲醇，商标为Glydant Plus(Lonza)的DMDM乙内酰脲碘丙基丁基碳酸酯，EDTA，Euxyl(RTM)K400，Bromopol(2-溴-2-硝基丙烷-1，3-二醇)和苯氧基丙醇；抗菌物例如Irgasan(RTM)和苯氧基乙醇(优选0.1％至约5％)。抗菌剂也可用于本发明的组合物，例如TCC/TCS，也已知为三氯生和三氯卡班。
此处其它任选的原料包括色素，当其为水溶性时促进并被包含在油相成分的总水平内。适宜在本发明的组合物中使用的色素可以是有机和/或无机的。还包括在术语“色素”中的原料是具有低色彩或光泽的原料例如消光剂(matter finishing agent)，还包括散光剂。优选，本发明的组合物含有反射指数为约1.3至约1.7的颗粒原料，该颗粒原料分散在组合物中并且具有自约2至约30μm的粒径中值。优选此处有用的颗粒具有相对较窄的分布，这是指50％以上的颗粒落在各自中值某一侧3μm内。还优选的超过50％，优选超过60％，且甚至更优选超过70％的颗粒落在所规定的各自中值大小范围内。适宜的颗粒化原料包括有机物或有机硅氧烷，且优选有机硅氧烷聚合物。优选颗粒是自由流动的固体原料。“固体”意指颗粒不是空的。空颗粒中心的空洞会对反射指数带来不利效果，及由此对皮肤或者组合物的视觉效果产生不利效果。适宜的有机颗粒化原料包括由上述聚甲基silsesquioxane，参见上述，聚酰胺、聚乙烯、聚丙烯氰、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚苯乙烯、聚四氟乙烯(PTFE)和聚(氯亚乙烯)制成。也可以使用衍生自前述原料的单体的共聚物。无机原料包括二氧化硅和氮化硼。在此处有用的颗粒化原料的可商业获得代表性例子是Tospearl_ 145，其中值颗粒大小约为4.5μm；和Kobo的EA-209_，它是乙烯/丙烯酸共聚物，中值颗粒大小为约10μm；以及Elf Atochem，France的商标为Orgasol 2002的Nylon-12；或其混合物。
适宜色素的进一步例子包括二氧化钛，来自Kobo的预分散的二氧化钛(例如，Kobo GWL75CAP)、氧化铁、酰基谷氨酸盐(acyglutamate)氧化铁、群青色、D&C染料、胭脂红，及其混合物。根据组合物的类型，常常可以使用色素混合物。从保湿、皮肤感觉、皮肤外观以及乳化相容性的角度来看，此处优选使用的色素是经过处理的色素。色素可以用化合物例如氨基酸、硅氧烷、卵磷脂和酯油处理。
适当的，此处组合物pH范围是从约6.1至约10.0，其中根据需要用酸、碱或缓冲盐调节最终组合物的pH。
组合物的制备用本领域技术人员熟知的标准技术来制备本发明的组合物。通常，以任意顺序添加相似的相分离原料来分别制备水相和/或油相。如果终产品是乳状液，那么通过剧烈搅拌将两相混合。如果可行的话，配方中任何高挥发性成分、或在高温下易水解的成分可以在制备末期乳化作用之后通过温和搅拌加入。
变应原性/免疫原性减弱的蛋白酶也可以用于纺织品处理。“纺织品处理”包括这样一个过程，其中纺织品和可以纺织、粘制、编结成纺织品或服装的独立的纱线或纤维经过处理产生所想要的特性。这样的所想要的特性的例子有“砂洗(stone-washing)”、de pilling、脱毛、脱浆、软化、和其它本领域技术人员熟知的纺织品处理步骤。
在本发明的一种实施方式中，此处所鉴定的表位用于引起免疫应答(例如，当想要产生针对某一蛋白酶的抗体时，其中该蛋白酶包括一个或两个这种表位。这样的抗体可用于筛选其它包括一个或这两个区域、或与之高度同源区域的蛋白酶。因此，本发明提供一种包括以下一个序列或同时包括以下两个序列的蛋白酶解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的(i)残基70～84和/或(ii)残基109～123。本发明可以利用分离的天然表位、重组蛋白质、或呈现特异表位区域的合成肽在免疫检测中实施以评价个人对包括这些或与之高度同源区域的蛋白质的敏感性。
在另一实施方式中，表位片段此处用于检测具有能够结合并展示这些片段的MHC分子的抗原呈递细胞。例如，表位片段可以包括可检测标记(例如，放射标记)。然后将标记片段与目的细胞孵育，之后结合(或展示)了标记片段的细胞得以检测。
发明详述本发明提供鉴定枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白中CD4+T-细胞表位的方法。本发明还旨在生产改变的肽，当其被整合进野生型枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白时则产生改变的免疫应答，优选在人体内为弱免疫应答。特别地，本发明提供手段，包括适于减弱ALCALASE_酶的免疫原性的方法和组合物。本发明还旨在生产改变的肽，当其被整合进野生型枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白序列时再也不能引发CD4+T-细胞应答或者至少使变态应答减弱。特别地，本发明提供手段，包括适于减弱野生型枯草杆菌蛋白酶Carlsberg的免疫原性的方法和组合物。
在一种实施方式中，本发明提供ALCALASE_酶的T-细胞表位。这些表位提供在本文给出的各种序列(参见，附图2和3)中，包括但不限于第1号肽(SEQ ID NO2)；第7号肽(SEQ ID NO8)；第14号肽(SEQ ID NO15)；第29号肽(SEQ ID NO30)；第39号肽(SEQ ID NO40)。在另一实施方式中，本发明提供所鉴定表位的改变序列，其适于置换进ALCALASE_酶。
本发明提供鉴定野生型枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白中CD4+T-细胞表位的方法。本发明进一步提供不再能够引发CD4+T-细胞应答的肽的生产。特别地，本发明提供手段，包括适于减弱ALCALASE_酶的免疫原性的方法和组合物。
发展针对某蛋白质的抗体需要一系列事件，这些事件起始于衍生自呈递于激活的抗原呈递细胞(APC)表面的蛋白质的肽片段。该肽结合于抗原呈递细胞表面的特定蛋白质，即主要组织相容性复合物(MHC)(对于人类，MHC是指“人白细胞抗原”(HLA)系统)中的蛋白质。该结合的肽能与第二个细胞类型——T-细胞相互作用。确切的说，这一亚型的T-细胞通过其表面CD4蛋白的表达被识别(即，CD4+T-细胞)。如果该相互作用成功，则特异的CD4+T-细胞生长分裂(即，增殖)并变得能与产生抗体的细胞(即，B-细胞)相互作用。如果该相互作用成功，则B-细胞增殖并成为特异针对最初蛋白质的抗体的生产中心。因此，最终的抗体生产依赖于对特异于某单肽序列(即，表位)的CD4+T-细胞的初始激活。利用本文所述的组合物和方法，有可能预测靶蛋白质，例如野生型枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白，中能引起特异性CD4+T-细胞的初始激活的肽。
在本发明的一些优选实施方式中，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白包括i)ALCALASE_酶(SEQ ID NO1)；ii)与ALCALASE_酶具有相似催化活性、并与SEQ ID NO1具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性的枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白，且优选与SEQ ID NO1具有至少90％、至少95％或至少97％氨基酸序列同一性；和iii)枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白的变体。
枯草杆菌蛋白酶是通常切割肽键的丝氨酸蛋白酶(典型地为细菌或真菌的)。尽管枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列并非完全同源，但枯草杆菌蛋白酶表现相同或相似的蛋白水解活性并且具有限定催化三联体的共有氨基酸序列使它们区别于胰凝乳蛋白酶这一相关的丝氨酸蛋白酶类别。催化三联体从氨基到羧基末端为，天冬氨酸-组氨酸-丝氨酸。野生型枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白以及本文中经修饰的蛋白质具有该催化三联体。
与P00780及附图1(SEQ ID NO1)所示的ALCALASE_酶具有相似的催化活性的枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白，包括那些可从地衣芽孢杆菌获得的枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白，例如但不限于具有EMBL Accession code X91262、EMBL Accession code X91261、和EMBL Accession code X91260的枯草杆菌蛋白酶。这些枯草杆菌蛋白酶的催化结构域与ALCALASE_酶具有大于90％的氨基酸序列同一性。在一种优选实施方式中，这些野生型枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白具有至少一个并优选1至6个与SEQ ID NO1中已经鉴定的ALCALASE_酶显著表位相同的显著表位。
在本发明的一些实施方式中，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白的变体是天然存在的(例如，获自地衣芽孢杆菌菌株的)，而在其它的实施方式中，它们是经遗传工程得到的变体(即，重组蛋白质)。这些变体包括带有一个或更多个氨基酸残基改变的重组蛋白质，其中改变的氨基酸残基处在不同于显著表位的位置。例如，在一些实施方式中，变体包括一个或更多个处在与SEQ ID NO1第1-15、19-33、40-54、85-99、和115-129位对应位置的氨基酸残基的改变。在其它的实施方式中，变体包括两个或更多个与SEQ ID NO1第1-15、19-33、40-54、85-99、和115-129位对应位置的氨基酸改变。在更进一步的实施方式中，变体包括2到10个或2到6个处在与SEQ ID NO1第1-15、19-33、40-54、85-99、和115-129位对应位置的氨基酸残基的改变。在一些实施方式中，改变包括氨基酸或氨基酸序列的置换、缺失和/或插入，其中该改变导致酶的表型改变。例如，在一些实施方式中，改变导致产生增强的稳定性、增强的酶活性、增强的温度稳定性、提高的碱稳定性和/或其它想要的特性。
导致产生包括修饰的ALCALASE或修饰的变体枯草杆菌蛋白酶Carlsberg在内的修饰的野生型枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白的对一个或更多个显著表位的改变或修饰，可以包括a)通过对表位中一个或更多个氨基酸的置换、缺失或插入对表位产生的修饰或b)通过用同源蛋白质的相似序列进行置换而产生的对表位的修饰，其中该相似序列比亲体野生型枯草杆菌蛋白酶Carlsberg产生更弱的由T-细胞识别引起的免疫应答。
在本发明的一些实施方式中，通过在表位中置换、缺失和/或插入至少一、二、三、四、五、六、七以及多至十五个氨基酸残基来修饰显著表位。例如，在一种优选实施方式中，改变了对应于SEQ IDNO1第115-129位氨基酸残基的第39号肽(SEQ ID NO40)。这一改变的氨基酸序列含有在115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、和/或129位中一个或更多个位置的置换。在其它实施方式中，改变的肽含有115-129中两个或更多个位置的置换。在其它的优选实施方式中，改变了第7号肽(SEQ IDNO8；对应于SEQ ID NO1第19-33位氨基酸残基)。在这些实施方式中，改变的氨基酸序列含有19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、和/或33中一个或更多个位置的置换(例如，第19-33位)。通过用不同的氨基酸取代野生型氨基酸残基进行置换。在一些优选实施方式中，优选用天然L-氨基酸(即，Ala、Asn、Asp、Cys、Glu、Gly、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Gln、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val)之一进行取代。在进一步的实施方式中，改变的肽是第7号肽，它含有相应于SEQ ID NO1第19-33位的一个或更多个氨基酸残基的缺失。在更进一步的实施方式中，改变的肽对应于肽7和8，其序列为QGFKGANVKVAVLDTGIQ(SEQ IDNO90)。因此，提供了在目的表位中的各种修饰，这为变体枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白提供减弱的免疫原性。
在本发明进一步的实施方式中，修饰的野生型枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白包括用同源蛋白酶的相似表位部分进行的置换，其中相似表位部分与在野生型亲本中已经被置换掉的表位相比产生减弱的免疫应答(例如，减弱的T-细胞应答)。例如在一些实施方式中，用来自另一同源枯草杆菌蛋白酶例如来自解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’或来自枯草杆菌的枯草杆菌蛋白酶168的相似部分取代第7号肽(即，对应于SEQ ID NO1的19-33位)，其中该相似部分不是显著表位。在一些实施方式中，同源蛋白酶获自原核生物，而在其它实施方式中，它获自真核生物。适宜的原核生物例子包括但不限于例如大肠杆菌和假单孢菌这样的革兰氏阴性生物以及微球菌和枯草杆菌这样的革兰氏阳性微生物。
在一些实施方式中，用本领域熟知的方法修饰野生型枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白表位。(参见例如，Zoller等人，Nucl.Acids Res.，106487-6500；和Yuckenberg等人，(1991)，in McPherson(ed.)，Directed MutagenesisA Practical Approach，，第27-48页)。如上所述，这些修饰包括氨基酸残基的缺失、置换、和/或插入。例如通过位点特异性氨基酸置换修饰一个或更多个氨基酸残基。实际上，可商业获得的诱变试剂盒可用于产生这些变体蛋白。
在一些实施方式中，为置换、插入和/或缺失鉴定的氨基酸残基是保守残基，而在其它实施方式中它们不是。在涉及残基不保守的优选实施方式中，一个或更多个氨基酸的取代限于产生修饰的肽的置换，其中该修饰的肽具有不对应自然界可发现的氨基酸序列的氨基酸序列。在残基保守的情况下，这样的取代不产生天然存在的序列。
盒式诱变技术也可用于本发明中以利于构建本发明的修饰蛋白质。根据该方法，获得天然存在的编码蛋白质的基因并对其进行完全或部分测序。之后，扫描序列以得到想要在所编码蛋白质中制造一个或更多个氨基酸突变(例如，缺失、插入或置换)的点。评定该点的侧翼序列中限制位点的存在，以用寡核苷酸库取代该基因中的短片段，这样表达时将编码各种不同的突变体。优选这样的限制位点是该蛋白质基因中唯一的位点以便于基因片段的取代。然而，只要由限制性消化产生的基因片段能以正确的顺序重装，任何在该蛋白质基因中不是过度出现的方便限制位点都可用于本发明。如果在所选择的点附近方便的距离(例如，10到15个核苷酸)内没有限制性位点，那么通过在基因内置换核苷酸产生这样的位点，而最终结构中的阅读框和所编码的氨基酸都不改变。在一些实施方式中，根据本领域已知的方法通过M13引物延伸来完成为将其序列改变成需要的序列的基因突变。利用遗传密码简并、基因的限制酶图谱和大量不同的限制酶，使得定位适宜的侧翼区域、以及评估形成两个方便的限制位点序列所需的改变成为常规的任务。注意，如果可以得到一个方便的侧翼限制位点，上述方法只需要对不含限制位点的侧翼区域来使用。然而，无意于将本发明限制于这些方法，因为本领域人员已知的其它适宜方法也可用于本发明。
在一些实施方式中，一旦克隆了DNA(天然存在的或重组的)，就用相关限制酶消化欲突变位置侧翼的限制位点，并将大量的末端互补寡核苷酸盒连入该基因。通过该方法使得诱变得以简化，因为可以合成所有的寡核苷酸以使其具有相同的限制位点，且不需要合成接头来生产限制位点。
在本发明的检测方法中分析含有改变的表位的肽时，优选改变的肽比含有野生型枯草杆菌蛋白酶的肽产生更低的T-细胞增殖。更优选地，改变后，样品中表位产生的T-细胞增殖比基线T-细胞增殖弱三倍，优选比基线T-细胞增殖弱两倍，和最优选弱于或基本等于基线T-细胞增殖。
在一些实施方式中，根据本领域熟知的方法筛选野生型枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白及其修饰的蛋白质的蛋白水解活性。这样的方法包括但不限于pNA检测和二甲基酪蛋白(DMC)检测法(Rothgeb等人，J.Am Oil Chem.Soc.，65806)。
重组DNA技术的应用通过改变编码目的蛋白质或肽(即，目的蛋白质或肽)的DNA序列使得对蛋白质或肽序列的快速操作变得容易。将这一策略应用于编码修饰的枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白例如修饰的ALCALASE_酶的基因使得改变表位序列变得容易，这样表位不再能够激活CD4+T-细胞。在优选实施方式中，这些改变减弱了枯草杆菌蛋白酶Carlsberg在人体中产生抗体结合抗体(Bab)和/或中和抗体(Nab)的应答的倾向。因此，在特别优选的实施方式中，本发明提供鉴定ALCALASE_酶蛋白质序列中CD4+T-细胞表位的组合物和方法以及提供不再能够引发CD4+T-细胞应答的肽的生产，当这些肽经重组DNA技术被整合进ALCALASE_酶时，预计它们将减弱ALCALASE_酶引发抗体产生的能力。
因此，在特定实施方式中，编码修饰的野生型枯草杆菌蛋白酶Carlsberg(特别是修饰的ALCALASE_酶)的DNA序列经由能够在宿主细胞中复制的表达载体导入宿主细胞。本领域技术人员很清楚用于宿主细胞例如枯草杆菌宿主细胞中的适宜载体(参见例如Harwood和Cutting(eds.)，Molecular Biological Methods forBacillus，John Wiley&Sons，(1990)，第92页)。转化技术进一步描述于Chang和Cohen，Mol.Gen.Genet.，16811-115；以及Smith等人，Appl.and Env.Microbiol.，51634)。在一些实施方式中，不需要插入表达载体而直接将DNA序列导入宿主细胞。这样的方法是本领域熟知的，包括但不限于氯化钙沉淀、电穿孔、裸DNA法，等。
在一些实施方式中，本发明修饰的野生型枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白进一步被分离和/或纯化。这用本领域公知的分离技术来完成，包括不限于，离子交换层析、亲和层析、疏水分离、沉淀、过滤、微滤、凝胶电泳、以及任何其它适宜的方法。在附加的实施方式中，一旦蛋白质被分离和/或纯化，则向修饰的蛋白质添加进一步的组分以提供目的组合物。
枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白，包括ALCALASE_酶，有大量的应用，包括但不限于液体和粉状去污剂、织物处理配方、常规的清洁组合物和个人护理组合物。容易理解的是，本发明的含有修饰表位的枯草杆菌蛋白酶可以用于任何ALCALASE_酶可以使用的用途。
实验以下实施例用于阐述本发明的特定优选实施方式和方面，而不应解释为限制本发明的范围。
在以下的实施公开中，使用以下缩写eq(当量)；M(摩尔/升)；μM(微摩尔/升))；N(Normal)；mol(摩尔)；mmol(毫摩尔)；μmol(微摩尔)；nmol(纳摩尔)；g(克)；mg(毫克)；kg(千克)；μg(微克)；L(升)；ml(毫升)；μl(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；μm(微米)；nm(纳米)；℃(摄氏度)；h(小时)；min(分钟)；sec(秒)；msec(毫秒)；xg(重力倍数)；Ci(居里)；OD(光密度)；Dulbecco’s磷酸缓冲液(DPBS)；HEPES(N-[2-羟乙基]哌嗪-N-[2-乙磺酸])；HBS(HEPES缓冲盐水)；SDS(十二烷基硫酸钠)；Tris-HCl(三[羟甲基]氨基甲烷-盐酸)；Klenow(DNA聚合酶I大(Klenow)片段)；rpm(转/分)；EGTA(乙二醇双(β-氨基乙基醚)-N，N，N′，N′-四乙酸)；EDTA(乙二胺四乙酸)；ATCC(美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD)；Cedar Lane(Cedar Lane实验室，安大略省，加拿大)；Gibco/Life Technologies(Gibco/Life Technologies，Grand Island，NY)；Sigma(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)；Pharmacia(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)；Procter&Gamble(Procter and Gamble，Cincinnati，OH)；Genencor(GenencorInternational，Palo Alto，CA)；Endogen(Endogen，Woburn，MA)；Cedarlane(Cedarlane，Toronto，Canada)；Dynal(Dynal，Norway)；Novo(Novo Industries A/S，Copenhagen，Denmark)；Biosynthesis(Biosynthesis，Louisville，TX)；TriLux Beta，(TriLux Beta，Wallac，Finland)；DuPont/NEN(DuPont/NEN Research Products，Boston，MA)；TomTec(Hamden，CT)；以及Stratagene(Stratagene，La Jolla，CA)。
实施例1用人T-细胞制备用于ALCALASE_T-细胞表位肽鉴定检测系统的细胞从92名对ALCALASE_酶暴露状态未知的个体收集新鲜外周血细胞。如实施例3所述，对这些细胞进行检测以确定ALCALASE_中的抗原表位。
如下所述制备要用的外周单核血细胞(室温保存，不超过24小时)向约30ml获自一单位全血的棕黄层溶液中加入Dulbecco’s磷酸缓冲液(DPBS)至50ml，并分装入两个试管。用12.5ml室温下的淋巴细胞制备密度分离培养基(Lymphoprep density separation media(Nycomed；密度1.077g/ml))承载(underlaid)样品。将试管于600x重力(g)下离心30分钟。收集并混合(pooled)两相的界面，并于DPBS中洗涤。如本领域已知，用血细胞计数器测定所获溶液的细胞密度。如本领域已知，用台盼蓝染色法(trypan blue exclusion)测定细胞活力。
如下所述，从所获溶液制备分化的树突细胞培养物，该培养物源自密度为108个细胞每75ml培养瓶溶液的外周血单核细胞样品(1)向50ml无血清AIM V培养基(Gibco/BRL)中加入以1∶100稀释的β-巯基乙醇(Gibco/BRL)。将培养瓶于37℃下5％CO2中平置两小时以允许单核细胞粘着于瓶壁；(2)按照下述完成单核细胞向树突细胞的分化去除未粘着细胞，并将粘着细胞(单核细胞)与30ml AIM V、800单位/ml GM-CSF(Endogen)和500单位/ml IL-4(Endogen)混合；将获得的混合物于37℃下、5％CO2中培养5天。培养5天后，添加细胞因子TNFα(Endogen)至0.2单位/ml，以及添加细胞因子IL-1α(Endogen)至终浓度为50单位/ml，将混合物在37℃下、5％CO2中再培养2天。
(3)第七天，加入溶于100mM、含EDTA的磷酸缓冲液(PBS)中的丝裂霉素C至浓度50微克/ml，以终止已分化的树突细胞培养物的生长。于37℃下、5％CO2中孵育溶液60分钟。轻轻拍打培养瓶以从塑料表面驱下树突细胞。之后以600xg离心树突细胞5分钟、于DPBS中洗涤树突细胞并如上所述进行计数。
(4)将制备的树突细胞置于96孔圆底板中，浓度为2×104细胞/孔，每孔含总量为100微升的AIM V培养基。
用Dynal CD4+T-细胞富集试剂盒(Dynal)提供的试剂从用于制备树突细胞的冷冻的等分量的外周血细胞制备了CD4+T细胞。将得到的CD4+细胞溶液离心、悬浮于AIM V培养基中，并用本领域已知的方法测定细胞密度。随后将CD4+T-细胞悬浮液重悬于AIM V培养基中至计数为2×106个细胞/ml以便于对96孔板的有效操作。
实施例2鉴定用于检测系统的ALCALASE_中的肽T-细胞表位根据ALCALASE_酶的全长氨基酸序列(SEQ ID NO1)制备用于实施例3所描述的检测系统中的肽，合成制备了包括ALCALASE_整个序列的15聚体(15mers)。连续的肽之间有12个氨基酸重叠。共生成88个肽(SEQ ID NOS2-89)，其序列示于附图2。
肽抗原于DMSO中制成2mg/ml的贮存液。首先，将0.5微升贮存液置于预先放置有分化的树突细胞的96孔板的各孔中。然后，将100微升如上制备的稀释的CD4+T-细胞溶液添加至各孔。有用的对照包括稀释的DMSO空白对照，和破伤风类毒素阳性对照。
各孔中20微升总量下的终浓度如下2×104CD4+T-细胞2×105树突细胞(R∶S为10∶1)5μM肽实施例3用人T-细胞对ALCALASE_酶中的T-细胞表位肽鉴定的检测一旦制备好检测试剂(即，细胞、肽，等)并将其加入96孔板后，即进行检测。对照包括树突细胞加上单独CD4+ T-细胞(带DMSO载体)以及加上约5Lf/mL破伤风类毒素(Wyeth-Ayerst，Philadelphia，PA)。
将培养物在37℃下5％CO2中孵育5天。每孔中加入0.5微居里的氚标记的胸腺嘧啶(NEN)。第二天收集培养物并用Wallac TriBeta闪烁探测系统评估掺入情况。
所有的测试至少重复一次。报告的所有测试都显示出对抗原破伤风类毒素的强烈阳性对照应答。应答取各试验内的平均值，之后针对基线应答进行标准化。若应答为基线应答的至少2.95倍则记录为阳性事件(即，增殖应答)。
记录了所有92名供体对源自ALCALASE_酶的肽的免疫应答(即，T-细胞增殖)，并示于附图3。鉴定了六个显著表位。被鉴定为特别感兴趣的肽包括肽1、7和8、14、29和39，如附图2和3所示。这些肽对应以下序列
肽编号 序列 SEQ ID NO1 AQTVPYGIPLIKADK 27-8 QGFKGANVKVAVLDTGIQ9014 PDLNVVGGASFVAGE 1529 PSVSLYAVKVLNSSG 3039 TNGMDVINMSLGGPS 40对于所测试供体，对该肽组的整个背景应答率为2.35±2.56％。上表中，肽7-8是一个18个氨基酸(肽#7，肽#8加3个独特的氨基酸)的连续序列。之所以将肽7和8组合是由于对这两个肽都观察到了良好的应答。
实施例4检测变体肽选择第7号和第29号肽作进一步分析。根据第7号肽和第29号肽的序列构建改变肽的组，其中氨基酸残基从亲本序列修饰而来。这可由商家完成，例如Mimostopes(San Diego)。对各肽进行了丙氨酸扫描(参见例如，Harris，等人，Immunol.，84555-561；和Maillere等人，Mol.Immunol.，321073-1080)。如实施例3所述用改变的肽对一组供体样品进行了检测。比较增殖应答。
在一种实施方式中，如果满足了以下至少一个标准且优选满足以下全部三个标准，则某一改变的肽被认为是对产生低变应原性的蛋白质分子(即，根据本发明的修饰的枯草杆菌蛋白酶蛋白质)有用的(1)对亲体肽应答的刺激指数(SI)约大于2.95的所有供体对改变肽的应答的SI约为1.0或更低；(2)对亲体肽产生弱应答(SI大于约1.0但小于约2.95)的所有供体对改变肽的应答的SI约为1.0或更低；和(3)对亲体肽不应答的所有供体对改变的肽也不应答。SI是与对照肽相比对某肽的T-细胞增殖应答指标。计算各肽对各供体的SI。
实施例5HLA与表位肽号的相关性利用可商业获得的基于PCR的HLA分型试剂盒(Bio-Synthesis)评估所有经上述两轮检测测试的供体的HLA-DR和DQ的表达。在一些实施方式中，以自由度为1的X2检测测试了针对某号肽的应答者和非应答者中单个HLA-DR和-DQ抗原的表型频率。无论所研究的HLA抗原存在于应答和非应答个体样品这两者中的何处都计算了与对应于所述肽号的表位发生反应的增强或减弱的可能性，且相应的表位被认为是与HLA相关的表位。
还可以分析表达表位相关HLA等位基因的应答者和非应答者中对单个肽的增殖应答的数量级。“对肽的个体应答者”根据刺激指数大于2.95来定义。预期，表达与HLA等位基因相关的表位的供体中的增殖应答将比不表达该相关等位基因的肽应答者中的要高。
由上可见，显然本发明提供鉴定野生型枯草杆菌蛋白酶Carlsberg，例如ALCALASE_，中的T-细胞表位的方法和组合物。一旦抗原表位得以鉴定，即根据意愿修饰表位，并且将经修饰表位的肽序列整合进野生型枯草杆菌蛋白酶Carlsberg，这样修饰的序列不再能够引发CD4+T-细胞应答或与野生型亲本相比CD4+T-细胞应答显著降低。尤其是，本发明提供手段，包括适于降低ALCALASE_免疫原性的方法和组合物。
实施例6突变型变体枯草杆菌蛋白酶对二甲基酪蛋白(“DMC”)的水解分析了根据本文所述方法分离纯化的突变型变体枯草杆菌蛋白酶水解商业合成底物二甲基酪蛋白(Sigma C-9801)的能力。在适当的缓冲液中准备5mg/ml DMC底物溶液(5mg/ml DMC，0.005％(w/w)Tween 80_(聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯，Sigma P-1754))。制备了适当的DMC底物缓冲液(例如，50mM醋酸钠，pH 5.5；50mM N-三(羟甲基)甲基-2-氨乙基磺酸(“TES”)，pH 6.5；50mM哌嗪-N-N′-二-2-乙基磺酸(″PIPES″)，pH 7.5；和50mM Tris，pH 8.5)。开始检测时，先将200μl pH适宜的底物加入微量滴定板板孔(例如，96孔板)，并在加酶之前在37℃下预孵育20分钟。用2，4，6-三硝基苯磺酸盐(“TNBS”)显色反应法和Spectra Max 250分光光度计测定活性。该检测法测量了将DMC转变成带自由氨基基团的肽的酶水解。这些氨基基团与2，4，6-三硝基苯磺酸反应形成一种黄色复合物。
因此，反应颜色越深，测得的活性越强。TNBS检测法可以在在37℃下孵育2小时后的上清液中实施。在含有2.4g NaOH、45.4gNa2B4)7·10H2O(加热溶解于1000ml中)的溶液中制备1mg/ml TNBS溶液。取该溶液等量加入96孔板微量滴定板，每孔60μl。之后，向各孔加入10μl上述孵育的酶溶液，并于室温下混合20分钟。然后，各孔中混入20μl NaH2PO4溶液(2000ml中含70.4g NaH2PO4·H2O和1.2g Na2SO3)1分钟以终止反应，用SpectraMax 250分光光度计测定405nm处的吸收。还制备并测定了空白对照(相同的TNBS溶液，但是不加酶)。在不同的酶浓度下(0、2.5、5、7.5、和10ppm)用以下公式计算水解吸收405(酶溶液)-吸收405(无酶)可以用这种方法测定突变型变体相对来自已知突变型变体的枯草杆菌蛋白酶(例如已表征的突变型枯草杆菌蛋白酶)水解这样的底物的相对能力。
实施例7变体枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶对胶原蛋白、弹性蛋白和角蛋白的水解常分析根据上述方法分离纯化的突变型枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体水解商业底物的能力，例如牛胶原蛋白(SigmaC-9879)、牛弹性蛋白(Sigma E-1625)、和/或牛角蛋白(ICN Biomedical902111)。制备5mg/ml底物溶液(于0.005％Tween 80_中)。以本领域已知的适宜pH制备各底物(例如，pH 5.5、6.5、7.5、和8.5)。为进行检测，于37℃下将1.5ml各底物转入24孔Costar板。加酶前将板在37℃下孵育20分钟。在37℃下孵育2小时后在上清液中实施TNBS检测。
预期，这些检测方法可用于证明突变型变体相对来自已知突变型变体的枯草杆菌蛋白酶而言水解这样的底物的相对能力。在大部分情况下，预计在不同pH和不同酶浓度下，突变酶之间相比以及与野生型酶相比，突变酶将通常显示对胶原蛋白、弹性蛋白和角蛋白底物的显著水解。
实施例8蛋白质变体在哌嗪-N-N′-二-2-乙基磺酸(“PIPES”)缓冲液中的热稳定性在这些试验中测定了PIPES中的蛋白质(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg)变体的热稳定性。通常用Stratagene Robocycler型PCR热循环仪实施这些测定。在每个温度下测试了5.0ppm酶(例如，目的突变体和对照突变酶)在pH6.5下、5个时间点(例如，5、10、20、40、和60分钟)的稳定性。例如，在PCR热循环仪梯度中42℃～56℃范围内每两度一次、以及在42℃～56℃范围内每隔一度一次对样品进行测试。在这些试验中，制备50mM PIPES缓冲液(50mM PIPES，0.005％Tween 80_)。典型地，将pH调至6.5。然而，无意将本发明限制于特定的方法，因为本领域中已知测定酶温度稳定性的各种不同方法。
pH 6.5和25℃下，用标准琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺(″SAAPFpNA″)检测法测试样品(参见例如，Delmar，Anal.Biochem.，94316-320；和Achtstetter，Arch.Biochem.Biophys.，207445-54)。将样品稀释至约300毫OD/分钟。温度稳定性典型的表示为酶半衰期(分钟)，根据以下计算H.L.＝ln 2/斜率，其中斜率为各温度下速率-时间曲线的斜率。
用这些方法可以容易的比较突变型变体相对于对照突变型酶和/或野生型酶的稳定性。
实施例9枯草杆菌蛋白酶Carlsberg变体在N-三(羟甲基)甲基-2-氨乙基磺酸(“TES”)中的温度稳定性在这些试验中测定了变体在TES中的温度稳定性。如上所述，在每个温度下检测了5.0ppm酶(例如，目的突变体和对照)在pH6.5下、5个时间点(例如，5、10、20、40、和60分钟)的稳定性。例如，在PCR热循环仪梯度中42℃～56℃范围内每两度一次、以及在42℃～56℃范围内每隔一度一次对样品进行测试。将50mM TES(Sigma T 1375)与0.005％Tween 80_混合制备TES缓冲液。典型地，将pH调至6.5。
变体的温度稳定性可以测定为，在pH6.5和25℃下，采用本领域已知的琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺(″AAPFpNA″)检测法用例如Sigma no.S-7388(摩尔分子量624.6g/mole)的试剂测定的残留变体活性(参见例如，Delmar等人，Anal.Biochem.，94316-320；和Achtstetter，Arch.Biochem.Biophys.，207445-454)。将样品稀释至约300mOD/min，用SpectraMax 250分光光度计在410nm处分光光度测定反应中形成的对硝基苯胺(pNA).εM＝8480M-1.cm-1，()。温度稳定性表达为上述的酶半衰期(分钟)。如上所示，这些试验提供了比较变体酶制剂与对照突变型酶和/或野生型酶之间的稳定性的方法。
实施例10枯草杆菌蛋白酶Carlsberg变体在沐浴液和其它个人护理产品中的稳定性用以下程序测定了各种枯草杆菌蛋白酶Carlsberg变体的稳定性。
测定溶液稳定性的方法在这些试验中，至少在两项研究中测试了枯草杆菌蛋白酶Carlsberg和突变型变体，第一项研究在45℃下测试30分钟，第二项在50℃下测试30分钟。为进行这些测试，将可商业获得的沐浴露(例如，销售商标为ZEST_的Procter&Gamble的沐浴露)与去离子水混合制备50/50(w/w)沐浴露溶液。缓冲混合物的pH约为6.8。
稀释要测试的酶，以使得用SAAPFpNA检测端点法检测10μl酶/沐浴露溶液时酶在50w/w％沐浴露去离子水溶液中的终浓度导致OD405由0.5变为1.0。一旦确定了稀释的量，即可将200μl稀释了的混合物置于96孔微量滴定板板孔中。将板密封，置于40℃水浴中进行一项研究，以及置于50℃水浴中进行另一项研究。经过想要的时间长度(例如，30或45分钟)后将板从水浴中取出，取10μl样品用端点法检测。残余活力的百分数计为终活力除以初始活力所得值的100倍。
在一些试验中，带有在前述实施例中确定的特异残基的变体显示出残余酶活性量增加因而比对照具有更宽的温度稳定性。例如，在50°C下，一些变体化合物有更大的残余活性百分数，而不带有稳定残基变体的对照突变酶和/或野生型酶具有较低的残余活性百分数。在一些试验中，所有的酶在50℃下在沐浴露中具有增强的稳定性，而带有不同稳定性变体的对照突变酶-[表位变体]具有更好的稳定性。
确切的说，本发明的具有减弱的免疫原性的枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体可以用于许多用途。除了去污剂和其它的清洁制剂外，免疫原性减弱的枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体还可用于个人护理产品。下列表格提供了适于在测试中使用的各种产品的组合物。这些表格中，术语“微量成分”包括pH调节剂、防腐剂、粘度调节剂和香料。除非特别指明，这些表格中的量代表近似重量百分比(制造商所提供的)并且无意指明有效数(significant digit)。
保湿沐浴露 pH＝7
沐浴露 pH 6.5 pH 7 pH 8.5
1-Cognis
护肤露 pH 7 pH 7 pH 7.5 pH 7
1-Uniqema2-Seppic4-Dow Corning
超高保湿面霜/洗面液 pH 7 pH 7
1-Seppic3-Dow Corning4-Uniqema5-Scher Chemicals6-Dow Chemicals
1-Uniqema2-BF Goodrich4-Dow Corning实施例11清洁组合物除上述组合物外，本发明还提供开发具有特定特性的清洁组合物的方法。确切的说，本发明提供包含修饰蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg)的各种清洁组合物。在特别优选的实施方式中，可用于清洁大量需要蛋白酶去污处理的表面的组合物中包括了有效量的上述一种或更多种蛋白酶。这样的清洁组合物包括用于清洁硬质表面的去污剂组合物；清洁织物的去污剂组合物；餐具清洁组合物；口腔清洁组合物；以及假牙清洁组合物。意图根据特定的目的用途来提供任何适宜形式的这些组合物。优选，本发明的清洁组合物含有约0.0001％至约10％的一种或更多种蛋白酶，更优选约0.001％至约1％，和更优选约0.001％至约0.1％。以下进一步讨论几个可以使用蛋白酶的各种清洁组合物的例子。除非特别指明，本文中的所有份数、百分数和比率都是按重量计的。
A.用于硬质表面、餐具和织物的清洁组合物本发明的蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)可用于任何要求泡沫丰富和/或良好的不溶性底物去除效果的去污剂组合物。因此，本发明的蛋白酶可以与各种常规成分一起使用以提供完全配方的硬质表面清洁物、餐具清洁组合物、织物洗涤组合物，以及类似。这些组合物适于根据特定用途以任何可接受的形式(例如，液体、颗粒、条状，等)使用。此外，这些组合物还适于在可以商业获得的“浓缩”去污剂中使用，该去污剂中含有30％-60％重量比的表面活性剂。
在一些实施方式中，该清洁组合物包含各种阴离子、非离子、两性离子等表面活性剂。这样的表面活性剂的存在水平典型为占组合物约0.1％至约60％，优选约1％至约35％。适宜的表面活性剂包括但不限于，常规的C11-C18烷基苯磺酸酯和伯烷基硫酸酯和任意烷基硫酸酯；分子式为CH3(CH2)x(CHOSO3).sup.-M.sup.+)CH3和CH3(CH2)y(CHOSO3.sup.-M.sup.+)CH2CH3的C10-C18仲(2，3)烷基硫酸酯，其中x和(y+1)是至少约7、优选至少约9的整数，M为水溶性阳离子，特别是钠；C10-C18烷基烷氧基硫酸酯(特别是EO 1-7乙氧基硫酸酯)；C10-C18烷基烷氧基羧酸酯(特别是EO 1-7乙氧基羧酸酯)；C10-C18烷基聚苷，及其相应的硫酸化聚苷；C12-C18α-磺化脂肪酸酯；C12-C18烷基和烷基苯酚烷氧基化物(特别是乙氧化物和混合乙氧基/丙氧基)；C12-C18甜菜碱和磺基甜菜碱(“磺基甜菜碱”)；C10-C18胺氧化物；C8-C24肌氨酸盐(特别是油酰肌氨酸盐)，及类似。此处优选烷基烷氧基硫酸酯(AES)和烷基烷氧基羧酸酯(AEC)。此外，还优选根据想要的剂型将这样的表面活性剂与前述胺氧化物和/或甜菜碱或磺基甜菜碱表面活性剂一起使用。其它的常规有用的表面活性剂是本领域技术人员公知的，包括但不限于特别有用的表面活性剂例如C10-C18N-甲基葡糖酰胺(参见，US专利No.5 194639)。
在一些实施方式中，本发明的组合物包括非离子表面活性剂类别的成员，该非离子表面活性剂是环氧乙烷与疏水部分的缩合物以形成平均亲水-亲脂平衡(HLB)为5至17、优选6至14、更优选7至12的表面活性剂。疏水(亲脂)部分可以是天然的脂肪族或芳香族基团，可以容易的调节与任一特定疏水基团缩合的聚环氧乙烷的长度以产生具有所要的亲水及疏水元素平衡程度的水溶性化合物。特别优选的是每摩尔醇含3-8摩尔环氧乙烷的C9-C15伯醇乙氧化物(或混合乙氧基/丙氧基)特别是每摩尔醇含6-8摩尔环氧乙烷的C14-C15伯醇，每摩尔醇含35摩尔环氧乙烷的C12-C15伯醇，及其混合物。
大量的其它在去污剂清洁组合物中有用的成分可用于本文的组合物，包括其它活性成分、载体、水溶助长剂、操作助剂、染料或色素、用于液体配剂的溶剂，等。为另外增加泡沫，在组合物中可以加入增泡剂例如C10-C16alkolamides，典型水平为约1％至约10％。C10-C14单乙醇和二乙醇酰胺代表了这种增泡剂的典型类别。将这种增泡剂与上面提到的泡沫丰富的附加表面活性剂例如胺氧化物、甜菜碱和磺基甜菜碱一起使用也是有利的。如果想要的话，还可以加入典型为约0.1％至约2％的可溶性镁盐例如MgCl2，MgSO4等以提供更多的泡沫。
本文的液体去污剂组合物典型地含有水和其它溶剂作为载体。低分子量的伯醇或仲醇(例如，甲醇，乙醇，丙醇，和异丙醇)是适宜的。一元醇对于增溶表面活性剂是优选的，但是多元醇例如那些含有约2至约6个碳原子和约2至约6个羟基基团的多元醇(例如，1，3-丙二醇、乙二醇、丙三醇、和1，2-丙二醇)也可用于本发明的去污剂。在一些实施方式中，组合物含有约90％，或如下约10％至约50％这样的载体。
此处的去污剂组合物优选配制成如下，即在水性清洁操作使用过程中，洗涤水的pH在约6.8和约11.0之间。因此，终产物典型的配制在这个范围内。将pH控制在推荐使用水平的技术包括使用缓冲剂、碱、酸等，而且是本领域技术人员熟知的。
当配制本发明的硬质表面清洁组合物和织物清洁组合物时，配制人员可能想加入重量比为约5％至约50％的各种增效助剂。典型的增效助剂包括1-10微米沸石，聚羧酸例如柠檬酸和氧联丁二酸氢(oxydisuccinate)、多层硅酸盐、磷酸，以及类似。其它常规的增效助剂是本领域已知的且适于包含在本发明的组合物中。
同样，配制人员或许想在这样的组合物中加入各种附加的酶，例如纤维素酶、脂酶、淀粉酶、过氧化物酶和蛋白酶，典型水平为约0.001％至约1％重量比。各种去污酶和织物护理酶是洗衣去污剂领域中熟知的并适于包含在本发明组合物中。
各种漂白化合物，例如过碳酸盐、过硼酸盐及类似，也可用于本发明组合物中。这些漂白化合物典型以约1％至约15％重量比水平存在。如果想要的话，这样的组合物也可以包含漂白激活剂例如四乙酰乙二胺，壬酰羟苯磺酸盐，及类似，它们也是本领域公知的。这样的化合物的使用水平典型为约1％至约10％重量比。
各种污垢释放剂(soil release agent)，尤其是阴离子酯类低聚物型的，各种螯合剂，尤其是氨基膦酸盐和乙二胺丁二酸氢盐，各种土块去除剂(clay soil removal agent)，尤其是乙氧基化的四亚乙基戊胺，各种分散剂，尤其是聚丙烯酸酯和聚天冬氨酸，各种增亮剂，尤其是阴离子增亮剂，各种染料转移抑制剂，例如聚乙烯基吡咯烷酮，各种抑泡剂，尤其是硅氧烷和仲醇，各种织物柔软剂，尤其是绿土块和污垢絮凝(clay floculating)聚合物(例如，聚(环氧乙烷))，及类似，都可用于本发明组合物中，最典型的水平是自约1％至约35％重量比。
酶稳定剂也可用于本发明的清洁组合物。这样的酶稳定剂包括但不限于丙二醇(优选自约1％至约10％)、甲酸钠(优选自约0.1％至约1％)和甲酸钙(优选自约0.1％至约1％)。
1.硬质表面清洁组合物在优选实施方式中，本发明的硬质表面清洁组合物含有有效量的一种或更多种蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)，活性蛋白酶占组合物重量比优选自约0.0001％至约10％，更优选自约0.001％至约5％，还更优选自约0.001％至约1％。除了含有一种或更多种蛋白酶，这样的硬质表面清洁组合物还典型地含有表面活性剂和水溶性螯合助剂。然而，在特定的专业产品例如喷涂窗户清洁剂中，有时候不使用表面活性剂因为它们可能在玻璃表面产生薄膜/条纹状残留物。
如果存在表面活性剂组分，其含量可以低至占本文组合物的0.1％，但是典型地组合物将含有约0.25％至约10％、更优选自约1％至约5％的表面活性剂。
典型地，组合物包含约0.5％至约50％的去污助剂，优选自约1％至约10％。优选，pH应当在约8至12之间。如果需要调节的话，可以用常规的pH调节剂例如氢氧化钠、碳酸钠或盐酸。
在一些实施方式中，组合物中包括至少一种溶剂。有用的溶剂包括但不限于，乙二醇醚，例如二乙基乙二醇单己基醚，二乙基乙二醇单丁基醚，乙二醇单丁基醚，乙二醇单己基醚，丙二醇单丁基醚，二丙二醇单丁基醚，和二醇例如2，2，4-三甲基-1，3戊二醇和2-乙基-1，3-己二醇。使用时，这样的溶剂典型地以自约0.5％至约15％，优选自约3％至约11％的水平存在。
此外，高挥发性溶剂例如异丙醇或乙醇可用于本发明的组合物，以使得当在表面上应用了“全强度(full strength)”的组合物后不对表面进行清洗时利于组合物从表面更快地蒸发。使用时，挥发性溶剂典型的存在水平为占组合物约2％至约12％。
用以下非限制性例子举例说明本发明的硬质表面清洁组合物实施方式。在以下例子中，例子中提及的“蛋白酶#”是指在本发明组合物中有用的变体，该组合物中免疫应答减弱的蛋白酶变体百分比为0.10、0.20、0.10、0.05、0.03、和0.02。
**Na4乙二胺二乙酸***二乙二醇单己基醚****所有配剂调至pH 7。
在上述例子的一些实施方式中，用在本发明中有用的另外的蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)替换得到了基本相似的结果。此外，在上述例子的一些实施方式中，在上述配方中，用在本发明中有用的、免疫原性减弱的蛋白酶的任意组合(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)替换得到了基本相似的结果。
下表提供了适于清洁硬质表面和除霉的样品组合物。产物组合物的典型pH约为7。
在这些例子中，用在本发明中有用的蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)的任意组合替换得到了基本相似的结果。
2.餐具洗涤组合物在本发明另外的实施方式中，提供了含有一种或更多种蛋白酶(例如，突变型枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶)的餐具洗涤组合物。以下举例说明了本发明优选的餐具洗涤组合物实施方式。其中的蛋白酶百分含量为0.5、0.4、0.1、0.05、0.03、和0.02。这些组合物中，将产物的pH调至7。
在上述紧接的例子的一些实施方式中，用在本发明中有用的蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)替换得到了基本相似的结果。此外，在上述紧接的例子的一些实施方式中，用在本发明中有用的蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)的任意组合在上述配方中替换得到了基本相似的结果。
在上述配方中，用在本发明中有用的、免疫原性减弱的蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)替换得到了基本相似的结果。还是在上述紧接着的配方中，可以以基本相似的结果将本文所述的、在本发明中有用的蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)的任意组合替换进去。
3.织物清洁组合物本发明进一步提供含有一种或更多种蛋白酶的织物清洁组合物(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)。
a.颗粒织物清洁本发明的颗粒状织物清洁组合物包含有效量的一种或更多种蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)，活性蛋白酶与组合物的重量比优选为自约0.001％至约10％，更优选自约0.005％至约5％，更优选自约0.01％至约1％。除一种或更多种蛋白酶外，该颗粒织物清洁组合物还典型含有至少一种表面活性剂，一种或更多种增效助剂，在有些情况中还含有漂白剂。通过以下例子举例说明本发明的颗粒状织物清洁组合物实施方式。
在上述配方中，用在本发明中有用的、免疫原性减弱的蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)替换得到了基本相似的结果。还是在上述紧接着的配方中，可以以基本相似的结果将本文所述的、在本发明中有用的蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)的任意组合替换进去。
在上述配方中，用在本发明中有用的、免疫原性减弱的蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)替换得到了基本相似的结果。还是在上述配方中，可以以基本相似的结果将本文所述的、在本发明中有用的蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)的任意组合替换进去。
颗粒状织物清洁组合物
在另外的实施方式中，提供了致密的颗粒状织物清洁组合物，例如下述。所提供的成分以重量百分数计。组合物1烷基硫酸酯(8.0)、烷基乙氧基硫酸酯(2.0)、3和7倍乙氧基化的C25和C45醇的混合物(6.0)、多羟基脂肪酸酰胺(2.5)、沸石(17.0)、多层硅酸盐/柠檬酸盐(16.0)、碳酸盐(7.0)、马来酸丙烯酸共聚物(5.0)、污垢释放聚合物(0.4)、羧甲基纤维素(0.4)、聚(4-乙烯吡啶)-N-氧化物(0.1)、乙烯基咪唑和乙烯基吡咯烷酮的共聚物(0.1)、PEG-2000(0.2)、蛋白酶#(4％Prill)(0.5)、脂酶(0.2)、纤维素酶(0.2)、四乙酰乙二胺(6.0)、过碳酸盐(22.0)、乙二胺二琥珀酸(0.3)、抑泡剂(3.5)、二钠-4，4’-二(2-吗啉代-4-苯氨基-s-三嗪-6-基氨基)茋-2、2′-二硫酸盐(0.25)、二钠-4，4’-二(2-sulfostynl)二苯基(0.05)，以及水、香料和微量成分(加至100)的组合。
在另一个作为选择的颗粒状织物清洁组合物中，提供了以下成分。所提供的成分以重量百分数计。组合物2线性烷基苯磺酸酯(7.6)、C16-C18烷基硫酸酯(1.3)、7倍乙氧基化的C14-15醇(4.0)、椰油-烷基-二甲基羟基乙基氯化铵(1.4)、分散剂(0.07)、硅氧烷流体(0.8)、柠檬酸三钠(5.0)、沸石4A(15.0)、马来酸丙烯酸共聚物(4.0)、二乙基三胺五亚甲基膦酸(0.4)、过硼酸盐(15.0)、四乙酰乙二胺(5.0)、绿土块(10.0)、聚(环氧乙烷)(MW 300000)(0.3)、蛋白酶#(4％Prill)(0.4)、脂酶(0.2)、淀粉酶(0.3)、纤维素酶(0.2)、硅酸钠(3.0)、碳酸钠(10.0)、羧甲基纤维素(0.2)、增亮剂(0.2)，以及水、香料和微量成分(加至100)的组合。
在又一作为选择的颗粒状织物清洁组合物中，提供了以下成分。所提供的成分以重量百分数计。组合物2线性烷基苯(6.92)、牛油烷基硫酸酯(2.05)、7倍乙氧基化的C14-15醇(4.4)、C12-15烷基乙氧基硫酸酯-3倍乙氧基化的(0.16)、沸石(20.2)、柠檬酸盐(5.5)、碳酸盐(15.4)、硅酸盐(3.0)、马来酸丙烯酸共聚物(4.0)、羧甲基纤维素酶(0.31)、污垢释放聚合物(0.30)、蛋白酶#(4％Prill)(0.2)、脂酶(0.36)、纤维素酶(0.13)、过硼酸盐四水合物(11.64)、过硼酸盐单水合物(8.7)、四乙酰乙二胺(5.0)、二乙基三胺五亚甲基膦酸(0.38)、硫酸镁(0.40)、增亮剂(0.19)，香料、硅氧烷和抑泡剂的混合物(0.85)，以及微量成分(加至100)。
在上述配方中，用在本发明中有用的、免疫原性减弱的蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)替换得到了基本相似的结果。还是在上述配方中，可以以基本相似的结果将在本发明中有用的蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)的任意组合替换进去。
b.液体织物清洁组合物本发明的液体织物清洁组合物含有有效量的一种或更多种蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)，活性蛋白酶与组合物的重量比优选为自约0.0001％至约10％，更优选自约0.001％至约1％，和最优选自约0.001％至约0.1％。这样的液体织物清洁组合物一般还含有阴离子表面活性剂、脂肪酸、水溶性去污增效助剂和水。通过以下例子举例说明本发明的液体织物清洁组合物实施方式。
在上述配方中，用在本发明中有用的、免疫原性减弱的蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)替换得到了基本相似的结果。还是在上述配方中，可以以基本相似的结果将在本发明中有用的蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)的任意组合替换进去。
在上述配方中，用在本发明中有用的、免疫原性减弱的蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)替换得到了基本相似的结果。还是在上述紧接着的配方中，可以以基本相似的结果将在本发明中有用的蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)的任意组合替换进去。
c.条状织物清洁组合物适宜手洗受污织物的本发明的条状织物清洁组合物包含有效量的一种或更多种蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)，优选占组合物重量约0.001％至约10％，更优选自约0.01％至约1％。通过以下例子对本发明的条状织物清洁组合物的实施方式进行举例说明。
在上述配方中，用在本发明中有用的、免疫原性减弱的蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)替换得到了基本相似的结果。还是在上述配方中，可以以基本相似的结果将在本发明中有用的蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)的任意组合替换进去。
B.另外的清洁组合物除上述讨论的硬质表面清洁、餐具洗涤和织物清洁组合物之外，一种或更多种蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)可用作各种其它想要对不溶性底物进行水解的清洁组合物的组分。所述其它清洁组合物包括但不限于口腔清洁组合物、假牙清洁组合物、和隐形眼镜清洁组合物，以及其它个人护理清洁组合物。
1.口腔清洁组合物在本发明的补充实施方式中，对从牙齿或假牙上清除蛋白质污渍有用的组合物中含有药学上可接受量的一种或更多种蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)。优选地，本发明的口腔清洁组合物含有占组合物重量约0.0001％至约20％，更优选自约0.001％至约10％，还更优选自约0.01％至约5％的一种或更多种蛋白酶，以及药学上可接受的载体。典型地，口腔清洁组合物中的药学上可接受的口腔清洁载体组分一般占组合物重量约50％至约99.99％，优选自约65％至约99.99％，更优选自约65％至约99％。
在本发明的口腔清洁组合物中可以含有的药学上可接受的载体组分以及任选组分是本领域技术人员公知的。US专利No.5 096 700；US专利No.5 028 414；和US专利No.5 028 415公开了大量在口腔清洁组合物中有用的组合物类型、载体组分和任选组分，将它们引入本文作为参考。用以下例子举例说明本发明口腔清洁组合物的实施方式。
*PEG-6-聚乙二醇，MW为600。
**称为Zeodent 119(J.M.Huber)的沉淀二氧化硅。
***Carbopol(B.F.Goodrich Chemical Co.)。
****Iota carrageenan(Hercules Chemical Co.)。
在上述配方中，用在本发明中有用的、免疫原性减弱的蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)替换得到了基本相似的结果。还是在上述配方中，可以以基本相似的结果将在本发明中有用的蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)的任意组合替换进去。
在上述配方中，用在本发明中有用的、免疫原性减弱的蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)替换得到了基本相似的结果。还是在上述配方中，可以以基本相似的结果将在本发明中有用的蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)的任意组合替换进去。
在上述配方中，用在本发明中有用的、免疫原性减弱的蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)替换得到了基本相似的结果。还是在上述配方中，可以以基本相似的结果将在本发明中有用的蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)的任意组合替换进去。
*由L.A.Dreyfus Co.提供。
在上述配方中，用在本发明中有用的、免疫原性减弱的蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)替换得到了基本相似的结果。还是在上述配方中，可以以基本相似的结果将在本发明中有用的蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)的任意组合替换进去。
2.假牙清洁组合物还是在补充实施方式中，本发明提供各种用于在口腔外清洁假牙的假牙清洁组合物，它含有一种或更多种蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)。这样的假牙清洁组合物含有有效量的一种或更多种蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)，所述一种或更多种蛋白酶与组合物的重量比优选为约0.0001％至约50％，更优选自约0.001％至约35％，更优选自约0.01％至约20％，所述组合物还含有假牙清洁载体。各种假牙清洁组合物形式例如泡腾片等是本领域熟知的(参见例如，US专利No.5 055 305，引入本文作为参考)，而且通常适于加入用于从假牙去除蛋白质污渍的一种或更多种蛋白酶。
通过以下例子举例说明本发明假牙清洁组合物的实施方式。
在上述配方中，用在本发明中有用的、免疫原性减弱的蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)替换得到了基本相似的结果。还是在上述配方中，可以以基本相似的结果将在本发明中有用的蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)的任意组合替换进去。
3.个人清洁组合物在本发明的补充实施方式中，用于清洁皮肤的个人清洁组合物含有一种或多种蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)。这样的组合物典型地含有占组合物重量比为自约0.001％至约5％的蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)，优选自约0.005％至约2％，和最优选自约0.01％至约0.8％。其中可以包括本文所述蛋白酶的优选个人清洁组合物包括但不限于在US专利申请系列号08/121623和08/121624中所描述的那些。尽管本发明预期可以使用各种组合物，一种含有皂组分的液体个人清洁组合物含有(重量％)皂(K或Na)(15.00)、30％月桂酸盐、30％肉豆蔻酸盐、25％棕榈酸盐、15％硬脂酸盐、脂肪酸(上述比率)(4.50)、月桂肌氨酸钠(6.00)、laureth-3硫酸钠(0.66)、cocamido propylbetaine(1.33)、丙三醇(15.00)、丙二醇(9.00)、polyquaternium 10(0.80)、乙二醇二硬脂酸(EDTA)(1.50)、对羟基苯甲酸丙酯(0.10)、羟苯甲酯(0.20)、蛋白酶#(0.10)、KOH或NaOH(如果需要调节pH)、硫酸钙(3)、乙酸(3)，以及水(平衡至100)。
在另一实施方式中，本发明还提供了个人清洁条状物。尽管本发明预期了各种组合物，一种含有皂成分的条状个人清洁组合物包括(重量比)椰油羟乙基磺酸钠(47.20)、cetearyl磺酸钠(9.14)、石蜡(9.05)、钠皂(原位)(3.67)、羟乙基磺酸钠(5.51)、氯化钠(0.45)、二氧化钛(0.4)、EDTA三钠(0.1)、羟乙磷酸三钠(0.1)、香料(1.20)、Na2SO4(0.87)、蛋白酶#(0.10)，以及水和微量成分的混合物(平衡至100)。
在上述配方中，用在本发明中有用的、免疫原性减弱的蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)替换得到了基本相似的结果。还是在上述配方中，可以以基本相似的结果将在本发明中有用的蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)的任意组合替换进去。
实施例12洗涤性能测试可以用本领域公知的任何适宜方法来评估在本发明组合物中有用的变体的洗涤性能。本实施例中描述了一种测定从EMPA 116(棉底质上的血渍/奶渍/碳黑)布样(Testfabrics，Inc.，Middlesex，N.J.07030)上去除污渍的适宜方法。
将六块切成3×41/2英寸、带红边的EMPA 116布放在各个Model7243S Terg-O-Tometer(United States Testing Co.，Inc.，Hoboken，N.J.)罐子里，该Model 7243S Terg-O-Tometer含有1000ml硬度为15gpg(Ca++∶Mg++3∶1w∶w)的水、7g去污剂以及适量酶。基础去污剂是wfk--Testgewebe GmbH，(Krefeld，Germany)的WFKl去污剂，它具有以下组分(％最终配方)沸石A(25％)、硫酸钠(25％)、苏打灰(10％)、线性烷基苯磺酸酯(8.8％)、醇乙氧化物(7-8 EO)(4.5％)、钠皂(3％)、和硅酸钠(SiO2∶Na2O::3.3∶1)(3％)。
向该基础去污剂中再加入以下物质(％最终配方)过硼酸钠单水合物(13％)、共聚物(Sokalan CP5)(4％)、TAED(Mykon ATC Green)(3％)、酶(0.5％)，和增白剂(Tinopal AMS-GX)(0.2％)。
过硼酸钠单水合物可从各种商业途径获得，包括DegussaCorporation，Ridgefield-Park。Sokalan CP5获自BASF Corporation，Parsippany，N.J.。Mykon ATC Green(TAED，四乙酰乙二胺)可从Warwick International，Limited，England获得。T inopal AMS GX可从Ciba-Geigy Corporation，Greensboro，N.C.得到。
在一种适宜的测试方法中，将六块EMPA 116布在含酶的去污剂中60℃洗涤30分钟，在1000ml水中漂洗两次各5分钟。以0.05至1ppm的终浓度加入酶制定标准曲线，以0.25ppm作常规分析。将布烘干、压平，用Minolta Chroma Meter，Model CR-200(MinoltaCorporation，Ramsey，NJ.)L*a*b*标度的L值来测定布的反射度。在一些实施方式中，测试酶的性能以解淀粉芽孢杆菌(BPN′)蛋白酶性能的百分数表示，并且通过用解淀粉芽孢杆菌(BPN′)蛋白酶的量除以去除相同污渍所需的蛋白酶变体(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)量再乘以100来计算。
实施例13变体枯草杆菌蛋白酶Carlsberg在液体去污剂配剂中的稳定性本实施例提供一种比较蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)与解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶及其变体酶在液体去污剂中对抗失活的稳定性的方法。由于其它方法可用于本发明，因此无意于将本发明限制于该方法。
本方法中，用于研究的去污剂配剂是可以商业获得的洗衣去污剂(例如，Tide_ Ultra液体洗衣去污剂(Proctor&Gamble))。在一些实施方式中，需要对去污剂配剂进行热处理以使原来的蛋白酶失活。这通过将去污剂在96℃下孵育4.5小时来完成。之后将20克酶/升范围内的欲检测解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶及变体(例如，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)浓缩制剂加入经热处理的去污剂，室温下在去污剂配剂中的终浓度为0.3克酶/升。之后将添加了蛋白酶的热处理去污剂在50℃水浴中孵育。以0、24、46、76、和112小时的间隔从孵育试管中取出等分试样，并将其加入1cm的比色杯中检测酶活性，该比色杯中含有1.2mM溶于0.1M Tris-HCL缓冲液中的合成肽底物suc-Ala-Ala-Pro-phe-对硝基苯胺，pH 8.6，25℃。通过监控反应产物对硝基苯胺在410nm处的吸收与时间的函数用分光光度法跟踪初始线性反应速率。在优选实施方式中观察到，优选的变体比天然解淀粉芽孢杆菌酶具有显著更强的对抗失活的稳定性。在特定测试条件下检测了这两种酶在洗衣去污剂配剂中的估算的失活半衰期。
所有在以上说明书中提及的公开出版物和专利都引入本文作为参考。不背离本发明的范围和精神的对本发明所述方法和系统的各种修饰和变化对于本领域技术人员来说将是显而易见的。尽管本发明已经结合特定优选实施方式进行了描述，也仍应当理解不应当将本发明过度得限制于这样的特定实施方式。事实上，那些对分子生物学、免疫学、配剂学、和/或相关领域的技术人员来说显而易见的、对实施本发明的所述模式的各种修改也意图包括在本发明范围之内。
权利要求
1.一种鉴定微生物枯草杆菌蛋白酶的至少一个T-细胞表位的方法，其中所述枯草杆菌蛋白酶包括枯草杆菌蛋白酶Carlsberg，所述方法包括步骤(i)从单一人血来源获得树突细胞溶液和原初CD4+和/或CD8+T-细胞溶液；(ii)分化所述树突细胞以产生分化的树突细胞溶液；(iii)将所述分化的树突细胞溶液和所述原初CD4+和/或CD8+T-细胞与所述枯草杆菌蛋白酶Carlsberg的肽片段混合；以及(iv)测定在所述步骤(iii)中的所述T-细胞的增殖。
2.权利要求1的方法，其中所述微生物枯草杆菌蛋白酶Carlsberg衍生自芽孢杆菌属的成员。
3.权利要求2的方法，其中所述芽孢杆菌选自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、B.alkalophilus、解淀粉芽孢杆菌、B.clausii、B.halodurans、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、和苏云金芽孢杆菌。
4.权利要求1的方法，其中所述微生物枯草杆菌蛋白酶Carlsberg包含SEQ ID NO1中所示序列的至少一部分。
5.一种减弱微生物枯草杆菌蛋白酶Carlsberg的免疫原性的方法，包括步骤(a)通过以下步骤鉴定所述蛋白质中的至少一个T-细胞表位(i)将粘着的从单核细胞衍生的树突细胞与至少一种包含所述T-细胞表位的肽接触，其中所述树突细胞已经通过体外暴露于至少一种细胞因子而分化了；和(ii)将所述树突细胞和所述肽与原初T-细胞接触，其中所述原初T-细胞与所述粘着的从单核细胞衍生的树突细胞获自同一来源，由此所述T-细胞对所述肽应答而增殖；和(b)修饰所述枯草杆菌蛋白酶Carlsberg以中和所述T-细胞表位从而产生变体蛋白质，这样所述变体蛋白诱导低于或基本上等于所述原初T-细胞的基线增殖。
6.权利要求5的方法，其中所述微生物枯草杆菌蛋白酶衍生自芽孢杆菌属的成员。
7.权利要求6的方法，其中所述芽孢杆菌选自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、B.alkalophilus、解淀粉芽孢杆菌、B.clausii、B.halodurans、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、和苏云金芽孢杆菌。
8.权利要求5的方法，其中所述微生物枯草杆菌蛋白酶Carlsberg包含SEQ ID NO1中所示序列的至少一部分。
9.权利要求5的方法，所述微生物枯草杆菌蛋白酶Carlsberg的所述表位通过以下方式被修饰(a)用来自所述微生物枯草杆菌蛋白酶的同源物的相似序列置换所述T-细胞表位的氨基酸序列，其中所述置换基本模拟T-细胞表位的主要三级结构特征。
10.权利要求5的方法，其中所述微生物枯草杆菌蛋白酶Carlsberg通过改变至少一个选自SEQ ID NO2、SEQ ID NO90、SEQ IDNO15、SEQ ID NO30、和SEQ ID NO40的表位而得到修饰。
11.权利要求10的方法，其中所述表位通过置换与至少一个所述表位对应的残基的氨基酸序列而得到修饰。
12.权利要求10的方法，其中所述表位通过删除与至少一个所述表位对应的残基的氨基酸序列而得到修饰。
13.权利要求10的方法，其中所述表位通过向至少一个所述表位添加氨基酸而得到修饰。
14.一种修饰的枯草杆菌蛋白酶Carlsberg，其中所述枯草杆菌蛋白酶Carlsberg在至少一个含有选自SEQ ID NO2、SEQ ID NO90、SEQ ID NO15、SEQ ID NO30、和SEQ ID NO40的氨基酸序列的表位中含有至少一个改变。
15.权利要求14的修饰的枯草杆菌蛋白酶Carlsberg，其中所述修饰的枯草杆菌蛋白酶Carlsberg在芽孢杆菌属的生物中表达。
16.权利要求14的修饰的枯草杆菌蛋白酶Carlsberg，其中由所述修饰的枯草杆菌蛋白酶Carlsberg产生的免疫应答弱于由野生型修饰的枯草杆菌蛋白酶Carlsberg产生的所述免疫应答。
17.权利要求14的修饰的枯草杆菌蛋白酶Carlsberg，其中由所述修饰的枯草杆菌蛋白酶Carlsberg产生的免疫应答强于由野生型修饰的枯草杆菌蛋白酶Carlsberg产生的所述免疫应答。
18.一种含有编码权利要求14的所述修饰的枯草杆菌蛋白酶Carlsberg的核酸的组合物。
19.一种含有权利要求18的核酸的表达载体。
20.一种用权利要求19的表达载体转化的宿主细胞。
21.一种包含权利要求14的修饰的枯草杆菌蛋白酶Carlsberg的组合物，选自清洁组合物、个人护理组合物、和健康护理组合物。
全文摘要
本发明提供鉴定枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白中CD文档编号G01N33/50GK1703511SQ03806962
公开日2005年11月30日 申请日期2003年2月26日 优先权日2002年2月26日
发明者F·A·哈丁 申请人:金克克国际有限公司