专利名称：用于对结合甘露聚糖的凝集素(mbl)进行免疫化学测定的组分、方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
结合甘露聚糖的凝集素(MBL)在不同的个体中可以以不同的量和不同的遗传决定的变异形式存在，从而影响这些个体对传染病的易感性和自身免疫疾病的严重性。本发明提供了一系列针对人的结合甘露聚糖的凝集素(MBL)的单克隆抗体，这些单克隆抗体可用于对该蛋白特别是在生物体液，例如人的血清或血浆中的浓度进行定量分析，还可以用来提供关于该蛋白的结构和功能信息。在本发明的一个实施方案中，提供了用于测量能够与甘露聚糖结合的寡聚化的MBL的组分、方法和试剂盒。在另一个实施方案中，提供了测量总的免疫反应性的MBL亚基的组分、方法和试剂盒，不论这些亚基是否聚合成表征具有完全生物活性的MBL的四聚体、五聚体或六聚体。本发明的组分、方法和试剂盒可用于生化和医学领域。
背景技术：
结合甘露聚糖的凝集素(MBL)是先天的免疫系统的一个重要组成部分。它是在肝脏中合成的多聚体蛋白，为一种C型凝集素，对微生物表面上的某些碳水化合物(多糖)结构表现出钙依赖的结合。甘露聚糖用作这类多糖的模型，而MBL对单糖成分，例如N-乙酰葡萄糖胺和D-甘露糖表现出亲和性。与微生物的多糖结合后，MBL通过结合的称为MASP-1、MASP-2和MASP-3的丝氨酸蛋白酶来激活补体，然后通过裂解膜攻击复合物，利用其调理效应产生的噬菌作用，并通过与细胞表面受体的直接相互作用促进杀死微生物。
MBL分子是由最多6组同源三聚体组成的寡聚复合物，每个单体为228个氨基酸残基的单链。每条链的组成为20个氨基酸的富含半胱氨酸的N-端结构域，其后是由18-20个甘氨酸-Xxx-Yyy重复序列组成的类似胶原蛋白的结构域，α-螺旋卷曲的颈结构域，最后是碳水化合物识别结构域(CRD)。三条这样的链形成一个结构单元或“头”，其中胶原蛋白结构域在各带一个CRD的三个颈部区中形成一个三螺旋尾部。N-端结构域通过链间二硫键相连。然后最多6个这样的同源三聚体头通过它们的N-端区域相连，形成正常的MBL分子结构，这可以比做一束具有三个花瓣的花。这种结构通过在相连的同源三聚体的各个链之间形成二硫键来维持。通过这种方式，MBL能够与丝氨酸蛋白酶MASP-1、MASP-2和MASP-3(以及一种相关的非酶类的肽MAp19)结合，形成的复合物当MBL结合碳水化合物时能够激活补体。
人类的MBL基因(mbl2)有许多等位基因变体。有些发生在启动子区，两个最重要的发生在-550位(H或L)和-221位(Y或X)；另一个变体发生在5’-非翻译区，在+4位(P或Q)；和有三个发生在外显子1，在+223位(A或D，Arg52Cys)、+230位(A或B，Gly54Asp)和+239位(A或C，Gly57Glu)。启动子单倍型HY、LY和LX分别与高、中和低MBL血浆水平有关，而外显子1单倍型影响蛋白链的结构和结合。连锁不平衡性决定了某些理论上可能的MBL单倍型是极端稀少的，并且尚未发现过；在100个丹麦献血者中，只检测到了下列单倍型(括弧中为频率)HYPA(0.285)、LYQA(0.235)、LXPA(0.195)、LYPB(0.135)、HYPD(0.085)、LYPA(0.045)、LYQC(0.020)。在A/A基因型(即具有正常的胶原区)中，只有LXP/LXP基因型表现出低的血浆MBL水平。A/B、A/C和A/D基因型(即正常和异常的胶原区是杂合的)在用所述的旧方法测定时显示出降低的血浆MBL水平；当它们与LX单倍型结合时，甚至记录到了更低的水平。B/B、C/D和D/D基因型(即所有的胶原区都异常的)，在用旧方法测定时显示出非常低的MBL水平，即使这些受试者都不表现出LX单倍型。在丹麦献血者中外显子1单倍型A、B、C和D的频率分别是0.76、0.135、0.020和0.085。这意谓着A/A、B/B、C/C和D/D基因型的频率将是它们的平方，即分别影响58.76％、1.82％、0.04％和0.72％的人群(数据来自Steffenson R.等，(2000)J Immunol Meth 24133-42)。
来自B/B、C/C和D/D基因型的人MBL的可能结构已经通过分析在中国仓鼠卵巢细胞中表达的相应的重组蛋白而确定了。这三种基因型的结果相似，并且以造成最常见的MBL的严重结构异常的B/B基因型为参照进行了描述。从这种基因型(称为MBL B)中分析未减少的MBL，表明两条链可能形成二聚体，三个这样的二聚体可能连接起来形成一个对应于来自A/A基因型(称为MBL A)的正常MBL的两个三联体“头”的结构。更高的寡聚体不能形成，并且MBL B，不论是重组的还是从人类供体制备的，与MASPs的结合强度都降低了，以至于在体外试验中不能激活补体。
A/B杂合子据信含有MBL A和B单链的混合物，它们以各种方式相结合。因为正常的MBL在六个三聚体头中含有最多18条单链，因此在A/B杂合子中这样的分子完全由正常的MBL A链组成的比率是非常低的。因此掺入理论上50％MBL B链的影响将破坏远多于一半的MBL寡聚体的结构，以至于根据MBL表现型来看B性状是显性的，即大部分MBL采取与MBL B相似的结构。同样的考虑也适用于A/C和A/D杂合子，尽管似乎D链的破坏效力可能比B链的稍低些。
现有的测量人MBL的方法依赖于在不同的免疫分析设计中使用针对MBL的多克隆和/或单克隆抗体。在许多情况下，并不清楚哪种MBL的分子形式更倾向于被这些方法测定。一种常用的方式依赖于在三明治ELISA(酶联免疫吸附分析)中使用针对纯化的人MBL的小鼠单克隆抗体HYB 131-01同时作为捕获抗体和检测抗体。在该方法中，HYB 131-01被包被在微滴定板的孔中，以便能够与人血清或血浆样品中的MBL结合。结合的MBL的量是样品中MBL浓度的函数。然后通过加入标记的HYB 131-01作为检测抗体对结合的MBL进行定量分析。标记可以是酶，例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶，它们在与适当的底物保温时能够产生定量的颜色反应，标记也可以是生物素，它能够与复合有适当的酶的亲和素或链亲和素结合，标记也可以是铕，它允许通过时间分辨荧光进行检测。
这些方法也依赖于两个同样的抗体分子(一个用于捕获，而另一个用于检测)与单一MBL分子的两个相同但分开的位点(表位)的结合。实际上，这只有在MBL分子是三聚体亚基的寡聚体时才会发生，因此只有MBL寡聚体才能被这些分析方法测量。单一或低寡聚化的MBL三聚体亚基不允许同时与捕获抗体和检测抗体结合。结果，这些方法不足以测量低寡聚化的MBL，也不能直接确定测量的MBL寡聚体是否真正能够结合甘露聚糖，而这是功能性MBL的一个限定特征。但是，与甘露聚糖的结合与MBL的寡聚状态具有非常强的相关性，因为还没有发现可影响CRD区的结构的基因变体。现有的测定血清或血浆MBL浓度的分析方法也不能确定记录到的低浓度MBL是由于象在LXPA/LXPA基因型中那样的低浓度的正常MBL A造成的，还是由于象在A/B、A/C、A/D、B/B、C/D和D/D基因型中那样的在分析中不充分反应的异常结构的MBL造成的。
希望能够区分血浆中MBL A的低浓度和事实上由于在杂合子中存在显著浓度的MBL B、C和D变体或其杂交形式造成的低的记录浓度。例如，已经报道MBL B与MBL A具有同样的细胞介导的细胞毒性、调理和促噬菌作用活性。因此，现有的分析方法不能检测MBL B，就不能反映出该MBL的这些功能。此外，使用现有免疫分析方法测量到的低的MBL血浆浓度，以及与这样的低浓度相关的启动子或外显子1等位基因形式，已经与儿童和免疫能力受损的病人中感染危险的增加相关联。它们也已经与慢性肉芽肿和囊性纤维变性中的疾病发展，以及自身免疫疾病，例如系统性红斑狼疮和风湿性关节炎的更严重的病程相关联。由于现有的分析方法只能够给出病人MBL状态的部分情况，因此人们预计，对该状态进行更差异化的分析可获得更精确的相关性。例如，尚不知道由于结构异常造成的低的MBL测量水平与由于LXPA/LXPA基因型造成的低的正常MBL水平是否具有不同的临床相关性。
发明概述本发明的一个目的是提供筛选针对MBL的单克隆抗体的方法，依据是它们与MBL的正常或异常形式结合或不结合的能力，而该MBL只要其结构允许就与甘露聚糖结合。
本发明的另一个目的是提供筛选针对MBL的单克隆抗体的方法，依据是它们与MBL的正常或异常形式结合或不结合的能力，而该MBL与同样或不同的针对MBL的单克隆抗体结合。
本发明的另一个目的是提供针对MBL的抗体，该抗体具有下列能力(a)与结合了甘露聚糖的MBL A结合或不结合；(b)与结合了甘露聚糖的结构异常的MBL结合或不结合；(c)与结合了同样或不同的针对MBL的单克隆抗体的MBL A结合或不结合；或(d)与结合了同样或不同的针对MBL的单克隆抗体的结构异常的MBL结合或不结合。
本发明的另一目的是提供体外方法和试剂盒，用于在样品中测定能够与甘露聚糖结合的MBL。
本发明的另一目的是提供体外方法和试剂盒，用于在样品中既测定正常寡聚化的MBL也测定异常的低寡聚化的MBL。
本发明的另一个目的是提供体外方法和试剂盒，用于在样品中同时测定能够与甘露聚糖结合的MBL以及正常寡聚化的MBL和异常的低寡聚化的MBL的总量。
通过测量人血浆或血清样品中能够与甘露聚糖结合的MBL，或者通过既能测量正常寡聚化的MBL又能测量异常的低寡聚化的MBL的方法测量人血浆或血清样品中的MBL，本发明的方法、试剂盒和抗体可用于诊断对传染病和自身免疫疾病的易感性增加和病情恶化。使用这些方法也将使采用旧方法发现的MBL缺陷被分类成是由于结构正常的MBL的缺陷还是由于结构异常的MBL的存在。
发明详述本发明提供了抗体、筛选抗体的方法以及在体外方法中使用抗体测量样品中结合甘露聚糖的凝集素(MBL)浓度的方法和试剂盒。使用本发明的抗体、方法和试剂盒，变体形式的MBL的存在可以与低浓度的正常MBL的存在区分开来。此外，可以独立于MBL的寡聚状态测量MBL的总量，并将其与能够结合甘露聚糖的寡聚化的MBL进行比较。
本发明的抗体、方法和试剂盒对于定量分析和表征样品中的MBL尤其有用，所述样品包括生物体液，特别是人血清和血浆。当使用这种分析方法来分析血浆样品中MBL与甘露聚糖结合的能力时，血液样品最好用肝素进行抗凝结化，而不是使用钙的螯合剂，例如柠檬酸或EDTA，这是因为MBL与甘露聚糖的结合依赖于游离的离子化的钙的存在。如果手边只有血浆抗凝结的钙螯合剂可用，就必须加入过量的钙盐以饱和螯合剂，从而在存在螯合剂的情况下确保生理浓度的游离的离子化的钙。
本发明的一个方面涉及筛选针对具有不同结合能力的MBL的单克隆抗体的方法。在该方法的一个实施方案中，针对MBL的单克隆抗体的筛选是基于单克隆抗体与结合了甘露聚糖的结构正常的MBL或MBL A结合或不结合的能力。在该实施方案中，单克隆抗体的筛选也可以基于它们与尽其所能与甘露聚糖结合的结构异常的MBL结合或不结合的能力。在该方法的另一个实施方案中，针对MBL的单克隆抗体的筛选是基于它们与结合了同样或不同的针对MBL的抗体的MBL A结合或不结合的能力。在该实施方案中，抗体的筛选也可以基于它们与结合了同样或不同的针对MBL的抗体的结构异常的MBL结合或不结合的能力。使用这些筛选方法，针对MBL的抗体被鉴定，它们具有下列能力1)与结合了甘露聚糖的MBL A结合或不结合；2)与结合了甘露聚糖的结构异常的MBL结合或不结合；3)与结合了同样或不同的针对MBL的单克隆抗体的MBL A结合或不结合；或4)与结合了同样或不同的针对MBL的单克隆抗体的结构异常的MBL结合或不结合。一种示例的结构异常的MBL是MBL B。结构正常和异常的MBL共同组成了总的免疫反应性MBL。
因此，本发明的另一个方面涉及针对MBL的抗体，它们具有下列能力与结合了甘露聚糖的结构正常的MBL或MBL A结合或不结合；与结合了甘露聚糖的结构异常的MBL结合或不结合；与结合了同样或不同的针对MBL的单克隆抗体的MBL A结合或不结合；或与结合了同样或不同的针对MBL的单克隆抗体的结构异常的MBL结合或不结合。
本发明的抗体如下所述进行制备和表征。
用作免疫原的人MBL从献血者的血浆中纯化。在纯化之前，根据HbsAg，抗HIV 1和2及HCV抗体对血液的每个部分进行筛选。MBL通过亲和层析在碳水化合物柱(Sepharose)上分离。使用生理pH下含有氯化钙的结合缓冲液冲洗柱子后，使用含有EDTA的无钙缓冲液洗脱MBL。用无钙的螯合钙的缓冲液在生理pH下进行洗脱是重要的，当用其它方法洗脱，例如使用非生理pH或修饰蛋白或水的结构的盐、溶质和溶剂时，也会洗脱能够与碳水化合物柱结合的抗体，例如IgM。洗脱物在Sepharose柱上进行分子大小层析，收集在空体积附近出现的蛋白峰。这个步骤除去了较低分子量的血清淀粉样蛋白A，其也表现出钙依赖性的与碳水化合物的结合。获得的产物通过超滤进行浓缩，通过还原和非还原状态的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析。
纯化的MBL被吸附到氢氧化铝凝胶上，并以25mg吸附蛋白的剂量通过腹膜内注射到BALB/c x CF2雌性小鼠中。用于监测免疫反应和制备单克隆抗体的技术按照本领域专业技术人员所熟知的技术进行，它们被描述在标准的参考书中，例如Harlow，E.和Lane，D.(1988；抗体实验室手册(AntibodiesA Laboratory Manual)。冷泉港实验室，纽约)。
在用纯化的人MBL包被的微孔中进行ELISA以筛选杂交瘤上清液。该筛选的结果是筛选到了由HYB 131-01b、HYB 131-10和HYB131-11编码的新的杂交瘤，分别带有同样编码的相应的小鼠单克隆抗体被进一步表征。
表征本发明的抗体包括与在以前描述的分析方法中使用的单克隆抗体HYB 131-01进行比较。比较表明，四种抗体HYB 131-01、HYB131-01b、HYB 131-10和HYB 131-11，每一个都结合到MBL分子上各自不同的非重叠表位上。因此，这些抗体中的一种与MBL的结合不会阻止其它三种抗体同时与同一个MBL结合。对这四种表位与MBL单体的碳水化合物结合位点之间的关系研究表明HYB 131-01的结合靠近该位点，干扰了MBL与甘露聚糖的结合。因此，与过量HYB 131-01抗体复合的MBL不能与甘露聚糖包被的微孔结合。相反，与过量的HYB 131-01b、HYB 131-10或HYB 131-11复合的MBL仍然能与甘露聚糖包被的微孔结合。因此从这些实验中可以得出结论HYB 131-01b、HYB 131-10或HYB 131-11抗体的表位不与碳水化合物结合位点重叠。但是，这些抗体与已经用胶原蛋白酶消化除去了胶原结构域和N-端结构域的MBL进行免疫杂交的反应，表明这些抗体象HYB131-01一样，结合的表位位于分子剩余的颈-加-CRD部分。
单克隆抗体针对基因型为A/A和B/B的献血者血清中的MBL A和MBL B的反应性分别被测试。在这些实验中，MBL B用作结构异常的MBL的例子。当MBL A和MBL B在用甘露聚糖以每毫升0.3微克的包被浓度包被的ELISA微孔中保温1小时时，与辣根过氧化物酶偶联的抗体HYB 131-01、HYB-01b、HYB-10和HYB-11与MBL A表现出大约相等的反应，但是与MBL B不表现出明显的反应。通过用每毫升5微克的甘露聚糖包被增加甘露聚糖包被物的密度，增加了每个抗体与MBL A结合产生的信号，表明更多的MBL A被结合到包被物上。此外，在不同的抗体与来自单一的A/A基因型献血者的MBLA和从健康的献血者的血清库中纯化的MBL的相对结合反应中产生了轻微的变化，表明后一种MBL是异源的，含有与不同密度的甘露聚糖包被物和/或不同抗体结合有轻微不同的形式。从来没有检测到抗体与MBL B结合。
因此推论，当MBL结合到甘露聚糖包被物上时，蛋白与其甘露聚糖结合的CRDs被保留，其方向使得没有被测试的抗体能够接近它们在结合的CRDs上的表位。只有带有足够数量的头以确保某些头结合到包被物上而其它的头在液相中自由摆动的寡聚化的MBL A，才能够通过它的自由头与抗体结合。四种测试的抗体与这些假定的自由头的反应性有少许区别。MBL B具有最多两个头或异常的单个头，其与甘露聚糖包被物结合的方式不允许任何抗体结合到CRDs上，因为在液相中没有可用的未结合的CRDs。MBL B与甘露聚糖包被的表面的结合也比MBL A的弱，而其它的实验表明为了获得有效的结合需要延长保温时间。这归结于下列事实MBL A与甘露聚糖包被的表面的结合被同样寡聚体的多个头与表面结合的协同作用所稳定，而MBL B的结合不受同样程度的结合协同作用影响。因此，极有可能随后分析程序中的清洗步骤实际上除去了任何与包被物结合的MBL B，使得这个分析程序对正常寡聚化的MBL高度特异。
四种抗体与MBL A和MBL B的反应性也以两两比较的方式进行测试。在这些分析中，每个纯化的抗体被用来包被微滴定孔。然后加入含有MBL A或MBL B的人血清稀释液，并测量其它三种抗体中每一种的纯化的标记的形式与结合的MBL的结合。在A/A基因型的单个献血者的血清中MBL A的浓度，根据以前描述的分析方法使用HYB131-01作为包被抗体和检测抗体，以收集的献血者血浆纯化的MBL作为重量测定的标准，测定为760ng/ml。所有这些分析都使用不含有钙的常规稀释缓冲液和清洗缓冲液进行。表1显示了用每种抗体组合获得的MBL A血清和MBL B血清的MBL浓度，以同样的标准进行比较。
表1、以ng/ml表示的MBL浓度，通过酶联免疫吸附分析(ELISA)，使用不同组合的包被抗体和检测抗体，在含有MBL A和MBL B的血清中分别测量。SD标准偏差；CV变异系数。
在下文中，包被/检测抗体的组合是指以这种次序，对每个抗体只使用参考号的最后部分；例如01/01b是指HYB 131-01用作包被抗体，而HYB 131-01b用作检测抗体。
获得的MBL A的表观浓度值的变化从01/01的760ng/ml(使用以前描述的分析方法)到11/01b的1100ng/ml。因此，使用不同的抗体组合，与收集的纯化的MBL标准相比，从该献血者中能够检测到比使用以前描述的分析方法测量到的多出高达45％的MBL A。在单个献血者的血浆和标准血浆中的MBL都不是同源的，因此在单个献血者的血浆中记录到的数值增加可能部分是由于该抗体组合与收集的标准相比反应性降低了。使用不同的检测抗体与同样的包被抗体组合和使用同样的包被抗体与不同的检测抗体组合获得的MBL A浓度的变异系数，表明HYB 131-01b作为包被抗体与MBL结合的方式使得用不同的抗体进行检测可以获得最小的偏差，而使用HYB 131-10作为检测抗体在检测与不同包被物结合的MBL中显示出最小的偏差。
HYB 131-10作为检测抗体对MBL被不同的包被物呈递的方式显示出很小的敏感性，其可靠性由在用不同浓度的甘露聚糖包被的微孔中测试来自不同基因型献血者的大量血清所证实。在四种检测抗体中，HYB 131-10对于与不同的甘露聚糖包被物结合的同种血清的MBL给出了最一致的结果。
MBL A浓度的最高平均值是使用HYB 131-11和HYB 131-10作为包被抗体，将用四种检测抗体获得的结果平均而获得的。这表明与HYB 131-01b和HYB 131-01相比，HYB 131-11和HYB 131-10对MBL有较高的亲和性。
当与同样的包被抗体结合的MBL A用不同的检测抗体测量时，记录到的MBL A的浓度表现出差别，这表明某些包被/检测抗体对以比其它抗体对更高的效率同时与MBL A结合。据推测，对于MBL A来说，这依赖于多种因素的组合。不同抗体保持其结合的MBL头的角度依赖于它们的表位在CRD上的位置，这影响了其它表位对它们相应的抗体的可接近程度。同时，单独抗体的亲和性可能影响结果。
检测抗体的联合在很大部分上依赖于它与摆向液相中未结合的MBL头的联合，结合包被物的头的表位由于结合了包被抗体而被封闭。但是，由于每个头有三个以径向对称排列的CRD区域，某些检测抗体与结合了包被物的头的结合仍然是可能的，只要正被讨论的表位的位置使得三联体的头通过这些相同表位中的一个或两个进行结合的角度允许检测抗体进入同一个头上的剩余的两个或一个表位。这种情况可能发生的程度由使用同样的抗体测量MBL B的浓度时所获得的结果显示，这时只有很少或没有头能够在液相中自由摆动。如表1所示，01/01组合和11/11组合都不能测量MBL B。因此，这些相同抗体的组合只能测量在液相中有未结合的头暴露给检测抗体的寡聚化的MBL。
01b/01b抗体组合对MBL A给出的总读数是840ng/ml。这可以分析如下从与液相中自由头的结合预期的读数是760ng/ml(01/01获得的读数，它不能与结合了包被物的头结合)；从与结合了包被物的头的结合预期的读数是90ng/ml(对MBL B使用01b/01b获得的读数)；总的预期读数是850ng/ml。预期读数(850ng/ml)与实际发现的读数(840ng/ml)之间的一致性相当好。
10/10抗体组合对MBL A给出的总读数是920ng/ml。这可以分析如下从与液相中自由头的结合预期的读数是760ng/ml(01/01获得的读数，它不能与结合了包被物的头结合)；从与结合了包被物的头的结合预期的读数是190ng/ml(对MBL B使用10/10获得的读数)；总的预期读数是950ng/ml。预期读数(950ng/ml)与实际发现的读数(920ng/ml)之间的一致性也相当好。
在两种情况下计算是粗略的，因为它们是基于这样的假设，即MBL B血清中MBL B的量与MBL A样品中结合了包被物的MBL A头的量具有可比性。但是，MBL B浓度的最高估算(这可能最接近于实际)是530ng/ml，530/760的比例可能距离MBL A样品中结合了包被物的头与总头的比例不远。如果有什么不同的话，它可能比这个比例稍高些。
假定不同的包被和检测抗体的组合对MBL A给出的读数是它们与非包被物结合的头的反应加上与结合了包被物的头的反应的函数，后一种反应依赖于检测抗体对它在这些头上的表位的可接近性。这将依赖于包被抗体的表位和检测抗体的表位的相对位置，它们之间角度的控制，以及径向对称的三联体头一旦通过包被抗体的一个或两个表位向下结合到包被物上时所述三联体头上检测抗体的表位的暴露情况。几何学上的因素决定了颠倒使用一对抗体将不会给出同样的结果，即11/01b给出的MBL A的读数为1100ng/ml，而01b/11给出的读数为870ng/ml。在这个方面另一个因素是，如果使用较高亲和性的抗体作为包被物，一般会获得较高的读数，因为在分析步骤中包被物以及它结合的MBL将比检测抗体经受更多的洗涤。
获得的MBL B的表观浓度值的变化从用01/01和以前描述的分析方法及11/11获得的0到用10/11获得的530ng/ml。MBL B具有正常的颈和CR结构域，因而对四种抗体表现出与MBL A同样的表位。但是，MBL B由单个MBL链的二聚体和六聚体组成，所述六聚体可组织成两个三联体头，这是在MBL B分子中发现的头的最大数量。据信MBL B被结合到包被抗体上时，所有的二联体和三联体CRD头都与包被物通过包被抗体的两个或三个同样表位中的至少一个表位保持接触。MBL头结合的角度依赖于CRD上正被讨论的表位的位置，这影响了其它表位对它们相应的检测抗体的可接近性，不论检测抗体与包被抗体相同还是不同。
因此在这个系统中MBL B的测量几乎完全依赖于包被和检测抗体表位的相对位置以及与包被物的结合对检测抗体表位暴露的影响。01/01和11/11的组合都不能测量MBL B。这表明HYB 131-01和HYB131-11抗体的表位在CRD上安置，以便二联体或三联体头与包被物中的抗体通过单一表位的结合将头保持在这样一种位置上，使得同一个抗体的另一个或两个表位被维持在不能接触到液相的位置上。由此推论，当二联体或三联体头中的CRDs以径向对称排列时，它们在CRD上的位置使得它们指向同样的方向。
01b/01b和10/10组合能够测量某些MBL B。这表明当CDRs在二联体或三联体头中排列时，这些抗体的表位在CRD上的位置安置使得它们指向不同的方向。01b/01b给出的读数为90ng/ml，而10/10给出的读数为190ng/ml，这个事实可能是由于HYB 131-10抗体具有较高的亲和性，和/或由于表位位置的影响，从而使得非包被物结合的HYB 131-10的表位更好地暴露到液相中。
不同抗体作为包被和检测抗体的组合都能够测量某些MBL B。据信这是由于下列事实四种不同的抗体都结合到CRD上的不重叠的表位上。因此，它们之间一定有一些角度，不同表位的相对位置和角度形成显示出是影响获得的读数的主要因素。几何学上的因素决定了颠倒使用一对抗体将不会给出同样的结果，即11/01b给出的MBL B的读数为80ng/ml，而01b/11给出的读数为210ng/ml。MBL B的最高读数(530ng/ml)是用10/11获得的，表明MBL B一旦结合到HYB131-10包被物上，HYB 131-11的表位就很好地暴露到该检测抗体前。在理论上，推测从一系列抗体对获得的MBL B浓度的最高读数将接近于重量测定的浓度，如果后者的测定是可能的话。
因此，10/11抗体的组合是测量MBL B的最适的抗体组合，类似地也是测量MBL C和D以及测量来自A/B、A/C和A/D杂合子的MBL的最适的抗体组合。这个组合对MBL A也给出了高的读数1040ng/ml，以至于它适合于用来测量病人样品中的总免疫反应性MBL。另一个可以用来测量总免疫反应性MBL浓度的组合是11/01。使用这个组合记录的不同MBL基因型献血者血浆的MBL浓度被显示在表2中，其中还将它们与01/01组合使用以前描述的分析方法获得的结果以及11/11组合获得的结果进行了比较。
表2显示出从11/01、01/01和11/11获得的读数对于所有的A/A基因型来说相当一致，不论这些基因型是否与启动子缺陷有关。对于A/B、A/D、B/B和B/D基因型来说，11/01比其它两种抗体组合测量到更多的MBL，而11/11组合给出了中间值，除了B/B基因型以外。应该注意到A/D基因型通常显示出只适度减少一些的MBL值，即使是使用以前描述的方法，这证实了以前的研究(Steffensen，R.等，同上)。尽管重组的MBL D与重组的MBL B相似，但D链表现出比B链更好地与A链结合形成一定比例的正常或接近正常结构的MBL的能力。
表2、不同MBL基因型献血者血浆的MBL浓度(ng/ml)，用不同的抗体组合测定。PD启动子缺陷(基因型)LX/LX或LX/LY。
钙的影响也被研究。上述使用不同抗体对的分析都是在稀释和清洗缓冲液中不存在钙的情况下进行的。糖与MBL的结合是钙依赖性的，钙本身结合到MBL的CRD上，改变了它的构象并参与糖结合的机制。因此对于依赖MBL与甘露聚糖包被物结合的MBL分析方法来说，使用含有钙的稀释和清洗缓冲液是必需的。在只依赖抗体与MBL的结合的MBL分析方法中钙是不需要的。但是，如果在依赖抗体与CRD结合的MBL分析方法中使用含有钙的缓冲液，由钙诱导的CRD中的构象变化可能修饰获得的结果。这可能以两种方式发生特定的单克隆抗体对它的表位的亲和性可能因为该表位中的构象变化而被改变，和/或CRD中的构象变化可能改变不同的单克隆抗体的表位之间的角度。这意谓着为测量结构异常的MBL而对最适的抗体对进行的选择将受到稀释和清洗缓冲液中钙的存在的影响。因此，在含有4mM氯化钙(这超过了钙离子的生理水平)的缓冲液中重复了不同抗体对的试验。从大量的结果获得的总的结论是，在存在钙的情况下，测量结构异常的MBL的最适抗体对是11/01，而不存在钙时的最适抗体对是10/11。
本发明的另一个方面涉及用于测量在样品中能够结合甘露聚糖的MBL或测量样品中所有正常的寡聚化的MBL和异常的低寡聚化的MBL的体外方法和试剂盒。这些方法可用于诊断对传染病和自身免疫疾病的易感性增加及这些疾病病情的恶化。
任何一种众所周知的免疫分析技术都可以用于本发明的方法。对于本发明的免疫分析来说，最好将样品中能够与甘露聚糖结合的MBL或总的免疫反应性MBL通过捕获分子，例如甘露聚糖或本发明的抗体，分别固定在固相上。然后可以将样品中能够与甘露聚糖结合的固定化的MBL或总的免疫反应性MBL通过本发明的带有可检测的标记的第二抗体进行检测。
在一个优选实施方案中，方法包括一个酶联免疫吸附分析(ELISA)，由ELISA分析试剂盒组成，所述试剂盒含有预先用甘露聚糖或选定的针对MBL的单克隆抗体包被的微滴定板孔，选定的针对MBL的单克隆抗体的溶液，该抗体带有可检测的标记，例如生物素或可检测的酶，例如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶，或铕，以便通过时间分辨的荧光发射检测，作为标准和对照的人MBL溶液，以及对所用的酶生色底物的溶液。在用生物素标记抗体的情况下，还提供与上述的酶偶联的链亲和素的溶液。此外还提供稀释和清洗缓冲液。
用于ELISA以及本领域专业技术人员所熟知的可检测的酶的例子包括但不限于，乙酰胆碱酯酶、碱性磷酸酶、甘油磷酸酶、天冬酰胺酶、β-半乳糖苷酶、β-V类固醇异构酶、过氧化氢酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、辣根过氧化物酶、苹果酸脱氢酶、核糖核酸酶、葡萄球菌核酸酶、磷酸丙糖异构酶、脲酶和酵母醇脱氢酶。
ELISA可以被用来测量结合甘露聚糖的MBL。为了测量结合甘露聚糖的MBL，ELISA板或孔条的微滴定孔预先用甘露聚糖作为捕获分子进行包被。在优选情况下，甘露聚糖从酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)制备，其以浓度范围为0.1μg/ml到5μg/ml，更优选为3μg/ml，在适当的包被缓冲液中使用，并且遵循本领域专业技术人员所熟知的步骤。在用含有常规组分的清洗缓冲液，例如含有非离子去污剂作为封闭剂和以可溶性钙盐的形式存在，浓度在0.5mM到5mM之间，但优选为4mM的离子钙的清洗缓冲液洗涤孔后，待分析的血清或用肝素抗凝结的血浆样品以及标准和对照，被加入到其对应的孔中，它们都用含有前述浓度范围内，但优选为4mM的离子钙的稀释缓冲液进行稀释(因为MBL与甘露聚糖的结合是钙依赖性的)。孔在室温保温一段时间，不超过1小时，然后洗涤。将已被可检测标记，例如生物素，标记的选定的本发明的单克隆抗体，例如HYB 131-10的稀释液加到每个孔中，保温不超过1小时。该抗体的合适的稀释度由经验确定，它的浓度可以在0.1μg/ml到2μg/ml的范围内。洗涤孔，使用众所周知的技术检测结合的抗体。例如，对于生物素标记的抗体来说，在每个孔中加入与辣根过氧化物酶偶联的链亲和素的溶液，保温不超过1小时。洗涤孔，向每个孔中加入生色底物的溶液，保温不超过30分钟。通过向每个孔中加入强酸抑制颜色生成，形成的颜色的光密度在读板机上读取。每个孔中与甘露聚糖结合的MBL的量通过将该孔的光密度与标准曲线进行比较而计算，标准曲线是根据含有标准品的孔的光密度读数绘制的，标准品来自纯化的MBL按重量制备。替代的检测方法包括但绝不限于，将抗体直接与酶或铕偶联，然后再采用上述的方案，正如本领域的专业技术人员所熟知的那样。
ELISA也可以用来测量总的免疫反应性MBL。为了测量总的免疫反应性MBL，ELISA板或孔条的微滴定孔预先用针对MBL的选定的单克隆抗体，例如HYB 131-10或类似的选定抗体作为捕获分子进行包被，其以浓度范围优选在0.1μg/ml到5μg/ml的范围内，更优选为3μg/ml，按照本领域专业技术人员所熟知的步骤在适当的包被缓冲液中使用。在用常规组成为本领域专业技术人员所熟知的并含有非离子去污剂作为封闭剂的清洗缓冲液洗涤孔后，待分析的血清或血浆样品以及标准和对照被加入到其对应的孔中，它们都稀释在常规组分的稀释缓冲液中。孔在室温保温一段时间，不超过1小时，然后洗涤。将已被可检测地标记，例如用生物素，标记的不同的单克隆抗体的稀释液加到每个孔中，保温不超过1小时，该抗体可以是HYB 131-11或按照类似的标准选择的其它抗体。该抗体的合适的稀释度由经验确定，它的浓度可以在0.1μg/ml到2μg/ml的范围内。洗涤孔，检测结合的抗体。对于生物素酰化的抗体来说，检测使用与过氧化物酶偶联的链亲和素的溶液，将其加入到每个孔中，保温不超过1小时。洗涤孔，向每个孔中加入生色底物的溶液，保温不超过30分钟。通过在每个孔中加入强酸抑制颜色生成，形成的颜色的光密度在读板机上读取。每个孔中能够同时与包被抗体和检测抗体结合的MBL的量通过将该孔的光密度与标准曲线进行比较而计算，标准曲线是根据含有标准品的孔的光密度读数绘制的，标准品来自纯化的MBL按照重量制备。此外，抗体可以直接与酶或铕偶联，并采用上述的方案按照其它众所周知的技术进行检测。
一种特别有用和方便的ELISA方法是将使用甘露聚糖作为捕获分子与甘露聚糖结合的MBL的分析方法同使用HYB 131-11作为捕获抗体的总免疫反应性MBL的分析方法相结合。在该方法中，一组ELISA孔用甘露聚糖如前所述预先进行包被，第二组用浓度在1μg/ml到5μg/ml之间的HYB 131-11按照本领域专业技术人员所熟知的步骤预先进行包被。然后在两组孔中平行地分析同样的血清或血浆样品稀释液，使用同样的稀释和清洗缓冲液和同样的试剂。这同时测量了同样的血清或血浆样品中正常的寡聚化的与甘露聚糖结合的MBL和总的MBL的免疫反应性。稀释缓冲液和清洗缓冲液都含有离子化的钙，浓度在0.5mM到5mM之间，但优选为4mM，缓冲液其它成分的选择使得不与钙形成沉淀或不干扰钙。在用含有非离子去污剂作为封闭剂的清洗缓冲液洗涤孔后，待分析的血清或血浆样品以及标准和对照被加入到其在三组中每一组的对应的孔中，它们稀释在含有钙的稀释缓冲液中。孔在室温保温一段时间，不超过1小时，然后洗涤。将已被可检测地标记，例如生物素，标记的单克隆抗体HYB 131-01，或按照前面描述的标准选择的另一抗体的稀释液加到每个孔中，保温不超过1小时。该抗体的合适的稀释度由经验确定，它的浓度可以在0.1μg/ml到2μg/ml的范围内。洗涤孔，检测结合的抗体。对于生物素酰化的抗体来说，检测使用与辣根过氧化物酶偶联的链亲和素的溶液，将其加入到每个孔中，保温不超过1小时。洗涤孔，向每个孔中加入生色底物的溶液，保温不超过30分钟。通过在每个孔中加入强酸抑制颜色生成，形成的颜色的光密度在读板机上读取。每个孔中最初加入的MBL的量通过将该孔的光密度与标准曲线进行比较而计算，标准曲线是根据同组中(用同样的捕获分子包被)含有标准品的孔的光密度读数绘制的，标准品来自纯化的MBL按照重量制备。此外，检测抗体可以直接与酶或铕偶联，并采用上述的方案按照其它众所周知的技术进行检测。该方法也可以与旧方法结合进行，使用另一组用HYB 131-01抗体包被的孔。将MBL的甘露聚糖结合和总免疫反应性分析相结合，不论是否与使用HYB 131-01的旧方法相结合，都提供了许多优点。
具体来说，MBL的甘露聚糖结合方法对于正常寡聚化的MBL具有高的选择性，给出的结果一般与旧方法相似。
此外，MBL的甘露聚糖结合方法不象旧方法，不容易受到可能在样品中存在的任何类风湿因子的干扰。在旧方法中，与免疫球蛋白结合的类风湿因子可以将包被抗体与检测抗体相交联，因此给出了假的高阳性读数，从而被解释成是由于MBL的存在。因为类风湿因子不结合甘露聚糖，这种情况不会在甘露聚糖结合分析方法中发生，因而更适合于测定患有自身免疫疾病，例如与类风湿因子的发展有关的类风湿关节炎的病人中正常寡聚化的MBL的水平。在保温培养基中加入免疫球蛋白或热处理的免疫球蛋白可以吸附掉一些类风湿因子，减少它们对基于捕获和检测抗体的分析方法的干扰。尽管这样的干扰可以由这种步骤减少，但是它不可能完全消除。为此，优选使用非免疫球蛋白的捕获分子。
此外，将MBL的甘露聚糖结合分析方法和/或旧方法的结果与MBL总免疫反应性分析方法的结果进行比较，显示出遗传缺陷的本质是用旧方法记录到的低血清或血浆MBL水平的主要原因。这种类型的比较图解在表2的第三(11/01)和第四(01/01，旧分析方法)列，该表将总免疫反应性分析方法的结果与旧分析方法的结果进行了比较。例如，用旧分析方法或甘露聚糖结合分析方法记录的高的水平(例如超过1100ng/ml)与总免疫反应性分析方法中同样的高水平相联系。这些受试者(表2中的供体1-4)具有结构正常的MBL A(A/A基因型)，没有启动子缺陷。具有用旧分析方法或甘露聚糖结合分析方法记录的较低的水平(例如低于1100ng/ml)的受试者在总免疫反应性分析方法中可能显示同样的低水平，或者高得多的水平。在总免疫反应性分析方法中同样的低水平(表2中的供体5和6)表明结构正常的MBL的浓度降低，即存在启动子缺陷的A/A基因型，它可以是LX/LX或LX/LY。在总免疫反应性分析方法中比在旧方法或甘露聚糖结合分析方法中的水平高得多，表明存在显著水平的结构异常的MBL。A/B杂合基因型(表2中的供体7和8)，其中B链的正常结构被高度破坏，一般来说与用旧方法或甘露聚糖结合分析方法记录时MBL水平大大低于1000ng/ml相关联。用总免疫反应性分析方法记录的值可能是3到7倍高。A/B杂合基因型(表2中的供体9)，其中据信D链的正常结构比B或C链破坏得少，通常与用旧方法或甘露聚糖结合分析方法记录时MBL水平低于1500ng/ml相关联。用总免疫反应性分析方法记录的值可能是2倍高。B/B、D/D和C/C纯合子和B/D、B/C和D/C杂合子只有结构异常的链，在表2中的例子是供体10-12。这些基因型在用旧方法记录时一般与MBL水平低于100ng/ml相关，但是用总免疫反应性分析方法记录的值可以是10到30倍高，但仍然低于1000ng/ml。
举例的ELISA分析方法的检测极限，在原始血浆或血清样品中，如果使用10倍的稀释倍数，是在0.5ng/ml的数量级，而通过适当增加样品的稀释倍数，工作范围的上限可以扩展到任何可能存在的浓度。
本领域的专业技术人员在阅读本发明内容后将会理解，用在上述ELISA方法中的原理可以按照众所周知的步骤进行常规的修饰，以用于其它的固相免疫分析方法。例如，在一个实施方案中，捕获分子或是甘露聚糖或是针对MBL的单克隆抗体，被包被在聚苯乙烯微球或微粒或磁性或顺磁性珠子上。在另一个实施方案中，捕获分子被包被在聚苯乙烯载玻片上。然后将样品加到包被的微粒、珠子或载玻片上，并使用本发明的抗体测量样品中能够与甘露聚糖结合的MBL或正常寡聚化的MBL和异常的低寡聚化的MBL。
此外，本领域的专业技术人员在阅读本发明内容后将会理解，用于其他目的分析物的其它捕获分子也可以包被在平板、微粒、珠子或载玻片上以自动化分析多种分析物。这样的分析物包括但不限于，先天免疫系统的其它成分，例如表面活性剂蛋白A和D，ficolin H、L和M，补体成分和因子，以及适应性免疫系统的成分，凝结和溶血系统的成分，以及实际上任何分析目的的血清或血浆成分。
其它使用本发明的抗体和本领域专业技术人员熟知的免疫分析技术包括但不限于，放射免疫分析、例如用铷标记抗体的磁分离和电化学发光测量、免疫沉淀、Western杂交分析(免疫印迹)、以及荧光激活的细胞分类(FACS)。免疫沉淀是本技术领域的标准方法，可以在例如Ausubel F.M.等《分子生物学现代方法(Current Protocols inMolecular Biology)》第二卷，第10.16.1-10.16.11页中发现，John Wiley& Sons出版公司1998年出版。Western杂交(免疫印迹)分析也是本技术领域的标准方法，可以在例如Ausubel F.M.等《分子生物学现代方法》第二卷，第10.8.1-10.8.21页中发现，John Wiley & Sons出版公司1997年出版。MBL的水平已经与传染病和自身免疫紊乱和疾病的易感性增加和病情恶化相关联。因此，本发明的方法、试剂盒和抗体，可以用来测量人血浆或血清样品中能够与甘露聚糖结合的MBL或正常寡聚化和异常的低寡聚化的MBL，在诊断对传染病和自身免疫疾病的易感性增加和病情恶化中是有用的。
权利要求
1.一种筛选针对MBL的单克隆抗体的方法，包括评估针对MBL的抗体结合或不结合与甘露聚糖结合的结构正常的MBL的能力，或其结合或不结合尽其所能与甘露聚糖结合的结构异常的MBL的能力。
2.一种筛选针对MBL的单克隆抗体的方法，包括评估针对MBL的抗体结合或不结合与该抗体或不同的针对MBL的单克隆抗体结合的结构正常的MBL的能力，或其结合或不结合与该抗体或不同的针对MBL的单克隆抗体结合的结构异常的MBL的能力。
3.一种针对MBL的抗体，该抗体选自具有下列能力的抗体(a)与结合了甘露聚糖的结构正常的MBL结合或不结合；(b)与结合了甘露聚糖的结构异常的MBL结合或不结合；(c)与结合了该抗体或不同的针对MBL的单克隆抗体的结构正常的MBL结合或不结合；或(d)与结合了该抗体或不同的针对MBL的单克隆抗体的结构异常的MBL结合或不结合。
4.利用权利要求3的抗体测量能够与甘露聚糖结合的MBL的免疫分析技术。
5.权利要求4的免疫分析技术，其中能够结合甘露聚糖的MBL通过捕获分子被固定化在固相上，该捕获分子能够在用抗体检测前捕获与甘露聚糖结合的MBL。
6.权利要求5中的免疫分析技术，其中用于其它分析物的一种或多种捕获分子被包被到固相上，以便检测样品中其它的分析物。
7.利用权利要求3的抗体能够测量样品中总的免疫反应性MBL的免疫分析技术。
8.权利要求7的免疫分析技术，其中结构正常和异常的MBL均通过捕获分子被固定化在固相上，该捕获分子能够在用抗体检测前捕获总的免疫反应性MBL。
9.权利要求8的免疫分析技术，其中用于其它分析物的一种或多种捕获分子被包被到固相上，以便检测样品中其它的分析物。
10.一种测量体液中能够与甘露聚糖结合的MBL的浓度的试剂盒，其含有权利要求3的抗体。
11.一种测量体液中结构正常和异常的MBL，一起称为总免疫反应性MBL的浓度的试剂盒，其含有权利要求3的不同抗体。
12.一种用于比较体液中能够与甘露聚糖结合的MBL的浓度和总免疫反应性MBL的浓度的试剂盒，该试剂盒含有权利要求3的不同抗体。
13.一种诊断传染病和自身免疫疾病的易感性增加和病情恶化的方法，包括使用权利要求3的抗体测量人血浆或血清样品中能够与甘露聚糖结合的MBL。
14.一种诊断传染病和自身免疫疾病的易感性增加和病情恶化的方法，包括既测量人血浆或血清样品中正常寡聚化的MBL又测量异常的低寡聚化的MBL。
15.一种阐明人血浆或血清样品中MBL的结构状态的方法，包括使用权利要求3的抗体测量人血浆或血清样品中能够与甘露聚糖结合的MBL和既测量人血浆或血清样品中正常寡聚化的MBL又测量异常的低寡聚化的MBL。
全文摘要
本发明提供了多种抗体，它们对与甘露聚糖或抗MBL抗体结合、结构上正常或异常的MBL具有不同的结合特性。此外还提供了筛选针对MBL、具有不同结合特性的抗体的方法，以及利用这些抗体测量能够与甘露聚糖结合的MBL或测量样品中正常寡聚化的MBL和异常的低寡聚化的MBL的方法和试剂盒。这些方法和试剂盒在对传染病和自身免疫疾病的易感性增加和病情恶化的诊断中是有用的。
文档编号G01N33/577GK1646916SQ03808667
公开日2005年7月27日 申请日期2003年4月16日 优先权日2002年4月18日
发明者拉尔斯·奥托·乌特恩塔尔 申请人:安蒂博迪肖普股份有限公司