专利名称：弯曲菌的聚糖和糖肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及如下领域，即具有生物活性的糖蛋白和糖蛋白的聚糖部分，和用于对抗弯曲菌属细菌的疫苗、抗体和抗体片段。
背景技术：
弯曲菌是一种重要的食物传染病原菌，存在于包括家禽在内的禽畜产品中。因此，需要提供对抗该病原菌在人体内的有害效应的策略。从禽畜体内消除这些病原菌可以作为一种减少人群感染率以及减少受感染的饲养动物发病的方法。糖基化的蛋白，特别是这些化合物的某些聚糖部分代表了免疫策略的可行靶，所述免疫策略是用于减少或消除这些生物体在禽畜中的存在，这样做是为了减少人们在食用或处理动物产品时受污染的危险，也能减少人们因源自禽畜肥料的细菌的粪便释放而受污染的危险。糖蛋白及其片段如聚糖部分也可提供针对弯曲菌感染的疫苗和抗体制剂的基础。
提供对研究蛋白质糖基化具有普适性的研究工具也是合乎需要的。蛋白质的糖基化曾经被认为是真核生物特有的现象，但是，现在已经清楚，在古细菌域和真细菌域，该现象都是普遍存在的(1、2)。已经在多种原核生物中鉴定出了N-型和O-型糖苷键，其中在古细菌中，很明显是N-连接的糖占优势，而在真细菌中，迄今为止所鉴定的糖蛋白中O-型连接单元占优势(1、2)。此外，与真核糖蛋白中所观察到的N-和O-连接相比，细菌中的这两种连接可与更广范围的糖一起形成连接。
本发明人发现，某些糖肽和聚糖部分形成了用以对抗弯曲菌属细菌中多种菌株的疫苗和抗体的有效基础，这是由于在多个菌株和种类中，所述糖肽和聚糖部分以不变的(或几乎不变的)形式广泛存在于这些细菌的表面上。这一聚糖还作为弯曲菌的多个表面糖蛋白的一个成分而存在，因而增强了其作为免疫靶的价值。
最近，在肠道病原体空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)中鉴定出了一个基因座位，其有可能参与了多种蛋白质的糖基化。这为革兰氏阴性细菌中广泛存在的蛋白质糖基化的途径提供了第一个证据(3)。这一座位被称为pgl(因参与蛋白质的糖基化而得名)，这一座位之内的基因的突变导致多种蛋白质的免疫原性丢失。还显示这些蛋白质的聚糖部分能被来自实验感染的人类志愿者的抗血清所识别(3)。通过pgl的突变使所述聚糖部分去除，在体外会导致粘附和侵入的降低，在体内会导致小鼠建群(mouse colonization)的丢失(4)，这间接表明蛋白质的糖基化影响这一生物体的毒力性质。
本发明人鉴定并表征了空肠弯曲菌菌株NCTC(国立典型培养物保藏中心)11168中的蛋白质的翻译后修饰，所述菌株的整个基因组序列已由Parkhill等人进行了描述(6)。在这些蛋白质中，能在2D凝胶(双向凝胶)上产生多个斑点的蛋白质是PEB3或称Cj0289c，其为空肠弯曲菌的一种主要的抗原蛋白，由Pei等人最先进行了描述(7)。当纯化之后并用1D SDS-PAGE(单向十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)进行分析时，会发现两条分子量相差约1500Da(道尔顿)的带，这两条带的N-末端序列都与真正的PEB3相一致。与我们对PEB3的观察相一致的是，Linton等人(8)使用GalNAc特异的凝集素即大豆凝集素，从空肠弯曲菌中鉴定出两个推定的糖蛋白，其中一个是PEB3，另一个是推定的周质蛋白Cj1670c，他们将该蛋白命名为CgpA。基于许多其它推定的糖蛋白与凝集素结合的能力，作者还观察到这些其它的推定糖蛋白，但是，没有鉴定这些蛋白质。而且，蛋白质与凝集素的结合也受pgl座位的基因的突变的影响。此外，我们已证明了基因pglB的突变特异地影响已鉴定的糖蛋白的糖基化，该基因pglB与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)中N-连接的寡糖基转移酶的STT3亚单位具有同源性，这种同源性间接表明了其在糖蛋白的生物合成中的作用(3、9)。
此外，碳水化合物参与所有生命域的各种功能。尽管总的来说，在细菌菌株和相关的菌种之间，糖蛋白及它们的抗原性表面聚糖中的聚糖部分存在着高度差异，但并非总是这样，这些例外提供了供基于抗体或疫苗的策略来清除细菌之用的合适的优秀候选物。特别地，弯曲菌糖蛋白的聚糖部分就是一个这样的碳水化合物。最近，我们致力于表征这种重要的食物传染病原体空肠弯曲菌的糖组(glycome)，结果我们阐明了所有表面聚糖的结构，即脂寡糖(LOS)、荚膜多糖(CPS)、N-连接的聚糖和O-连接的聚糖(5、12-15)。
本发明人证明，本说明书中描述的七糖至少在几种弯曲菌菌种中是普遍存在的，也在许多包括作为重要的人病原体和兽病原体的菌种的菌株中普遍存在，而且，所述七糖还是多种糖蛋白的成分，这些糖蛋白包括Cj编号为0114、0200c、0289c、0367c等的糖蛋白。这一聚糖部分还具有强烈的免疫原性，因此，这一聚糖(和相关的片段以及糖肽)在作为主动免疫用的疫苗用于对抗弯曲菌属的多种菌株和菌种时是优秀的候选物，并且，其也是用作适合以人体内的或动物体内的弯曲菌为靶的抗体或抗体片段的基础的优选候选物。
这里所使用的“禽畜(livestock)”包括哺乳动物和家禽。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种聚糖，该聚糖可以单独存在或与寡肽、氨基酸和/或免疫原性偶联物相连。
按照本发明的一个方面，本发明提供一种包含七糖的化合物，所述七糖具有下式I的结构GalNAc-α1，4-GalNAc-α1，4-[Glc-β1，3]GalNAc-α1，4-GalNAc-α1，4-GalNAc-α1，3-Bac，其中，Bac是2，4-二乙酰氨基-2，4，6-三脱氧-D-吡喃型葡萄糖。式I也包括上述化合物的具有免疫活性的片段。“免疫活性”是指这些片段可包含用于对抗弯曲菌的疫苗的活性成分，或者是指可以提供能特异地与所述化合物结合的抗体或抗体片段，并且这些抗体或抗体片段能中和施用了这些抗体或抗体片段的生物体内的弯曲菌。这些聚糖可以以分离的形式提供或者以与寡肽或氨基酸相连接的形式提供以形成新的糖肽。氨基酸可以包含天冬酰胺以形成N-连接的糖肽。这些聚糖或糖肽可以从革兰氏阴性细菌得到或从其分离和纯化而来。这一糖蛋白聚糖部分也可以提供如下文所讨论的治疗剂和方法的基础。
按照本发明的另外一个方面，本发明提供了检测细菌的糖蛋白的聚糖部分的方法，该方法包括对所述样品进行高分辨魔角旋转核磁共振(HR-MAS NMR)波谱分析。该方法可以从该聚糖部分的来源直接检测聚糖部分而不需要纯化蛋白质。
按照本发明的另一方面，本发明提供一种药物组合物，该药物组合物包含式I七糖和生理学上可接受的载体。优选所述药物组合物还可以包含具有免疫原性的偶联物，该偶联物与所述聚糖或糖肽或其片段和/或免疫刺激剂相连。这样的药物组合物可用作免疫人或动物的疫苗，以对抗由弯曲菌属病原体所引起的疾病。这些疾病例如胃肠感染、格-巴综合征(GBS)和米勒费歇尔(Miller Fisher)综合征、关节炎和菌血症。所述疫苗可以通过一次或一次以上的注射或通过其它医学上可接受的方法施用。
按照本发明的另一方面，本发明提供了与式I聚糖部分相互作用并特异性结合的抗体或抗原结合性抗体片段。当将这些抗体或片段施用给动物或人受者时，它们可以中和一种或一种以上的弯曲菌。这些抗体可以通过多种已知的方法得到，其中包括从先前已经用上述七糖或糖肽免疫过的动物的血清中分离得到，或者制备专门针对所述化合物的鼠单克隆抗体。另一方式是通过重组DNA(脱氧核糖核酸)技术，例如通过如下方式得到这些抗体或抗体片段，即克隆一组域抗体(domain antibody，“dAb”)基因库，该域抗体基因库是先从骆驼科动物(Camelid)中分离，然后在噬菌体库中表达而得到；淘选并在噬菌体中表达对七糖、糖肽或其片段有亲和力的dAb序列。优选的骆驼科动物选自双峰驼(Camelus bactriamus)、单峰驼(Camelus dromaderius)、羊驼(LamapPaccos)、驼羊(Lama ggGlama)和小羊驼(Lama vVicugna)。替换性地，另一方法可以包括筛选单链抗体片段(scFv)的噬菌体库。本发明还提供一种药物组合物，该药物组合物包含上述抗体或其抗原结合片段，以及生理学上可接受的载体。这样的药物组合物可以用作动物或人的治疗剂。
合适的抗体片段包括Fab片段(抗原结合片段)(尽管需要指出的是，既然骆驼科动物产生不含有轻链的独特类型的抗体，习惯术语如“Fab”可能需要修改)，所述Fab片段包括用上述技术或用其它常规技术单独制备，而不是直接从完整的抗体得来的片段。
按照本发明的另一方面，本发明提供了减少禽畜体内弯曲菌属细菌的存在的方法。所述方法包括给禽畜施用能与式I聚糖部分相互作用和结合的抗体或抗原结合性抗体片段。当以足够的量施用所述抗体时，所述抗体能中和来自动物体系的所有的或绝大部分的病原性弯曲菌生物体，或者能防止细菌的集落形成，从而能防止动物通过以下任一种方式感染人体食用或处理动物产品，或者经由动物废物污染。施用方法可以包括给禽畜、优选家禽喂食含有抗体或抗原结合片段的饲料或水。清除病原体或减少它们在禽畜体内的存在构成了一种防止病原体接触人体的方式，这样就可以预防人们患上由这些病原体所引起的疾病。因此，本发明还提供了一种用于防止由弯曲菌属病原体在人体内引起弯曲菌感染的方法，该方法包括通过给禽畜施用上述抗体或其抗原结合片段，来从禽畜体内清除病原体。
抗体或抗体片段可以被添加到动物饲料或水中，或者也可以替代性地以动物饲料植物经过遗传修饰的产物而存在，所述遗传修饰能使所述植物表达所述抗体或抗体片段。
另一方面，本发明提供了治疗人体或动物体内由弯曲菌属病原体所引起的疾病的方法，该方法包括给人体施用上述抗体或其抗原结合片段。上述抗体或其抗原结合片段可以用于制备药物以治疗动物或人体中由弯曲菌属病原体引起的疾病。
另一方面，本发明提供了防止地下水被弯曲菌属病原体污染的方法，所述弯曲菌属病原体污染的出现是禽畜的细菌的粪便释放以及之后粪便物进入水源的结果。所述方法包括通过给禽畜施用上述抗体或其抗原结合片段来清除或减少源自禽畜的这种病原体的存在。这也构成了一种防止病原体接触人体的方式，因而，就可以预防人们患上由这些病原体所引起的疾病。
本发明的抗体和抗体片段也可以用作诊断工具，以用来检测人体和动物体内弯曲菌的存在，以及检测采集自环境例如水的样品或肥料样品中弯曲菌的存在。
图1.PEB3的纯化和分析。a)甘氨酸提取物在MonoS柱上的阳离子交换色谱结果。含有PEB3的级分通过SDS-PAGE条带的N-末端测序鉴定、按照说明合并、透析和冷冻干燥。b)使用较窄的0-0.2M NaCl梯度用MonoS柱将合并的物质进行再分级。插图显示级分30和31的SDS-PAGE分析结果，这两个级分已经由SDS-PAGE条带的N-末端测序鉴定为含有PEB3的级分。
图2.对来自PEB3的阳离子交换色谱纯化的级分进行ESI-MS(电喷雾离子化-质谱)分析。a)在透析之后，图1中级分31的ESI-MS结果，以及从该谱得到的经过重建的分子质量分布图。b)在25,454和28,376Da处的峰被分别鉴定为PEB3和PEB4。需要进一步分析以鉴定26,861Da处的第三峰为糖基化的PEB3。c)从pglB突变体同样纯化得到的PEB3的ESI-MS结果和经过重建的质量分布图，d)显示缺少PEB3的糖基化形式。
图3.PEB3经胰蛋白酶消化的糖肽的MS/MS(串联质谱)分析。a)m/z(质荷比)1057.9的双质子化的糖肽离子的产物离子谱。谱中显示了由于寡糖残基的序列丢失而产生的碎片离子。插图显示了肽的序列。b)m/z 937.4的糖肽碎片离子的第二代产物离子谱。当糖肽进入质谱仪后，其就会因前端碰撞诱导的解离(锥孔电压＝100伏)被打成碎片。在m/z605.3处观察到b3+228碎片离子这一结果证实了该寡糖是N-连接的。
图4.SBA(大豆凝集素)的亲和色谱产物的2D(双向)凝胶分析。该蛋白质在2D-PAGE(双向-聚丙烯胺凝胶电泳)上在两个pH值范围内分离，a)pH4-7和b)pH6-11，然后进行银染色。由Cj编号标示这些斑点通过它们的胰蛋白酶消化产物的质谱分析来确定它们所代表的物质。已鉴定的蛋白质的全部清单如表I所示。
图5.对SBA的亲和色谱产物进行链霉蛋白酶消化，并对来自消化产物的糖肽进行纯化。a)链霉蛋白酶消化产物在200目BioGel P4上的体积排阻色谱。b)从P4得到的合并产物在BioGel P2精细级上的再分级。在上述两步分级中，通过质谱鉴定含有糖蛋白的级分，并且如短线所示按说明将其合并。c)由上述B得到的级分10的ESI-MS谱。在m/z 770.5处的双质子化的离子(MH22+)对应于与天冬酰胺(Asn)相连的七糖。也可以观察到许多较大的离子，这是由于附加了另一个氨基酸残基的结果。谱图上显示了主要的含有聚糖的离子的氨基酸组成。
图6.糖肽的结构和1H谱。a)糖肽的推测结构。b)在用P2柱(D2O，35℃，1mM氘化的EDTA(乙二胺四乙酸))进行最终纯化之后的谱图。标记了4.4至5.4ppm之间区域的端基异构糖的共振。
图7.对糖肽进行的1D(一维)选择性NMR(核磁共振)实验。a)一维TOCSY(全相关谱)(g1f2，15Hz(赫兹)，144ms(毫秒))，b)一维TOCSY(e1f1，25Hz，144ms)，c)一维TOCSY(d1，20Hz，144ms)，d)一维TOCSY(b6，50Hz，66ms)，其中，*是肽共振，e)一维TOCSY(b1c1，40Hz，151ms)，f)一维TOCSY(a1，25Hz，144ms)，g)一维NOESY(核欧沃豪斯效应相关谱)(g1f2，15Hz，400ms)，h)一维NOESY(f1，10Hz，400ms)，i)一维NOESY(e1，10Hz，400ms)，j)一维NOESY(d1，20Hz，400ms)，k)一维NOESY(b1c1，40Hz，400ms)，1)一维NOESY(a1，40Hz，400ms)。
图8.pgl座位和pglB突变体的表征。a)空肠弯曲菌NCTC 11168的常见蛋白质糖基化物座位的基因概图。灰色箭头表示那些与奈瑟氏球菌属(Neisseria spp)pgl座位的基因同源的基因。座位下面所示的pglB的突变是使用pEAp26构建的。b)至e)空肠弯曲菌野生型与同基因pglB突变体的双向凝胶分析。b)和d)分别为在对野生型和突变体进行免疫印迹之前所作的2D凝胶的胶体考马斯染色分析。c)和e)分别为用野生型和突变体的HS2血清型血清进行的蛋白质的免疫检测。箭头指示的是那些在凝胶的迁移和/或免疫反应性方面有差异的蛋白质，这些蛋白质被切割下来用作质谱指纹鉴定。由Cj编号显示这些斑点所代表的物质。左边显示的是以kDa(千道尔顿)表示的分子量蛋白质标记物的质量。
图9.在来自多种弯曲菌属菌株的HR-MAS质子NMR谱中检测N-连接的聚糖。该谱的上面显示的是N-连接的聚糖的结构。a)空肠弯曲菌NCTC11168中纯化的N-连接的聚糖的谱图，其显示了标记为a至g的端基异构共振。对如下菌种的全细胞进行使用10毫秒CPMG滤器(filter)的HR-MAS NMR波谱分析，b)空肠弯曲菌NCTC11168，c)空肠弯曲菌NCTC11168kpsM-，d)空肠弯曲菌HS19血清株，e)大肠弯曲菌(C.coli)HS30血清株，和f)空肠弯曲菌NCTC11168 pglB-。垂直的点线表示与a)的共振相比，b)至e)中的共同的共振。4.8ppm处的HOD共振达到了饱和并已被数字过滤。
图10.空肠弯曲菌HS19细胞和纯化的N-连接的聚糖的选择性NMR实验的比较。空肠弯曲菌HS19的HR-MAS谱为a)、c)、e)、g)，纯化的N-连接的聚糖的NMR谱为b)、d)、f)、h)。a)NOESY[a1，90Hz，250ms]。b)NOESY[a1，40Hz，400ms]。c)NOESY[b1c1，60Hz，250ms]。d)NOESY[b1c1，40Hz，400ms]。e)NOESY[d1e1f1，90Hz，250ms]。f)NOESY[d1，20Hz，400ms]和NOESY[e1f1，25Hz，400ms]的加和。g)TOCSY[g1f2，72Hz，47ms]。h)TOCSY[g1f2，15Hz，33ms]。
图11.给出了空肠弯曲菌NCTC11168中纯化的N-连接的聚糖的谱图以用于比较，其显示了标记为a至g的端基异构共振，并用垂直的点线表示共同的共振。
图12.在使用或不使用氯化钴的情况下进行高分辨魔角旋转NMR，以显示N-连接的Pgl聚糖的表面暴露情况。
具体实施例方式
实施例描述了本发明的聚糖部分的分离和鉴定。
通用的实验方法细菌菌株和质粒按常规方法在米勒海顿琼脂上培养空肠弯曲菌NCTC11168，其生长条件为37℃，微需氧条件(10％CO2、5％O2、85％N2)。大肠杆菌(E.coli)菌株DH10B(Invitrogen公司)用作克隆实验的宿主菌株，将所得的克隆物于37℃培养在Luria S-gal(Luria S-半乳糖)琼脂(Sigma公司)或MH(米勒海顿)琼脂上。需要的时候加入抗生素，使其达到如下所示的最终浓度卡那霉素30μg/mL和氨苄青霉素150μg/mL。质粒pPCR-Script Amp(Stratagene公司)用作克隆载体。
糖蛋白抽提物的制备将过夜培养的两块平板上的细胞重悬浮在10mL米勒海顿肉汤培养基中，并用来接种1升的MH培养基。将培养物在37℃、微需氧生长条件下以150rpm的转速振荡培养24小时。通过在10,000×g离心15分钟从12升培养基收集细菌细胞并立即将其冷冻在-75℃。将冷冻的细胞块置于0.2M甘氨酸盐酸缓冲液(pH2.2)中的冰上解冻(13)，然后，轻柔搅拌提取15分钟。在10,000×g条件下离心15分钟使提取物澄清，然后用纯水进行透析(Milli-Q系统，Millipore(密理博)公司)并冷冻干燥。
PEB3的纯化和分析如以前(7)所描述的那样，用阳离子交换色谱从甘氨酸提取物中纯化PEB3蛋白质，使其达到同质。在KTA ExplorerLC系统(Amersham Biosciences公司)上使用Pharmacia MonoS HR 5/5柱。监测柱洗脱物在280nm处的紫外吸收，通过在Mini Protean II平板凝胶(BioRad Laboratories)上进行SDS-PAGE分析(21)来检查各级分。按照LeGendre等人(22)所述将蛋白质从SDS凝胶上转移至ProBlotTMPVDF(聚偏二氟乙烯)膜(应用生物系统公司(Applied Biosystems Inc.))上，然后在491型Procise蛋白质测序系统(应用生物系统公司)上对单个蛋白质进行N-末端测序。
通过电喷雾离子化质谱确定所选择的各级分的蛋白质分子量分布图，所使用的仪器是Applied Biosystems公司的Sciex Q-Star混合四极杆飞行时间质谱仪。首先将各级分充分透析以除去盐类，然后调节至30％甲醇和0.2％的甲酸中。将溶液以1μL/分钟的流速注入，采集m/z600＞2000范围内的谱图。
经胰蛋白酶消化的肽的分析用修饰过的胰蛋白酶(普洛麦格(Promega)公司)将选定的各级分在50mM碳酸氢铵中于37℃下消化过夜，用毛细管液相色谱-串联质谱来分析，使用的仪器是与Q-TOF2混合四极杆飞行时间质谱仪(Micromass)相连的毛细管HPLC(高效液相色谱)系统(CapLC，Waters)。将大约250 ng的每种消化物注入0.3×150mm PepMap C18毛细管液相色谱柱(Dionex/LC-Packings)，通过梯度洗脱(在45分钟内，用5-90％乙腈，0.2％的甲酸洗脱)来分离。将质谱仪设定在自动串联质谱采样模式下进行操作，得到了两重、三重和四重电荷的离子的谱。
在4.6mm×250mm Jupiter C18液相色谱柱(Phenomenex公司)上对胰蛋白酶消化物进行更大规模的分离。然后，将含有糖肽的级分以1μL/分钟的流速注入Q-TOF2质谱仪的微电喷雾界面。在进行串联质谱分析之前，通过前端碰撞诱导的解离(锥孔电压从正常的40伏增加至100伏)将糖肽打成碎片。用这种方式产生的单电荷碎片离子的串联质谱碰撞偏移量是20-25伏(实验室参考坐标系)。为了进行采用Rademaker等人的方法(23)的β消除实验，将约一半含有糖肽的级分蒸干，并且溶解在25％的氢氧化铵水溶液中。将溶液放置在室温下过夜，再一次蒸发干燥，重新溶解在水中。然后，通过如上所述的注入—质谱检测所述溶液。
总糖蛋白的纯化和分析用SBA凝集素/琼脂糖(Sigma-Aldrich有限公司)亲和色谱从甘氨酸提取物中分离糖蛋白。将冷冻干燥的甘氨酸提取物重悬浮在PBS(100mM NaCl，50mM磷酸钠，pH7.5)中，然后使其经过预先用PBS平衡好的SBA/琼脂糖柱。用10倍柱体积的PBS洗柱，用含有0.1M GalNAc的PBS洗脱结合的糖蛋白。合并含有糖蛋白的级分，用Milli-Q水进行透析并冷冻干燥。
通过SDS-PAGE，在12.5％的均匀的聚丙烯酰胺凝胶上分离糖蛋白(21)。使用预制的IEF(等电聚焦)条带进行2D-PAGE，所述的等电聚焦条带包含固定的线性pH梯度pH3-10、pH4-7(伯乐公司(BioRadLaboratories))或pH6-11(安玛西亚生物科学(Amersham Biosciences))。按照生产商的说明书将蛋白质溶解在样品缓冲液中，利用等电聚焦在预制的等电聚焦条带上进行分离，然后在第二方向进行SDS-PAGE，第二方向电泳使用的是均匀的12.5％的平板凝胶，大小是20×20厘米。用Bio-Safe的胶体G-250考马斯蓝染色液(伯乐公司(BioRad Laboratories))对凝胶进行染色或进行银染(23)。为进行随后的凝集素探查，将所述凝胶电印迹至PVDF膜上，电印迹的条件是在含有10％甲醇的pH11的10mM 3-(环己氨)-1-丙烷磺酸缓冲液中，以50伏电印迹1小时。在Milli-Q水中洗膜，并在含有0.05％吐温20和2％封闭缓冲液(Roche MolecularBiochemicals(罗氏分子生化试剂公司))的Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)缓冲盐水(100mM NaCl，50mM Tris，pH7.5)中于室温下使膜封闭2小时。封闭之后，进一步用含有浓度为10μg/mL的SBA-碱性磷酸酶偶联物(EY Laboratories公司)的上述封闭溶液于室温下孵育印迹1小时。用含有0.05％吐温20的Tris盐水洗涤印迹3次，然后用氮蓝四唑氯化物(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(BCIP)使该印迹显色，显色缓冲液是0.1M NaCl，0.1M Tris，pH9.5，含有50mM MgCl2。
双向凝胶斑点的质谱分析将蛋白质斑点切下，然后用比例为1∶1的30mM的铁氰化钾和100mM的硫代硫酸钠进行脱色(24)。用去离子水充分冲洗凝胶斑点，用乙腈收缩，用含有Promega的经过修饰的胰蛋白酶(10ng/μL)的50mM碳酸氢铵重新溶胀，并且加入足够的50mM碳酸氢铵以覆盖凝胶片(通常为30μL)。将试管密封，并于37℃孵育过夜。除去消化液，并用50μL的5％乙酸，然后用50μL含有5％乙酸的50％甲醇水溶液抽提凝胶片。将提取物与消化液合并，并浓缩至大约10μL。
使用MALDI-LR(基质辅助激光解吸电离-低分辨)质谱仪(Micromass)对来自强蛋白质斑点的肽抽提物进行MALDI-TOFMS(基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱)质谱分析。将大约0.5μL的MALDI基质溶液(10mg/mL的α-氰基-4-羟基-肉桂酸溶于50％乙腈，0.2％TFA(三氟乙酸)中)沉积在目标板上，使其干燥。用C18ZipTipsTM(Millipore)柱对肽提取物进行脱盐，然后将肽提取物直接沉积在基质斑点上。进行MALDI-TOFMS谱的自动采样。使用肽标准物质作为外标，并使用胰蛋白酶自消化肽作为内标对谱图进行校正。使用Mascot DaemonTM(MatrixScience)，以批处理模式对空肠弯曲菌NCTC11168基因组序列数据库进行数据库检索。
使用Q-TOF2质谱仪对来自弱蛋白质斑点的提取物进行纳米液相色谱-串联质谱分析。将全部样品注入0.3×5mm C18微型预柱腔中(Dionex/LC-Packings)。肽保留在柱上而样品溶液被洗下成为废液。然后将捕获器(trap)与75μM×150mm的C18纳米系列柱(Dionex/LC-Packings)相连，用CapLC泵提供的梯度分离肽(15-75％乙腈，0.2％甲酸分离30分钟，流速约为300nL/min)。将质谱仪设定为以如上所述的自动模式来获取串联质谱图。如同MALDI-TOFMS分析所描述的那样进行数据库检索。
糖肽的制备将冷冻干燥的总糖蛋白(5mg)溶解在250μL含有2mM CaCl2的100mM Tris pH8.0溶液中，如以前所述(31)用链霉蛋白酶进行消化。将消化物于10,000×g微量离心15分钟，将所得上清液过BioGel P4，200目(BioRad Laboratories)柱(1×120cm)。使柱在水环境中运行，通过折射率监测柱洗脱物。在API 3000三级四极杆质谱仪(Applied Biosystems/Sciex)上通过ESIMS和先驱离子扫描质谱(m/z 204的HexNAc氧鎓离子的先驱离子)筛选各级分。将发出HexNAc离子特征的级分合并起来并冷冻干燥。通过1×120cm的BioGel P2精细级柱进一步纯化糖肽，如上所述监测并筛选各级分。
NMR谱使用Varian Inova 600MHz核磁共振仪利用标准的Varian软件获取所有的谱图。使用梯度为4mm的间接探测高分辨魔角旋转纳米核磁共振探头(Varian)，所述探头具有宽带去耦线圈。使样品以3KHz旋转，用干燥的氮气作为驱动气和载气。旋转速率不是计算机控制的，而是在设定值的上下10赫兹的范围内保持恒定。在25℃和35℃条件下将40μL D2O溶液中的样品记载下来以便产生更尖锐的峰。由于体积小，所以无法得知pH值。加入氘化的EDTA(乙二胺四乙酸，CDN Isotopes公司)以螯合金属离子并且使杆菌胺(bacillosamine)和氨基酸的峰变得更尖锐。尽管从P4柱获得的糖肽分离物包含一些氨基酸和糖杂质，所得的谱图仍具有足够高的质量，这使得在15mM的氘化EDTA存在下，糖肽能够进行完全的共振归属。由于存在着分离的糖肽因进一步纯化而导致体积减少的危险，所以要用这一样品继续进行许多NMR结构工作。通过对糖肽进行额外的NMR实验确认了所得到的结构，所述额外实验中的糖肽已经经过P2柱纯化、冷冻干燥并且溶解在含有1mM氘化的EDTA的40μL D2O中。在抑制4.78ppm(25℃)和4.67ppm(35℃)的HDO信号的条件下进行了实验。如以前所述(32)进行了二维实验(COSY(同核化学位移相关谱)、TOCSY、NOESY、HMQC(异核多量子相关)、HMBC(异核多键相关))的采样和处理。以外部丙酮为2.23ppm进行1H谱的定标。以外部丙酮的甲基共振为31.07ppm来进行13C的定标。表1中的1H和13C的化学位移是测量质子谱以及测量HMQC和HMBC谱中的C-H交叉峰得到的。如以前所述(25、26)，以30-151毫秒的不同自旋锁定时间进行一维TOCSY实验，并以400-800毫秒的不同混合时间进行一维NOESY实验。将选择性的实验描述为1D EXP(选定的自旋、选择性激发带宽、混合时间)，其中，EXP是指TOCSY或NOESY。
已表明，在RF(射频)和磁场均匀性都存在下，对液态样品使用魔角旋转(MAS)会显著地影响TOCSY实验中混合序列的性能，并且能使性能降低(27、28)。使用绝热的(WURST)混合序列可以消除这些影响(27、29)。对标准的二维TOCSY和一维TOCSY序列进行了修改，以使绝热的WURST-2(宽带、匀速且光滑切断)脉冲取代MLEV-17或DIPSI-2混合序列。绝热的(WURST-2)混合具有单一的绝热倒置脉冲长度TP＝1/MAS旋转速率，调制深度为8，绝热性(adiabicity)为2。典型地，对于WURST-2脉冲，扫描带宽是24kHz，Tp＝0.333ms(在MAS旋转速率为3000±10Hz时)，B1(最大)＝8.51kHz，B1(RMS(均方根))＝4.77kHz。
GC-MS(气相色谱一质谱)分析通过在气液色谱-质谱中表征丁-2-基糖苷，归属P2产物的Glc和GalNAc组分的对映异构体的构型(21)。使用惠普(Hewlett-Packard)色谱仪分析衍生物，所述色谱仪装配有30m的DB-17毛细管柱(以每分钟3.5℃的速度将温度从180℃升到260℃)，用Varian Saturn II质谱仪得到了电子碰撞模式的谱图。
pglB突变体的构建和表征为了构建pglB突变体，用PCR(聚合酶链反应)从空肠弯曲菌NCTC11168中扩增Cj112lc至Cj1126c基因，使用的引物为Cj1121cF(5’-ACTCACTATTGCCATTAAGATAAGC-3’)和Cj1126cR(5’-AAAACCCTTATTTAGTTTTGTTTGC-3’)。用Pfu聚合酶将PCR产物补齐，然后按照生产商的说明将其连接至pPCR-Script Amp(Stratagene)中。将连接混合物电转化进入电转化感受态的大肠杆菌DH10B细胞中，用氨苄青霉素在LB S-半乳糖琼脂(Sigma-Aldrich)平板上选择。将pILL600(37)的平末端卡那霉素抗性盒子插入到pglB上补平的XbaI限制性内切酶位点，产生了pEAp26。用测序的方法来确定所述盒子的插入方向，所用的引物为ckanB引物(5’-CCTGGGTTTCAAGCATTAG-3’)。用末端化学法和AmpliTaq循环测序试剂盒(Applied Biosystems)进行DNA测序，在Applied Biosystems的373 DNA测序仪上进行分析。将突变的质粒DNA电转化进入空肠弯曲菌NCTC11168(32)中，通过PCR对具有卡那霉素抗性的转化子进行表征，以确认引入的质粒DNA已经通过双交换事件整合进入所述转化子中。
用0.2M的pH2.2的甘氨酸溶液(10)从空肠弯曲菌的完整细胞提取蛋白质，然后用水进行透析。用2D-PAGE对样品进行分析，使用的是11cm的pH3-10的ReadyStrip IPG条带(BioRad Laboratories)和预制的12×8cm的8-16％梯度的标准平板凝胶(BioRad Laboratories)。用胶体考马斯蓝对凝胶进行染色，照相，然后通过水洗进行部分脱色。以207mA的电流持续1小时将蛋白质转移至PVDF膜上，使用的仪器是Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell(BioRad)。将膜封闭过夜之后，用1∶500稀释的HS2血清型的血清对膜进行检测，之后使用1∶5000稀释的山羊抗兔抗血清(Sigma-Aldrich)进行检测，用NBT/BCIP(RocheMolecular Biochemicals)进行显色。
检测弯曲菌属细胞的聚糖的实验程序细菌菌株和生长条件从人肠炎病例中分离得到空肠弯曲菌NCTC11168(HS2)(46)，随后，由Parkhill等人进行了测序(6)。从ATCC(美国典型微生物保藏中心)得到了空肠弯曲菌血清株HS1(ATCC 43429)、HS2(ATCC 43430)、HS3(ATCC 43431)、HS4(ATCC43432)、HS10(ATCC 43438)、HS19(ATCC 43446)、HS36(ATCC43456)和HS41(ATCC 43460)；从鹿特丹的Erasmus大学医学中心的Peggy Godschalk博士处得到了空肠弯曲菌HS23；从Health Canada得到了空肠弯曲菌OH4382和OH4384；以及从NCTC得到了大肠弯曲菌HS30(NCTC 12532)。按常规方法在米勒海顿琼脂(Difco)上培养所有的弯曲菌属菌株，其条件为37℃和微需氧。在含有30μg/mL卡那霉素的米勒海顿琼脂上培养空肠弯曲菌NCTC11168突变体。
位点特异性突变的构建和表征已有文章描述了空肠弯曲菌NCTC11168kpsM(12)和pglB(13)突变体的构建。
用于HR-MAS NMR的细胞的制备从一个琼脂平板上收集过夜培养的空肠弯曲菌(约1010个细胞)，将其悬浮在1mL用D2O配制的10mM钾盐缓冲盐水中(pH7)，其中含有10％(重量/体积)的叠氮化钠。将悬浮液在室温下孵育1小时，以杀死细菌。通过离心(7500×g离心两分钟)使细胞成团，再用D2O配制的含有10mM钾盐的缓冲盐水将细胞洗涤一次。加入20μL的D2O重悬细胞团粒，然后取40μL悬浮液放入转子中用于分析。
HR-MAS NMR谱用Varian Inova 600MHz核磁共振谱仪进行HR-MAS实验，该核磁共振谱仪装配有以前描述的Varian的纳米-NMR探头(12、13)。将40μL样品的谱以3KHz进行旋转，并在室温(21℃)下进行记录。在抑制4.8ppm处的HOD信号的条件下进行实验。用Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)脉冲序列[90-(τ-180-τ)n-采集](34)去掉来自脂质和固体类似物的宽线，得到了细菌细胞的质子谱。CPMG脉冲的总持续时间(n*2τ)是10ms，将τ设定为(1/MAS旋转速率)。如以前所述(25、35)，用30-150ms的不同自旋锁定时间进行一维选择性TOCSY实验，用100-400ms的混合时间进行选择性NOESY实验。为了在MAS条件下使用，对TOCSY序列进行了修改，用绝热的WURST-2脉冲(13)代替DIPSI-2混合序列。将选择性的实验描述为EXP[选定的自旋，选择性激发带宽，混合时间]，其中，EXP是指TOCSY或NOESY。典型地，可以使用256至1024瞬态(15分钟至1小时)获得细菌细胞的质子谱。对于N-连接的聚糖共振的选择性实验，TOCSY和NOESY的时间均在1至8小时之间变化，所述聚糖在细菌细胞中作为次要组分存在。
实施例实施例1 PEB3的纯化和表征通过肽质量指纹图谱，在甘氨酸提取物的双向凝胶中鉴定出PEB3蛋白(Cj0289c)，它是聚焦在pH值9-10范围内的一组斑点的一个组分(结果未显示)。用阳离子交换色谱从提取物中纯化出PEB3，随后使用较窄的NaCl梯度在同一色谱柱上进行再分级，结果得到出现在三个级分中的PEB3(图1)。SDS-PAGE分析显示有两个条带，将这两个条带转移至PVDF膜上，随后确定了它们的N-末端序列。经过10个循环的测序鉴定出较低质量的物质是PEB3，而较高质量的物质为更丰富的组分，其是具有少量对应于PEB4(Cj0596)序列的PEB3。
图2a)和b)显示了31号级分的质谱和经过重建的分子质量分布图。在重建的分子质量分布图中可以观察到三个峰。25,454Da和28,376Da的峰分别与PEB3(25,453Da，Cj0289c)和PEB4(28,377Da，Cj0596)的预期分子质量很好地吻合，都没有信号肽。为了鉴定质量为26,861Da的蛋白质，对该级分的胰蛋白酶消化产物进行了CapLC-MS/MS(毛细管液相色谱-串联质谱)分析。除了一个肽之外，鉴定出的所有的肽都可归属于PEB3或PEB4，这与N-末端序列的数据一致。未鉴定的离子经过串联质谱分析(图3a)，清楚地鉴定出它是一种糖肽。在该谱中可以观察到由顺序丢失的HexNAc(203Da)和单个Hex(162Da)组成的系列碎片。鉴定出经胰蛋白酶消化的肽是PEB3的68DFNVSK73。该糖肽寡糖部分的残基质量是1406Da，这与图2b所观察到的PEB3和未知蛋白质峰的分子量之差很好地吻合。因此，由此可见，该级分中的PEB3蛋白质有大约50％被由5个HexNAc、1个Hex和1个残基质量为228Da的罕见糖构成的单一寡糖所修饰。而且，MS/MS谱分析显示所述寡糖通过228Da的糖部分连接在所述肽上。
实施例2 糖肽键的表征与寡糖连接的PEB3的胰蛋白酶消化肽同时包含用于N-连接和O-连接的位点，即天冬酰胺(Asn)和丝氨酸(Ser)。因此，必须进行进一步的实验以确定所述连接的性质。此前，我们已使用β-消除从空肠弯曲菌81-176的鞭毛蛋白中去掉了O-连接的碳水化合物(5)。然而，这一方法却未能在本例中去除寡糖。这表明所述寡糖是N-连接的，这一结论是由我们第一次提出的。通过对m/z 937.0处的单质子化的碎片离子进行MS/MS分析确证了这一点，所述单质子化的碎片离子是由完整糖肽经前端碰撞诱导的解离产生的(图3b)。这一离子仅由胰蛋白酶消化肽外加所述罕见的228Da糖组成。在m/z 605.1处观察到一种离子，它仅能归属于b3碎片离子外加所述228Da的糖部分。没有观察到间接表明该碳水化合物与丝氨酸残基相连的碎片离子。所有的这些证据强烈暗示所述寡糖是与肽的Asn70相连的。有趣的是，所述肽包含真核生物N-连接的共有序列段Asn-Xaa-Ser。
实施例3 糖蛋白的分离和鉴定通过SBA(大豆凝集素)亲和色谱从湿重为40克的细胞的甘氨酸提取物中纯化推定的糖蛋白。通过280纳米处的紫外吸收度估算出推定的糖蛋白的产量为5毫克。对GalNAc洗脱物进行1D-和2D-PAGE(图4)，确保用这种方式纯化的蛋白质具有凝集素结合特性而不是非特异性的结合特征，用SBA/碱性磷酸酶偶联物进行了蛋白质印迹实验。1DSDS-PAGE后可以看到大约13种蛋白质，但是当用2D-PAGE分析产物之后，这一数目大大增加。通过质量指纹图谱和数据库检索鉴定了1DSDS-PAGE的各单独蛋白条带和2D-PAGE的蛋白质斑点(表I)。在这些鉴定的蛋白中有PEB3(Cj0829c)和以前由Linton等人(8)鉴定的CgpA(Cj1670c)。其pI(等电点)与Cj1670c等蛋白表现出的pI相同的这些斑点的垂直图样，很可能显示了不同程度的糖基化，这是由于检查它们的推测氨基酸序列，即由空肠弯曲菌NCTC11168(6)的全基因组序列获得的序列，揭示其中存在多个潜在的N-连接糖基化位点，所述位点包含序列段Asn-Xaa-Ser/Thr(表I)。实际上，用MS/MS分析含有Cj1670c的胶内消化提取物显示，其6个N-连接位点中的3个已被不同程度地占据(通过capLC-MS/MS检测了3个Cj1670c糖肽7TDQNITLVAPPEFQKEEVK25、77VLDVSVTIPEKNSSK91和92QESNSTANVEIPLQVAK108。也观察到了Cj0114的单个糖肽(71LSQVEENNQNIENNFTSEIQK91)和Cj0200c的单个糖肽(1DSLKLEGTIAQIYDNNK17)。而且，所有这些糖肽的聚糖组分的质量和组成似乎都与从PEB3观察得到的一样。
然而，由2D-PAGE鉴定的某些蛋白质，特别是Cj0147c、Cj0169、Cj0332c、Cj0334、Cj0638c、Cj1181c和Cj1534c，在它们的氨基酸序列中并不包含任何这些特异的序列段。这些蛋白质非共价地与SBA结合性蛋白结合或非特异性地结合在柱子上。这一结论由以下事实所支持，即在进行2D PAGE和电印迹实验后，这些蛋白质斑点不能与SBA/碱性磷酸酶偶联物反应(表I)。
实施例4 糖肽的制备将混合的糖蛋白样品进行两轮链霉蛋白酶消化，所得产物在BioGelP4柱上通过凝胶过滤进行分离(图5a)。通过质谱对包含碳水化合物的级分进行定位，并在进行了NMR研究(见下文)之后，将样品通过BioGelP2进行再纯化(图5b)。最终纯化的样品主要由与单个Asn连接的寡糖组成(图5c)。没有证据显示聚糖组分中的任何变化。据估计，糖肽的产量大约在200微克。
实施例5 分离的七糖的制备实施例4中鉴定出的七糖部分(式I)可以通过已知的方法分离得到。例如，可以使用本领域熟知的酶解或化学水解方法从实施例4制备的寡肽中裂解得到氨基酸部分(Asn)。可以注意到，尽管本发明人没有进行上述步骤，但可以用这一步骤来分离该七糖是显而易见的。该七糖也可以直接从糖蛋白得到，而不用经过任何糖肽。这一裂解也可以用酶解或化学水解进行。例如，Patel等(41)就介绍了肼在这一裂解中的用途。
实施例6 NMR谱使用选择性的方法，可以用不纯的P4样品进行实验。为了避免在进一步纯化过程中损失糖肽，用所述不纯的样品进行糖部分的完全共振归属。使用P2柱进行再次纯化之后，通过测量P4和P2纯化的样品的S/N(信/噪)比，判断出25％的糖肽丢失了。重新对P2纯化的样品进行了HMQC实验以确证使用P4纯化的样品所得到的归属。从质谱结果可以看出，所述糖肽由5个HexNAc残基、1个Hex残基和1个质量为228 Da的未知糖组成。使用化学分析方法确定了所述HexNAc和Hex残基的绝对构型是 1H和13C NMR数据分析表明存在8个端基异构的质子，已按字母顺序进行标记(图6)。为进行质子归属，进行了一系列的1D TOCSY以用于端基异构共振分析(图7)。在每一个残基之内，使用不同的混合时间来归属旋转。然后，使用HMQC和HMBC来归属13C共振。NMR归属结果如表II所示。用1D NOESY实验(图7)得到如图(图6)所示的序列。
残基g被归属为β Glcp。对于g1的1D TOCSY，所用的混合时间为144ms(图7a)，检测到了直至H6和H6’共振的所有旋转，这表现出为β-吡喃型葡萄糖特有的大JH，H耦合。g1共振与f2还有重叠，这就使得可以检测到f1至f4的共振。由于C2至C6的13C和1H化学位移与β 吡喃型葡萄糖的13C和1H化学位移相似(36)，所以残基g为末端。
鉴定出5种残基(a、c、d、e和f)，都是α GalpNAc。3.6±0.2Hz的J1，2值、强烈的H1-H2 NOE(图7)以及包括与H4的弱耦合的JH，H耦合谱图(图7)，显示这些单元具有α 吡喃型半乳糖基构型。尽管e1和f1端基异构共振可以被10Hz的窄带宽选择性激发，但在图7b中显示了e1和f1的同时激发谱。对g1f2进行的1D TOCSY，还检测到f2至f4的共振(图7a)。在51ppm附近的C2化学位移显示了乙酰氨基。使用(C2，H4)HMBC相关性对5个GalNAc残基的C2共振进行归属。使用1D TOCSY-NOESY(H1，H4)来检测H4和H5间的NOE，由此归属了H5共振(25)。然后使用针对H5共振的1D-TOCSY检测各H6的共振(未显示)。对P2纯化的样品进行整合(图6b)显示7个NAc基团，其中的5个与5个GalNAc残基对应。将CalNAc单元的13C化学位移与α GalpNAc的13C化学位移进行比较，显示残基a、c、e、f在O-4处相连，这是由于C4向低场偏移(37)。残基f在O-3处具有分枝点，这是由C3的向低场偏移确定的。由于C2至C6的13C化学位移与α GalpNAc的13C化学位移(37)相似，残基d为末端。
将残基b归属为β 杆菌胺(2，4-二乙酰氨基-2，4，6-三脱氧-β 吡喃型葡萄糖)。对于残基b和c，端基异构共振部分地重叠。对于b1和c1共振的1D TOCSY，混合时间为144ms(图7e)，可以鉴定到高至1.14ppm处的CH3共振(b6)的宽共振。对于在1.14ppm处的b6的1D TOCSY，混合时间为66ms(图7d)，观察到直至b4的峰。进行一系列从30ms至144ms的不同混合时间的1D TOCSY，以对这些峰进行归属。对于残基b，这些宽峰没有提供耦合常数。然而，对于混合时间为144ms的b1的1D TOCSY，可以观察到直至H6的共振，这与β-Glcp(残基g)的H1的1D TOCSY相似。因此，这样的有效的转移是为β-吡喃型葡萄糖基构型所特有的长程耦合常数。图7k中观察到的b1-b3和b1-b5 NOE也是β端基异构构型的典型表现。在55和58ppm的C2和C4的化学位移为乙酰氨基的信号，这与结构(图6a)中出现7个NAc基团相吻合。在79ppm的C1化学位移和在5.1ppm的H1表明了N-连接的端基异构，这与β-GlcNAc-Asn(20)中发现的相似。对残基b的化学位移与其它结构中发现的2，4-氨基-2，4，6-三脱氧-β 吡喃型葡萄糖的化学位移进行比较，显示Bac在O-3处相连，O-3为唯一可能的糖基化位点(38-40)。
如以前对于含有杆菌胺的其它结构的描述一样(38)，通过NOE获得残基b的绝对构型。在1.14ppm的CH3共振(b6)和在1.95ppm的NAc之间观察到强烈的NOE，这是由于位于C6的CH3基团与位于C4的NAc-CH3基团紧密邻近。因为，位于1.95ppm的NAc共振已与其它NAc共振分离，所以其可被选择性激发。在这个NAc共振与残基a的α GalpNAc H1共振之间，观察到强烈的NOE，这是由于如下显示的α(1-3)b连接。只有当残基b具有 构型，其中位于残基b的C4的NAc基团与残基a的末端异构质子紧密邻近(3)时，才出现这种NOE。如果残基b具有 构型，不可能出现这种NOE，因为H1a/4b-NAc质子间距离大于5。
通过1D NOESY实验确定了序列(图7)。强烈的c1-f4 NOE和较弱的c1-f6和c1-f6’NOE确定了c(1-4)f连接。强烈的d1-c4 NOE和较弱的d1-c6’显示d(1-4)c序列。e1-a4、f1-e4和g1-f3确定e(1-4)a、f(1-4)e和g(1-3)f连接。a1-b3 NOE(图7I)确定a-b序列。结构如图6a所示。这个序列与针对成键碳观察到的糖基化位移相吻合(见上)。
实施例7 pglB突变体的表征通过盒式诱变构建了pglB突变体(图8)。用HS2血清型血清进行的双向PAGE和蛋白质印迹实验证实了突变体细胞的甘氨酸提取物在蛋白质免疫反应性方面的显著变化(图8b、e)。有几种蛋白在双向凝胶上的迁移性和/或免疫反应性发生了变化，对这几种蛋白通过质量指纹分析进行了鉴定(表I)。蛋白质的鉴定结果与SBA凝集素亲和色谱的结果一致，这为与GalNAc凝集素反应的蛋白质是由Pgl途径进行糖基化的这一结论提供了进一步证据。由于是用全部甘氨酸提取物进行的实验，并且实验是在不同的pH值范围内进行的，即图4和图8不能直接进行比较，所以在这一实验中不能观察到全部的SBA反应性的蛋白质。此外，通过如上所述的离子交换色谱从pglB突变体中纯化了PEB3，质谱分析表明所述蛋白质完全缺乏聚糖(图2c、d)。
为了证实pglB突变只影响糖蛋白的糖基化，对该突变体的脂寡糖和荚膜多糖进行了分析。对蛋白酶K消化物进行了脱氧胆酸盐-PAGE和质谱分析，结果显示突变体LOS(脂寡糖)核心的质量和野生型LOS核心的质量一样(结果未显示)。此外，在脱氧胆酸盐-PAGE实验中，在野生型细胞和等基因突变体细胞的提取物中可以看见相同的荚膜重复。为进一步证实荚膜没有变化，我们用HR-MAS NMR检查了多糖。与野生型的谱图相比，突变体的谱图没有变化(结果未显示)。
实施例8 通过HR-MAS NMR检测全细胞的N-连接的聚糖在完整的弯曲菌属细胞的HR-MAS NMR谱(图9)中，检测到一系列共同的1H共振。此前，我们使用MS和纳米NMR技术确定了空肠弯曲菌NCTC11168的N-连接聚糖的结构是七糖(13)。正如可在空肠弯曲菌NCTC11168、NCTC11168kpsM-、空肠弯曲菌HS19和大肠弯曲菌HS30的HR-MAS谱所观察到的那样，观察到与纯化的N-连接聚糖的端基异构共振相匹配的端基异构共振，这暗示这一聚糖是所有菌株中共有的(图9)。在NCTC11168的谱中(图9b)，与N-连接聚糖相对应的共振弱于来自CPS的共振和一些重叠的端基异构共振。然而，当在NCTC11168kpsM突变体中除去荚膜共振时，能够很清楚地区分它们(图9c)。通过检查消除蛋白质糖基化物的NCTC11168 pglB突变体的谱，可以进一步证实所述共有的聚糖共振归属于N-连接的聚糖(3、13)。如同所预料的那样，不能在这一突变体的NMR谱中观察到N-连接聚糖的共振(图9f)。
使用选择性的TOCSY和NOESY实验(图10)，进一步确证推断的共有聚糖的特性。由于能清楚地观察到N-连接聚糖的端基异构体共振，使用空肠弯曲菌HS19细胞进行实验。标准的选择性NOESY实验是从HS19中的a1共振的选择性发射开始的，该实验与4.21ppm处的共振建立了相关性(图10a)。该共振与针对纯化的糖肽中的a1共振进行的NOESY谱中观察到的a2共振具有相同的化学位移(图10b)。在HS19和纯化的N-连接聚糖之间就其它的端基异构共振的NOE图谱进行比较，该比较结果清楚地显示了在这两套实验之间的相似匹配(图10c-f)。由于NOE实验揭示残基内和残基间的相关性，这一匹配性暗示共有聚糖的序列与此前报道的纯化的N-连接聚糖的序列(13)是一样的。选择性的TOCSY实验用4.5ppm处的g1和f2的重叠共振的发射来进行，结果产生了与g2和f3共振相对应的交叉峰(图10g)。它们的多重态形状和化学位移与在纯化的N-连接的聚糖的相应实验中所观察的相匹配(图10h)。由于较强的CPS共振的部分激发，也能观察到其它的共振。因此，对细菌细胞进行选择性激发实验确定了所述的共有的N-连接聚糖的原位性质。
图11显示在各种弯曲菌的HR-MAS质子NMR谱中检测N-连接聚糖。在该谱的上面显示N-连接聚糖的结构。为了进行比较，显示空肠弯曲菌NCTC11168中的纯化的N-连接的聚糖的谱图，其中显示的端基异构共振被标记为a至g，并用垂直的点线表示共有的共振。显示了以下菌株的全细胞的采用10ms的CPMG滤器的HR-MAS NMR谱，所述菌株为大肠弯曲菌HS30(NCTC 12532，分离自布鲁塞尔的猪)、大肠弯曲菌423(分离自阿尔伯达的小鸡)和性病胚胎弯曲菌生物型A(C.fetus ssp.Venerealis Biotype A)(NCTC 10354，分离自母牛的阴道粘液)。4.8ppm处的HOD共振达到饱和并已被数字过滤。
图12为在使用或不使用氯化钴的条件下进行高分辨魔角旋转NMR，来显示N-连接的Pgl聚糖的表面暴露情况。每对谱的上部谱图是来自添加了氯化钴(CoCl2)的样品。它们都经过同样的处理。应当注意的是，在每对谱中，上部谱的信噪比(S/N)比下部谱的信噪比低得多。由于利用有效的T2滤器获得所述的谱，因此被CoCl2变宽的谱线会变得较弱。注意到对于kspM突变体，位于3.15ppm附近的峰与位于3ppm附近的峰相比，显示非常不同的相对强度。位于3.15ppm附近的峰在使用或不使用CoCl2时的绝对S/N大致相同，而位于3ppm附近的峰在在使用或不使用CoCl2时的绝对S/N差异非常大。这表明位于3.15ppm附近的峰很可能是由内部组分形成，而与CoCl2无关。因此，外部残基的强度显著降低。对于HS19而言，可以观察到，有关3.15ppm峰与3ppm的峰的相对关系具有与上述相同的结果。此外，在CoCl2存在时，位于约2.7ppm和约2.85ppm处的天冬氨酸峰(参见Szymanski等人，JBC，2003)消失了，这证实了暴露于外表面或接触介质的残基变宽了。由于在CoCl2存在时，N-连接的Pgl聚糖共振(参见Szymanski等人，JBC，2003和图9)基本消失了，这表明它们也位于细胞的表面。
抗体和疫苗的制备和施用可以通过常规方法制备与本发明的聚糖部分特异性结合的抗体或其抗原结合片段。例如，可以针对式I的聚糖(包括片段)制备鼠单克隆抗体，所述式I的聚糖与寡肽或氨基酸或具有免疫原性的偶联物选择性键合。另一种策略是淘选来自骆驼科动物淋巴细胞并能够表达dAb抗体片段的先前存在的克隆基因库，以鉴定和分离能表达具有免疫原性的片段的基因，所述免疫原性是针对所选定抗原的免疫原性。可以在经过修饰的含有这种基因的噬菌体库中表达按照上述策略分离的基因。这样的抗原可以包含如上所述的七糖或所述七糖的片段，这些七糖或七糖的片段按照如上所述与氨基酸、寡肽或其它偶联物选择性键合。在授予Casterman等人的美国专利号5,759,808中描述了这种方法。另一种策略是将用于表达所述选定的抗体或片段的基因整合入适当植物的基因组中，然后这种植物可作为禽畜饲料来源。随后这样的植物就表达抗体或抗体片段，当禽畜食用这种植物时，该植物就会将适当剂量的抗体或片段递送给动物。
因此，可以看到存在许多方法来产生与本发明的聚糖特异性结合的抗体或片段。所述抗体片段可以独立制备或产生，而与整个抗体无关。
也可以由传统方法制备抗体，即由动物血清分离所述抗体，所述动物是已经施用了适当剂量的在上述实施例中鉴定的抗原的动物。例如，在授予Casterman等人的美国专利号5,759,808中描述了这种方法。该参考文献描述了使用骆驼科动物来产生不含有轻链的独特型抗体。
上述的抗体或片段可以采用被动免疫的形式与合适的载体一起施用给人或禽畜。当施用给诸如禽类的禽畜时，优选的方法是以饲料或饮用水来提供抗体或片段，方式可以是以浓缩液混入或提供经过修饰后可表达抗体或抗体片段的植物产物。当单独提供抗体或片段时，可以在使用前将抗体或片段作为浓缩液与适当的载体一起提供，以用于与饲料或饮用品混合。
这种施用给禽畜的抗体或片段会对抗该禽畜中弯曲菌的存在，由此防止禽畜将病原体传播给食用或处理动物产品的人类，以及如上所述防止地下水被动物排泄物污染。
还可以将这些抗体和片段用于通过常规方法诊断人类或动物中弯曲菌属细菌的存在。此外，可以将它们用作分析组分，以确定诸如水、土壤或肥料等样品中是否存在弯曲菌。
还可以将与氨基酸、寡肽或其它合适的偶联物选择性键合的所述七糖或片段与合适的佐剂和免疫刺激剂结合以作为疫苗施用。为此，采用常规方式施用单个或一个以上的合适剂量。
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本文使用的缩写如下Bac，杆菌胺(bacillosamine)、2，4-二乙酰氨基-2，4，6-三脱氧 吡喃型葡萄糖；capLC-MS/MS，毛细管液相色谱-串联质谱；CE，毛细管电泳；CPMG，Carr-Purcell-Meiboom-Gill；CPS，荚膜多糖；COSY，相关波谱学；DIPSI-2，在存在标量相互作用(scalar interaction)下的去耦；ESI-MS，电喷雾离子化质谱；GBS，格-巴综合征；HMBC，异核多键相关；HMQC，异核多量子相关；
HR-MAS，高分辨魔角旋转；LOS，脂寡糖；LPS，脂多糖；MALDI-TOFMS，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱；MAS，魔角旋转；MLEV-17，马尔科姆莱维特氏(Malcolm Levitt′s)去耦循环；MS，质谱；MS/MS，串联质谱；NOESY，核欧沃豪斯效应波谱学；PVDF，聚偏二氟乙烯；SBA，大豆凝集素；TOCSY，全相关谱学；和WURST-2，宽带、匀速且平滑的切断。
表I对双向凝胶上的蛋白质进行鉴定
aSAsn-Xaa-Ser序列段；TAsn-Xaa-Thr序列段。
b在双向凝胶的蛋白质印迹中与SBA的反应性。
c在pglB突变体中，在双向凝胶中的斑点位置变化的和/或免疫反应性变化的蛋白。Cj1018c和Cj1643不是由SBA色谱分离得到的。
d由CapLC-MS/MS观察到的糖肽。
e从一维凝胶上鉴定得到的。
表II空肠弯曲菌的天冬酰胺连接的糖肽的化学位移(ppm)。
在35℃，于D2O中在600MHz(1H)测定，此时HOD在4.67ppm。外部乙酮的甲基共振在dH2.23ppm和dC31.07pppm处。dC处的误差为±0.2ppm，dH处的误差为±0.02ppm。7个NAc共振为dH2.07、2.05、2.04、2.03、2.02、2.02和1.95ppm。NAc-CH3的dC在23.1-23.4ppm。NAc-CO的dC在175-176ppm。
权利要求
1.一种化合物，该化合物包含下式GalNAc-α1，4-GalNAc-α1，4-[Glc-β1，3]GalNAc-α1，4-GalNAc-α1，4-GalNAc-α1，3-Bac的七糖或其具有免疫活性的片段，其中，Bac为2，4-二乙酰氨基-2，4，6-三脱氧-D-吡喃型葡萄糖。
2.如权利要求1所述的化合物，该化合物与氨基酸或寡肽相连。
3.如权利要求2所述的化合物，其中，所述氨基酸是天冬酰胺。
4.如权利要求1、2或3任一项所述的化合物，该化合物来自糖蛋白，该糖蛋白从弯曲菌属细菌中分离并纯化得到。
5.如权利要求4所述的化合物，其中，所述细菌选自空肠弯曲菌(C.jejuni)、大肠弯曲菌(C.coli)或性病胚胎弯曲菌(C.fetus ssp.Venerealis)。
6.一种检测细菌糖蛋白中聚糖部分的方法，所述方法包括对所述样品进行高分辨魔角旋转核磁共振(HR-MAS NMR)波谱分析。
7.一种药物组合物，该药物组合物含有权利要求1至5任一项所述的化合物和生理学上可接受的载体。
8.如权利要求7所述的药物组合物，该药物组合物还含有具有免疫原性的偶联物。
9.如权利要求7或8所述的药物组合物，该药物组合物还含有免疫刺激剂。
10.权利要求7至9任一项所述的药物组合物在动物或人体中作为疫苗的应用。
11.一种抗体或抗体的抗原结合片段，该抗体或抗体的抗原结合片段与包含聚糖或其具有免疫活性的片段的化合物特异性结合，所述聚糖具有下式结构GalNAc-α1，4-GalNAc-α1，4-[Glc-β1，3]GalNAc-α1，4-GalNAc-α1，4-GalNAc-α1，3-Bac，其中，Bac为2，4-二乙酰氨基-2，4，6-三脱氧-D-吡喃型葡萄糖。
12.一种抗体或抗体的抗原结合片段，该抗体或抗体的抗原结合片段与权利要求1至65任一项所述的化合物特异性结合。
13.一种抗体或抗体的抗原结合片段，所述抗体或抗体的抗原结合片段与权利要求1至65任一项所述的化合物特异性结合，所述抗体或抗体的抗原结合片段由分离自骆驼科动物的基因得到。
14.如权利要求13所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述骆驼科动物选自双峰驼(Camelus bactriamus)、单峰驼(Camelus dromaderius)、羊驼(Lama pPaccos)、驼羊(Lama ggGlama)或小羊驼(Lama vVicugna)。
15.一种药物组合物，该药物组合物包含权利要求11至14任一项所述的抗体或抗原结合片段，以及生理学上可接受的载体。
16.权利要求15所述的药物组合物在人体或动物中作为治疗剂的应用。
17.一种减少禽畜体内的弯曲菌属病原体存在的方法，该方法包括给所述禽畜施用如权利要求11至15任一项所述的抗体或抗原结合片段。
18.如权利要求17所述的方法，其中，所述的施用包括用与所述抗体或抗原结合片段混合的饲料喂养所述禽畜。
19.如权利要求17或18所述的方法，其中，所述禽畜是家禽。
20.一种预防由弯曲菌属病原体在人体内引起弯曲菌属感染的方法，该方法包括通过如权利要求17所述的方法从禽畜体内清除所述病原体。
21.一种治疗由弯曲菌属病原体在人体或动物体内引起的疾病的方法，该方法包括施用如权利要求11至14任一项所述的抗体或抗原结合片段。
22.一种防止由弯曲菌属病原体导致地下水污染的方法，该方法包括通过如权利要求17所述的方法减少禽畜体内的所述病原体的存在。
23.一种用于禽畜的动物饲料或饮用品，该饲料或饮用品含有权利要求11至14任一项所述的抗体或抗原结合片段。
24.如权利要求23所述的饲料或饮用品，该饲料或饮用品包含含有所述抗体或片段的添加剂。
25.如权利要求23所述的饲料，该饲料包含以下植物，该植物含有经过修饰以表达所述抗体或片段的基因组。
26.一种植物基因组，该植物基因组包含能表达权利要求11至14任一项所述的抗体或抗体片段的基因。
27.一种包含权利要求26所述的基因组的植物细胞。
28.一种包含权利要求27所述细胞的植物。
29.如权利要求26所述的植物基因组，其中，所述基因是用下述方法得到的用含有权利要求1至5任一项所述化合物的探针淘选骆驼科动物的基因库以得到能够表达所述抗体片段的骆驼科动物基因，并将所述基因整合入植物的基因组。
30.一种用于检测动物或人体中弯曲菌存在的诊断试剂盒，该诊断试剂盒包含权利要求11至14任一项所述的抗体或抗体片段。
31.一种用于检测样品中弯曲菌存在的诊断试剂盒，该诊断试剂盒包含权利要求11至14任一项所述的抗体或抗体片段。
32.如权利要求31所述的试剂盒，其中，所述样品选自水、土壤或肥料。
全文摘要
发现多个菌株和菌种的弯曲菌都具有共同的聚糖部分，这种聚糖部分存在于许多暴露于表面的糖蛋白中。这种聚糖具有下式的结构GalNAc－α1，4－GalNAc－α1，4－[Glc－β1，3]GalNAc－α1，4－GalNAc－α1，4－GalNAc－α1，3－Bac，其中Bac为2，4－二乙酰氨基－2，4，6－三脱氧－D－吡喃型葡萄糖。这种聚糖和其免疫活性片段具有作为疫苗对抗人类和动物中弯曲菌感染的用途。同时，可以提供与这些化合物特异性结合的抗体。这些抗体和疫苗可以用于预防或中和禽畜中的弯曲菌感染，由此防止这种病原体进入人类的食物链。所述聚糖可以与一个或一个以上的氨基酸相连以形成糖肽。同时，提供检测完整糖蛋白的聚糖结构的方法，该方法包括对所述样品进行高分辨魔角旋转核磁共振(HR－MASNMR)波谱分析。
文档编号G01N33/569GK1671722SQ03818185
公开日2005年9月21日 申请日期2003年7月30日 优先权日2002年8月1日
发明者诺埃尔·M·扬, 吉恩－罗伯特·布里松, 约翰·弗兰西斯·克里, 大卫·C·沃森, 克里斯蒂那·M·希曼斯基, 哈罗德·C·贾雷尔 申请人:加拿大国家研究院