用于诊断和治疗利什曼病的多肽的制作方法

专利名称：用于诊断和治疗利什曼病的多肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及了用于在疑似感染了利什曼虫属原生动物寄生物的个体中检测抗利什曼原虫抗体的化合物和方法，特别地，感染物为印度株(Indian strain)并且与印度利什曼原虫株类似或密切相关。此外，本发明提供了用于在个体中检测利什曼原虫抗体的诊断试剂盒，其由SEQ IDNO5或者SEQ ID NO6所示的多肽组成，在所述的个体中激发了针对印度株和与印度利什曼原虫株类似或密切相关的物种的免疫应答，其还被用作疫苗和治疗剂以预防和治疗利什曼病。该发明还提供了用于检测利什曼原虫抗原的诊断试剂盒，其由针对SEQ ID NO5或者SEQ ID NO6所示多肽的抗体组成。
背景技术：
利什曼病是一种由专性巨噬细胞内原生动物引起的媒介传播的寄生物病。其特点是多样性和复杂性。其以多种临床类型出现。但是，主要有4种临床类型。内脏利什曼病(VL)，也被称为黑热病(kala-azar)(KA)，是该疾病最严重的类型，如果得不到治疗的话，其死亡率将会是100％。皮肤利什曼病(CL)在身体暴露部分例如脸，胳膊和腿产生皮肤溃疡。溃疡的数量可以从1处到一些区域的200处，引起严重的失能并给患者留下永久性疤痕。第三种类型是粘膜皮肤利什曼病(MCL)，或者鼻咽粘膜利什曼病，。其它可以导致鼻、口和喉腔的粘膜的广泛损坏，甚至还会影响软骨。所述的皮肤类型可以导致被称为弥散性皮肤利什曼病(DCL)的弥散类型。利什曼病是由总共大约21个种类所引起，其由大约30个种类的PhlebotonzinePhlebotomine沙蝇所传播[Herwaldt BL.，1999]。
目前，利什曼病在5大州的88个国家是地方性流行病非洲、亚洲、欧洲、南美和北美，并且共计有3亿5千万人口处于感染的危险。据估计世界范围内1千2百万的人口被利什曼病感染，该数字包括明显被感染病例以及无明显症状的病例。在每年发生的1.5-2百万预计新病例中，只有60万病例被官方宣布。在每年发生的五十万VL新病例中，90％发生在五个发展中国家孟加拉国，巴西，印度，尼泊尔和苏丹。所有MCL病例中，大约90％发生在玻利维亚，巴西和秘鲁，并且在所有CL病例中，90％发生在阿富汗，巴西，伊朗，秘鲁，沙特阿拉伯和叙利亚。，每年全世界范围报道的新病例数为1百万-1百50万.5百万。利什曼病的地理分布受限于沙蝇的分布，其对寒冷气候的敏感性，其只从人或者动物吸血的趋势，及其支持利什曼病的特殊种类在内部发展的能力[Desjeux P2001]。
从1993年，利什曼原虫地方流行的区域显著扩大，该疾病的记录病例数量也随之明显增加。这种地理蔓延是由于与发展最为相关的那些因素造成的。这些因素包括大量农村-都市迁移和将非免疫的都市居民带入到地方性流行的农村地区的农业-工业项目。具有环境影响的人为项目例如坝，灌溉系统和井，以及采伐森林，也促成了利什曼病的蔓延。AIDS和其它免疫抑制疾病增加了利什曼原虫感染人群形成内脏疾病的危险[Desjeux P 2001，Paredes R et al.，1997]。
在印度次大陆和非洲，VL主要由杜氏利什曼原虫(Leishmaniadonovani)引起，在地中海区域由尹氏利什曼原虫(Leishmania infantum)引起，在新大陆由恰氏利什曼原虫(Leishmania chagasi)引起。在这些物种中，尹氏利什曼原虫和恰氏利什曼原虫密切相关。尽管所有以上的物种均引起VL，它们之间是遗传上不同的。这些由Cupolillo E等， 使用数字酶分类学获得的数据显示恰氏利什曼原虫，新大陆内脏物种(visceralising species)类似于旧大陆的尹氏利什曼原虫。Zymodeme，serodeme，和核DNA片段图谱的量化比较均表明恰氏利什曼原虫和尹氏利什曼原虫密切相关并且可能代表相同的物种。而且，基于核DNA限制片段图谱的Beverley S.M等 的研究揭示恰氏利什曼原虫和尹氏利什曼原虫是相似的而且象两个来自相同种群的随机个体那样紧密相关，而且，杜氏利什曼原虫与这两个物种是不同的。在另一个Piarroux R等， 的使用重复DNA序列的分析中观察到在引起VL的利什曼原虫中，从人为主要贮主的病灶所分离出来的杜氏利什曼原虫聚在一个独立的分枝，而与此对照，尹氏利什曼原虫和恰氏利什曼原虫是很少感染人类的犬科寄生物，因而它们是不同的。
近来Mauricio I.L等.， 使用3种不同的途径在不同的分辨率水平研究探讨了来自利什曼原虫物种的遗传信息，结果揭示了杜氏利什曼原虫复合体中大量的差异。此外，RAPD已经依照地理来源，特别是印度和肯亚，对杜氏利什曼原虫株进行了分组，结果显示了分类群中主要的趋异。
遗传差异不仅仅对杜氏利什曼原虫是普遍的，甚至在引起皮肤利什曼病的L.major中也是这样，分离自相同地理区域的株在其分子染色体组型中显示较少的染色体大小多态性，而来自不同地理区域的株显示出较显著的差异，这提示利什曼原虫物种的基因组是非常易受影响的并且在各种物种的演化过程中发生了染色体重组[Samaras N等，1987]。目前，一个WHO资助的对L.major进行基因组绘图的计划正在进行中。尽管有争议一种株的基因组图谱对另一个株也适用，但是几乎没有证据能够证实这一断言。实际上，已知在杜氏利什曼原虫，恰氏利什曼原虫，L.major，和其它物种间，基因拷贝数和结构存在差异。此外，协调由相同基因型的不同物种所引起的临床症状中的巨大差异是困难的[Ghosh S.S.，等，1998]。由于这些原因，有必要表征重要的基因，所述基因具有潜在成为来自不同地理区域的诊断或疫苗或治疗候选物的可能。单独基于地理位置或者感染位点的寄生物物种的任务是不令人满意的。因此，正确诊断和分类致病利什曼原虫分离株对于确定临床预后和物种特异的治疗途径是必要的[Marfurt J.，etal.，2003]。一个这样的在来自不同地理区域的不同物种间被广泛研究的潜在基因是大小为63kDa的Gp63糖脂-锚定的锌蛋白酶(glycolipid-anchored zinc protease)[Webb J.R.，et al.，1991；Steinkraus HB etal.，1993；Roberts S C et al.，1993]。
在印度，VL在比哈尔省，西孟加拉省和东北方邦是一个严重的问题，存在黑热病(KA)和黑热病后皮肤利什曼病(post kala-azar dermalleishmaniasis)在妇女和0-9岁龄儿童病例被少报的情况。1992年的新近VL流行病爆发在印度和苏丹夺取了10万人的生命。在印度，喷洒DDT被用来帮助控制KA，但是有报道媒介白蛉属Phlebotomus argentipes对其形成了抗性。同样，一种目前印度的主要病症，淋巴结病，升高了新媒介或者该疾病变体的可能性[Bora D，1999]。
在印度和苏丹，黑热病后皮肤利什曼病(PKDL)是KA的继发病。该疾病在患者中从KA痊愈数月到数年后形成。皮肤损害是该疾病的特征，并且这些损害表现出很大的变化性，从低色素沉着到红斑丘疹并且从丘结节到斑块。在麻风病中，PKDL的广泛临床谱反映了个体对利什曼病生物的免疫应答。损害可以是大量的并且持续数十年。从损伤分离的寄生物同那些引起原生内脏疾病的相同。
在利什曼病中的临床和流行病学的发现不是特异的(pathgnomic)，这些发现可以类似于几种地方性流行病例如疟疾，结核病，梅毒和真菌感染。因此，需要实验室诊断来确定这些临床猜测。用于每种利什曼综合征(即内脏、皮肤和粘膜类型)的诊断工具是不同的，但是在每个病例中的金标准依然是从合适的组织中证实和分离寄生物[Singh S etal.，2003]。
所述的临床指征和综合征用来将VL从其它类似病症如疟疾，具有门静脉高压的热带脾大综合征血吸虫病或者硬化，非洲锥虫病，栗粒性结核，布鲁氏菌病，伤寒，细菌性心内膜炎，组织胞浆菌病，营养不良，淋巴瘤，和白血病区分开来是不够的。因此，需要其它的诊断方法[Herwaldt BL，1999；Davidson RN，1998]。在这些方法中，最特异和标准的技术是寄生物学证实或者分离病原体。从胸骨或者骼骨嵴穿刺获得的骨髓是一种非常安全但是痛苦很大的方法。将抽取物涂抹在玻璃片上并且用罗氏(Romanowsky)染色法染色以证实寄生物的无鞭毛体形式。但是，在培养物上，该方法可以在高到80％的情况下产生阳性结果。淋巴腺穿刺在60％的情况下得到阳性结果。从任何变大的淋巴腺中抽取液体并进行双向检查，而且对其进行培养以得到诊断的最好机会[Williams，J.E，1995；Manson-Bahr PEC，1987]。在具有20％-30％的兔血的固体Novy-MacNeal-Nicolle(NNN)培养基或者补充了10％ v/v胎牛血清(FCS)的液体施氏(Schneider’s)昆虫培养基上进行杜氏利什曼原虫的原代分离。其它合适的生长培养基也可以被特定用于保持前鞭毛体的再次继代培养，其使用FCS或者其它包括人尿在内的补充物[Singh S et al/.2000]。在脾和肝脏中证实这些寄生物是可以被用来确定利什曼原虫感染的最准确的方法之一。90％的活性病例中显示了在脾和肝抽取物中的寄生物。可能的最小的针，优选地，21-规格(0.8mm)应被用于最小化并发症的风险，如脾出血[Williams，J.E，1995]。脾抽取物中的部分可以被用来制造涂片来直接显微检查，其余应该被用来进行培养。肝活检材料不大可能在直接检验或者在培养物上证实寄生物；但是组织检查将会在门静脉系统的肝巨噬细胞(Kupffer cell)中显示无鞭毛体。
在来自肯尼亚和印度的黑热病患者的血中发现利什曼原虫寄生物的偶然报道已经被刊登。在2000g下离心抗凝剂中的血10分钟并移除白细胞层的细胞并且将其用来制备涂片和接种培养物。在巨噬细胞中和周围可以发现无鞭毛体。在培养接种中使用的体积是重要的，在NNN或者施氏培养基中的1-3滴已经获得了成功的结果[Manson-Bahr PEC，1987]。
常规的显微方法是侵入性的并且是痛苦的，并具有医源性感染和致命性出血的危险。尽管在组织中证明寄生物的无鞭毛体形式从将其在1903年发现为寄生物疾病后就被使用，但是其很不敏感而且无法检测隐匿的和亚临床感染。亚临床的和潜在类型的感染已经成为近些年来主要关心的问题，这是因为这些感染可能由于免疫抑制如HIV感染而突然爆发，并且这些感染可能会通过器官移植被传递。对于内脏利什曼病，血清学诊断是基于特异体液应答存在；或者对于皮肤和粘膜皮肤利什曼病，其基于细胞介导的免疫应答存在，其是由指向病原体的免疫系统引起的。存在多种可用于诊断VL的血清学方法，其准确性和特异性不同。这些方法包括非特异的和特异的检测。随着研究的进行，更新更好的方法持续地出现。
甲醛凝胶试验是最古老的血清学测试并且具有廉价和易于操作的优点。将获得自约5ml血液的血清与1滴30％的甲醛混合。如果混合物在20分钟内固化并形成白色不透明的沉淀，则表明阳性反应。阳性测试直到感染后3个月才能被检测出来并且于治愈后6个月后转阴。该测试是非特异的，这是由于该测试基于检测升高水平的IgG和IgM免疫球蛋白，而这些免疫球蛋白在其它感染如非洲锥形虫病，疟疾，和血吸虫病等[WHOexpert committee report，1991]中也升高。几种其它基于该原理的测试已经在先前被使用，但是如今已经很少再被使用[Singh S，1999]。
存在许多特异性血清学测试并且所有这些测试都具有对疾病诊断的不同的敏感性和特异性。这些测试中的一些包括间接血细胞凝集作用(IHA)，逆流免疫电泳(counter current immune electrophoresis(CCIEP))，免疫扩散(ID)等等，但是所有这些测试都是很麻烦的并且缺乏灵敏性和特异性，因此不被普遍使用。一些更为普遍使用的测试描述如下1.利什曼原虫素(leishmanin)皮肤测试(LST)迟发性超敏是人利什曼病皮肤形式的一个重要特征并且可以由利什曼原虫素测试来测定，该测试也被称为Montenegro反应。利什曼原虫素是被杀死的全部(0.5-1×107/ml)或者破坏的(250μg蛋白/ml)前鞭毛体在无热原的酚盐水(phenol saline)中的悬液。没有发生与查格斯病的交叉反应，但是发现一些与腺结核病和瘤型麻风病的交叉反应。利什曼原虫素皮肤测试通常被用作人和动物群体中皮肤型和粘膜皮肤利什曼病的流行和内脏利什曼病的成功治愈的指征[Singh S，1999，Sassi A，等，1999]。在活性黑热病中，不存在或者存在可忽略不计的细胞介导的免疫应答。但是，利什曼原虫素抗原是在印度是无法商购的并且没有进行过现场研究。
2.间接荧光抗体测试(IFAT)间接荧光抗体测试是当前一种最敏感的测试之一。该测试基于抗体测定，这些抗体被证实在感染的非常早期存在而在治愈后6-9个月无法检测出来。如果这些抗体持续低滴度存在，则其为很可能复发的好的表征。大于1/20的滴度是显著的并且高于1/128的滴度是有诊断意义的[Williams，J.E，1995]。可能存在与锥虫血清的交叉反应，但是这可以通过将利什曼原虫无鞭毛体而不是前鞭毛体作为抗原而克服[Gari-Toussaint M，等，1994]。
3.凝集测试DAT是一种高特异而且高灵敏的测试。其廉价并且容易操作，这使得它对场地使用和实验室使用来说都是理想的。抗原是从杜氏利什曼原虫的前鞭毛体制备的，并且该测试可以使用血浆，血清，血斑点和全血。在很长时间，DAT在资源贫乏的国家保持为首选诊断方法。该方法使用悬液或者冻干形式的全部的，染色的前鞭毛体。所述的冻干形式是热稳定的并且其便利了将DAT在场地中使用。但是，DAT的主要不足是相对长的18小时的孵育时间以及需要对血液或者血清进行系列稀释[Schallig HD等，2001]。DAT的另一个主要缺点是其对于评价该疾病的寄生物治愈没有预后价值，这是由于该测试在治愈后的数年中可能保持阳性。近来Schoone等 已经研制了一种快速凝集-筛选测试用来快速测定(＜3h)血清样品和滤纸上收集血液中的抗利什曼原虫抗体。该FAST利用仅一种血清稀释就能得到定性的结果。该FAST提供了基于冻干抗原的DAT的以下优点抗原稳定性，重现性，特异性和敏感性。
4.免疫印迹使用免疫印迹的血清诊断已经被进行了尝试并且据报道其更为优越且阶段专一。感染过程中表达的各种抗原也可以用文件证明。但是，该技术使用困难并且仅限于研究实验室[Herwaldt BL.，1999；Singh S，1999；Schallig HD等，2001]。
5.抗原测定患者血清中抗原的测定由于高水平的抗体，循环免疫复合物，血清淀粉样物，类风湿因子，和自体抗体的存在而复杂化，这些物质可能覆盖免疫学重要的抗原决定簇或者完全抑制自由抗原的结合。原则上，抗原检测将会提供较好的利什曼病诊断方法。因为抗原水平被预计与寄生物的负荷量广泛相关，抗原检测可以作为一个理想的候选来在抗体应答非常差的无免疫应答患者中检测抗体。尽管已经公布了几个报道，但是目前没有可用的令人满意的抗原检测系统[Senaldi G等，2001；Attar ZJ等，2001]。近来，研制出了用来在VL患者的尿液中检测利什曼原虫抗原的胶乳凝集测试(KATEX)。使用从不同VL病灶收集的样品，用KATEX获得的结果表明不管样品的地理来源如何，该测试工作进行得很好。该测试的特异性为100％并且敏感性为68-100％[Attar ZJ等，2001]。该测试是否可以用于检测无症状VL和监测治疗尚需要被进行确定。
6.酶联免疫吸附测试(ELISA)酶联免疫吸附测试(ELISA)在利什曼病的血清学诊断中是有价值的工具。该测试用于实验室分析或区域应用。ELISA的操作十分容易并且适于用于纯化的或确定的抗原。传统上，利什曼病的免疫诊断测试设计中使用的抗原衍生于被体外培养的前鞭毛体或者来自重组体蛋白，用于ELISA和DAT的抗原的改变已经提高了VL诊断，其中的改变是从整个前鞭毛体或者溶解抗原变为更特异和潜在的重组体利什曼原虫和肽抗原[Senaldi G等，2001]。免疫诊断受到使用抗原的极大影响。近来已经报道了几种抗原分子[Martin SK et al.，1998；Rajasekariah GH et al.，2001]。杜氏利什曼原虫前鞭毛体释放到无蛋白培养基中的排泄的、分泌的和代谢的抗原(Ld-ESM)被通过ELISA来用来VL的血清诊断。已经发现Ld-ESM是100％特异的并且是敏感的，阳性预测值是99.99％并且阴性预测值是95.45％。但是，需要进一步的回顾性和预期的多位点(multisite)评估来确认这些发现[Schoone GJ等，2001]。近来，研制了多种重组体抗原，近来已经鉴定了一种与编码表达在L.major前鞭毛体和无鞭毛体表面的亲水蛋白L.major基因B相关的基因，所述蛋白被表征为5.5个拷贝14个氨基酸序列的氨基酸重复基序，该基因被显示在杜氏利什曼原虫中表达。由杜氏利什曼原虫基因B同系物编码的蛋白含有高达22拷贝的重复元件，其中14个残基中的9个在两种物种间是完全保守的。研制了使用来自杜氏利什曼原虫GBP和重组杜氏利什曼原虫GBP的重复肽序列作为固定相配基的ELISA。但是，该抗原的限制是其仅可以被用于地方性流行杜氏利什曼原虫区域的内脏利什曼病的血清学诊断，而不能用于其它利什曼原虫物种的共地方性流行的区域而且其特异性和灵敏性也不是很高[Jensen AT等，1999]。
Raj等(1999)研制了另一种用于诊断印度VL的尹氏利什曼原虫源的重组蛋白rORFF。该ORFF蛋白在尹氏利什曼原虫的染色体35的LD1基因座中被编码，使用该抗原的ELISA证实，当用不同组的患者如证实的VL，怀疑的VL，间断治疗的地方流行性正常和非地方流行性正常患者进行测试的时候，其具有低到5ng r-ORFF的敏感性。此外，使用全前鞭毛体的DAT和使用全部可溶抗原的ELISA被用于相同的患者组。发现使用rORFF的ELISA比其它的更为敏感。尽管该抗原对VL是高度灵敏的(95-100％)和特异的(＞90％)，但是在40％被确认L.major或者L.tropica引发的CL中也发现阳性。仍需要通过其它方式评估测试并且其在诊断领域的用途尚待研究。在最近的一个在尹氏利什曼原虫为病原体的地中海VL进行的研究中，使用Maalej等， 的ELISA方法比较10个重组体和纯化的利什曼原虫抗原。在这些重组体抗原中rgp63-不存在于Trypanosoma cruzi或其它运动质体(kinetoplastid)的利什曼原虫的一个主要表面抗原-和rGBP具有良好的性能，但是其并不非常敏感并且对可靠的诊断并不特异。其暗示使用来自尹氏利什曼原虫而不是L.major的重组体蛋白将会得到更好的结果。
Burns等 研制的一个重组体抗原K39(rK39)属于发动蛋白(motor protein)的驱动蛋白家族，其已经被显示特异于由杜氏利什曼原虫复合体成员引起的VL过程中产生的抗体，所述的复合体包括恰氏利什曼原虫和尹氏利什曼原虫。该抗原是驱动蛋白家族的一员，其编码一种具有重复表位的蛋白，这个由39个氨基酸残基组成的蛋白(K39)是高度敏感并且对急性疾病具有预测性。在VL患者中已经证实了其高抗-rK39的抗体滴度，但是在皮肤或者粘膜皮肤利什曼病中其没有显示可见测得到的抗rK39抗体。对该抗原的抗体滴度与活性疾病直接相关，并且其具有很大潜能作为监测化疗和预测临床复发的方法[Burns JM Jr等1993；SinghS等1995；Badaro R等.1996；Singh S等.2002；Maalej IA等.，2003，美国专利号5,411,865和5,719,263]。此外，rK39 ELISA对于在无免疫应答的人如艾滋病患者中检测VL具有高预测价值[Houghton RL等，1998]。该抗原如今以适合在现场条件下使用的抗原-浸透的硝化纤维纸带形式商购。已经发现rK39带测试在印度的黑热病现场诊断中是有用的[Sundar S等，1998]。但是，该测试在苏丹[Zijlstra EE等，2001]和欧洲南部却具有显著小的敏感性。重要的是在此强调尽管已经表明驱动蛋白相关抗原基因在所有的内脏物种中都是保守的，这里却不是这样，因为杜氏利什曼原虫是印度以及苏丹黑热病的病原体，并且在两个地理区域它们会引起VL继发的PKDL。但是据Zijlstra等， 观察，rK39带测试在苏丹(只有达67％)甚至欧洲南部(只有达71.4％)都较不敏感[Jelinek T等，1999]，这引起了对该抗原是否普遍合适的疑虑。对该变化的敏感性的一个经常提供的解释是可能不同种族群体诱发的抗体反应显著不同[Sundar S等，2002]。或者，也可能是这样的当将来自恰氏利什曼原虫的存在的rK39被用于诊断的时候，抗原基因其本身从株与株之间显著变化，在不同地理区域间也显著变化，或者在一些情况下作为疾病未被发觉的结果，该抗原的变体存在并逃避免疫监视(immune elucidation)。此外，世界范围内每年发生的500,000个新的VL病例中，超过90％报道自印度，孟加拉国，苏丹南部，和巴西东北部[Sundar S等，2002]。
世界的大部分VL病例都在印度，并且驱动蛋白相关抗原还没有被从杜氏利什曼原虫的印度分离株中表征。同样清楚的是恰氏利什曼原虫具有动物储存宿主而杜氏利什曼原虫却没有。来自恰氏利什曼原虫的基因显著不同是可能的，并且该基因的表征也可以解释rK39带测试在某些地理区域敏感性差的原因。在一次解决该问题的尝试中，我们克隆并表征了来自分离自两个被印度同一个地理区域的杜氏利什曼原虫感染的个体中分离的不同株的驱动蛋白基因。一个株MHOM/IN/DD8是被WHO参考株很好的表征的分离自1980年印度的株，并且第二个株MHOM/IN/KE16/1998是一个新近临床分离株，其来自印度的Muzaffarpur和比哈尔省的10岁龄女性黑热病患者。这清楚地解释了基因水平的变化可能引起了在某些地理区域中降低的敏感性。如果该驱动蛋白基因没有从印度分离株中被表征，把这一基因水平的变化信息将永远不会被科学界所知晓。从ELISA的结果来看这是很清楚的，来自MHOM/IN/DD8抗原的平均滴度要明显低于来自MHOM/IN/KE16/1998和恰氏利什曼原虫中任一个的rK 39。
申请人用不同的关键词对专利数据库做了大量检索以研究先前对K39免疫显性重复抗原(immunodominant repeat antigen)和230kD抗原的工作。下面对几个Reed的美国专利就其相关主题与申请人的抗原的独特性进行讨论。
Reed在1995年5月2日的美国专利no.5,411,865中教导一种测定抗-利什曼原虫寄生物抗体的方法。所公开的化合物被用于一种用来检测抗-利什曼原虫寄生物抗体，其靶向一个存在于恰氏利什曼原虫和杜氏利什曼原虫中的230kDa的抗原。其包括从个体获得样品，将样品与包含SEQID NO3中的氨基酸序列的重组体K39重复区域抗原(regionantigen)接触，和检测样品中结合到重组体K39重复区域抗原的抗利什曼原虫寄生物抗体的存在。
Reed在1998年2月17日的美国专利no.5,719,263中教导了一种存在于利什曼原虫物种中的抗原。所公开的化合物是一种分离的230Kd的抗原，其存在于恰氏利什曼原虫和杜氏利什曼原虫中，并且还公开了含有一个或者多个K39重复抗原的分离的多肽。该发明还公开了编码该230Kd抗原和K39重复抗原的DNA，以及包含该抗原的疫苗组合物。
上面公开的230KDa抗原和含有K39重复的分离的多肽据报道在某些VL高度地方性流行的地区并不是很灵敏并且是由杜氏利什曼原虫引起的。但是，应该注意的是，K39重复只已经从恰氏利什曼原虫而没有从杜氏利什曼原虫表征。整个世界的利什曼病的主要问题是由杜氏利什曼原虫引起的。从报道看，很清楚两个物种是遗传上不同的。因此，本申请人克隆并表征了来自杜氏利什曼原虫的印度分离株的K39重复免疫显性区域，这对于全球的VL问题作出了很大的贡献。
申请者的发明公开了存在于利什曼原虫物种中的29kDa和26kDa重复抗原。公开的化合物是分离的29kDa和26kDa抗原，其表征自杜氏利什曼原虫的印度分离株。所报道的抗原与恰氏利什曼原虫的230kDa抗原完全不同。抗原变化显著，超过60％的预计氨基酸序列与来自恰氏利什曼原虫的K39重复抗原不同。还公开了编码该29kD抗原和26kD抗原的DNA，以及包含该抗原的治疗和疫苗组合物。
Reed等在1999年6月15日的美国专利no.5,912,166中教导了用于诊断利什曼病感染的化合物和方法。所提供的化合物包括含有至少一种恰氏利什曼原虫酸性核糖体抗原LcPO或其变体的表位。这种化合物在用于检测利什曼病感染和用于鉴定具有无症状感染、可能会发展成为急性内脏利什曼病的个体的多种免疫检测中有用。所述的多肽化合物还在用于预防利什曼病的疫苗和药用组合物中有用。
但是，申请人的发明不涉及酸性核糖体抗原LcPO。
Reed等在2003年10月28日的美国专利No.6,638,517“用于利什曼病治疗和诊断的利什曼原虫抗原”中教导了用于预防，治疗和检测利什曼病并在患者中刺激免疫应答的组合物和方法。所提供的化合物包含含有一个或者多个利什曼原虫抗原或其变体的免疫原性部分的多肽。该专利还公开了含有该多肽的疫苗和药用组合物，或者编码该多肽的多核苷酸也被提供并且可能被用于例如预防和治疗利什曼病，以及检测利什曼原虫感染。
上面专利中提供的化合物利用L.major源的序列和来自复合利什曼原虫抗原的融合构建体。这些化合物与申请者的抗原根本不相似。
Burns等， 已经从一个南美内脏物种的恰氏利什曼原虫中克隆并表征了驱动蛋白相关抗原基因，这导致了rK39抗原的发展，其是一个具有39个氨基酸串联重复的重组体蛋白。据报道该来自新大陆的内脏物种恰氏利什曼原虫的抗原在一些高VL地方流行性区域苏丹和欧洲南部不象其它一些地理区域印度、孟加拉国、尼泊尔等那样敏感[Sundar et al.，2002]。在世界利什曼病问题上，印度具有VL人群的多数。因此，具有准确和良好表征化的工具对于诊断和其它控制方法是重要的。申请者已经在序列水平表征了驱动蛋白相关抗原以研究是否该序列与恰氏利什曼原虫的序列相似以排除一些VL和PKDL病例象在苏丹所报道的那样未被检查出来的可能性，所述的恰氏利什曼原虫序列已经被很好表征。该研究还将探究种族群体中不同应答的原因，这些群体在Burns等， 报道的rK39抗原中包含该疾病。在本发明中，我们发现我们的驱动蛋白抗原的序列与公开报道的、Burns等的衍生rK39的恰氏利什曼原虫的序列显著不同。本发明还提供了一种使用衍生自杜氏利什曼原虫的印度分离株的抗原用于检测抗利什曼原虫抗体的方法。
本研究对于分析在印度的各种种族群体中对所述抗原的应答是重要的。印度患者中的抗体水平可能由于株的不同或者也可能不同的种族群体以不同的方式应答于利什曼原虫抗原。
发明目的本发明的主要目的是分离、表征和使用来自杜氏利什曼原虫株MHOM/IN/DD8的印度分离株的驱动蛋白相关抗原基因的免疫显性区域。
本发明的另一个目的是分离、表征和使用来自杜氏利什曼原虫株MHOM/IN/KE16/1998的印度分离株的驱动蛋白相关抗原基因的免疫显性区域。
本发明的另一个目的是在核酸和氨基酸水平上鉴定印度分离株和在核酸和氨基酸水平上比较序列分析印度分离株和恰氏利什曼原虫驱动蛋白免疫显性区域。
本发明的又一个目的是与其它报道的序列作比较，鉴定分离自印度株的驱动蛋白基因的39个氨基酸的免疫显性重复区域的变化。
本发明的又一个目的是从印度株中生产含有一个或者多个39氨基重复区域的多肽。
本发明的又一个目的是从印度株中生产含有一个或者多个39氨基酸重复区域的重组体多肽。
本发明的另一个目的是提供一种使用上述的多肽从利什曼原虫感染的患者中检测抗利什曼原虫抗体的方法。
本发明的另一个目的是提供一种试剂盒来在VL和PKDL患者中检测抗利什曼原虫抗体，该试剂盒含有来自杜氏利什曼原虫的印度分离株的多肽。
本发明的又一个目的是生产针对SEQ ID NO5或者SEQ ID NO6中所示多肽的抗体。
本发明的又一个目的是提供使用上述抗体来检测利什曼原虫抗原的方法。
本发明的另一目的是提供用于诊断利什曼原虫抗原的诊断试剂盒，该试剂盒由针对SEQ ID NO5或者SEQ ID NO6中所示多肽产生的抗体组成。
发明简述相应地，本发明提供了被鉴定为SEQ ID NO5和SEQ ID NO6的多肽，其分离自杜氏利什曼原虫印度株，用于从收集自动物或者人类的感染样品中检测抗利什曼原虫抗体。本发明还提供了用来检测上述由利什曼原虫属的原生动物寄生物引起的感染的ELISA方法。本发明还提供了用于在血液样品中检测利什曼病(VL和PKDL)的诊断试剂盒。本发明还提供了用于诊断利什曼原虫抗原的诊断试剂盒，该试剂盒由针对SEQ ID NO5或者SEQ ID NO6中所示多肽产生的抗体组成。
附图简述

图1克隆自株MHOM/IN/DD8的pGEMTE载体(Promega)中的563bp PCR产物。泳道11kb的分子量标记(MBI Fermentas)，泳道2Eco RI消化的带有释放的563bp插入物的质粒，泳道3未消化的带有插入物的pGEMTE，泳道4Eco RI消化的带有释放的563bp插入物的质粒，泳道5未消化的带有插入物的pGEMTE。
图2克隆自株MHOM/IN/KE16/1998的pGEMTE载体(Promega)中的466bp PCR产物。泳道11kb的分子量标记(MBI Fermentas)，泳道2Eco RI消化的带有释放的466bp插入物的质粒，泳道3未消化的带有插入物的pGEMTE，泳道4Eco RI消化的带有释放的466bp插入物的质粒，泳道5未消化的带有插入物的pGEMTE。。
图3使用基因库数据库的专利部对预测的杜氏利什曼原虫株MHOM/IN/DD8(SEQ ID NO5)的蛋白序列进行BLAST搜索。图3A-3F，对专利数据库的BLAST结果。查询来自杜氏利什曼原虫株MHOM/IN/DD8(SEQ ID NO5)的多肽，主题来自美国专利号5411865，5719263，5912166的专利保护的序列图3A-C显示了SEQ ID NO5和来自US专利5411865的SEQ IDNO1之间的同源性，其与US专利5719263的SEQ ID NO2相同。
图3D-F显示了SEQ ID NO5和来自US专利5912166的SEQ ID NO3之间的同源性。
图4在核苷酸水平对序列SEQ ID NO3和SEQ ID NO4与恰氏利什曼原虫免疫显性重复区域的那些进行免疫显性重复区域的Clustal W多序列比对。
LCIMM恰氏利什曼原虫种类的免疫显性重复区域(基因库入藏登记号L07879)；DDIMM(SEQ ID NO3)是印度株MHOM/IN/DD8的杜氏利什曼原虫种类免疫显性重复区域；KEIMM(SEQ ID NO4)印度株MHOM/IN/KE16/1998的免疫显性重复区域；[---代表缺口，相同的序列用黑色阴影表示]。
图5在氨基酸水平对序列SEQ ID NO5和SEQ ID NO6与恰氏利什曼原虫免疫显性重复区域的那些进行免疫显性重复区域的Clustal W多序列比对。
LCIMM恰氏利什曼原虫种类的免疫显性重复区域(基因库入藏登记号L07879)；序列DDIMM(SEQ ID NO5)是印度株MHOM/IN/DD8的杜氏利什曼原虫种类免疫显性重复区域；KEIMM(SEQ ID NO6)印度株MHOM/IN/KE16/1998的免疫显性重复区域；[---代表缺口，相同的序列用黑色阴影表示并且类似的区域用灰色阴影表示]。
图6在氨基酸水平对SEQ ID NO5(DDIMM)与恰氏利什曼原虫免疫显性重复区域的序列进行免疫显性重复区域的Clustal W多序列比对。LCIMM代表恰氏利什曼原虫种类的免疫显性重复区域(基因库入藏登记号L07879)。[---代表缺口，相同的序列用黑色阴影表示并且类似的区域用灰色阴影表示]。
图7在氨基酸水平对SEQ ID NO5(DDIMM)与SEQ ID NO6(KEIMM)进行免疫显性重复区域的Clustal W多序列比对。[---代表缺口，相同的序列用黑色阴影表示并且类似的区域用灰色阴影表示]。
图8如SEQ ID NO5所示，带有杜氏利什曼原虫印度分离株的MHOM/IN/DD8株的内重复变体的免疫显性39氨基酸重复单元。呈现了第一个39氨基酸重复单元并且显示了在重复之间的不同氨基酸位置的简并性。
图9如SEQ ID NO6所示，带有杜氏利什曼原虫印度分离株的MHOM/IN/KE16/1998的株内重复变体的免疫显性39氨基酸重复单元。呈现了第一个39氨基酸重复单元并且显示了在重复之间的不同氨基酸位置的简并性。
图10a)将Ni-NTA琼脂糖纯化的6X-His标记的重组体蛋白在12％SDS-PAGE上分解并用考马斯亮兰染色。泳道1预染的分子量标记(MBIFermentas，USA)；泳道2从MHOM/IN/DD8(～29kDA)纯化的蛋白；泳道3从MHOM/IN/KE16/1998(～26kDa)纯化的蛋白。
b)对纯化的蛋白用五抗-His-HRP缀合物进行蛋白印迹。泳道1预染的分子量标记(MBI Fermentas，USA)；泳道2从MHOM/IN/DD8(～29kDA)纯化的蛋白；泳道3从MHOM/IN/KE16/1998(～26kDa)纯化的蛋白。
的来自新大陆的内脏物种恰氏利什曼原虫的抗原在一些高VL地方流行性区域苏丹和欧洲南部[Zijlstra，E.E.，2001；Jelinek T.，1999]不象其它一些地理区域印度、孟加拉国、尼泊尔等那样敏感。在世界利什曼病问题上，印度具有VL人群的多数。因此，具有准确和良好表征的工具对于在印度诊断和其它的控制方法是重要的。申请者已经在序列水平表征了来自两种株的驱动蛋白相关抗原以研究是否该序列与恰氏利什曼原虫的序列相似并排除在印度是否有一些病例象在苏丹那样未被检查出来的疑虑，所述的两个株也就是a)最初获得自印度比哈尔省黑热病患者的WHO参考株MHOM/IN/DD8，b)获得自印度的Musafarpur和比哈尔省的10岁龄女性黑热病患者的株MHOM/IN/KE16/1998。同样，了解是否不同的种族群体对rK39抗原应答不同或者是否在免疫显性区域的序列差异引起了敏感性的不同变得非常重要。在本发明中，我们发现驱动蛋白抗原/多肽的序列与所公开的衍生出rK39的恰氏利什曼原虫的序列显著不同。
在本发明中，我们还已经产生了针对所述驱动蛋白抗原/多肽的抗体，并利用它来检测利什曼原虫抗原。
从黑热病患者的临床样品中在NNN培养基中将寄生物首先分离为前鞭毛体，随后在含有10％热失活FCS的199培养基中在25℃下适应生长。作为常规的维持，将含有寄生物的接种物样品无菌引入到补充了10％FCS的4ml 199培养基的培养管中。在25℃，将管置于冷却的孵箱中，并且用显微镜以规律的间隔监测其生长。对于寄生物的大量培养，将含有寄生物的接种物样品无菌引入到500ml的组织培养瓶中的200ml含有10％FCS的M199中，并在25℃的冷却的孵箱中孵育直到中间对数期(7-10天)。随后收集寄生物并用于核DNA分离。
通过在冷冻离心机中以5000rpm离心来收获中对数期的寄生物。除了少许修改外，按照标准方法[Lu H.G.等，1994]分离寄生物的核DNA。在60℃下在10体积的裂解缓冲液(NaCl，100mM，Tris-HCl，10mM(pH 8.0)，EDTA 10mM，蛋白酶K/ml 100μg，Sarcosyl 1.5％)中裂解大约1-5×109的前鞭毛体3小时。通过在27,000Xg下离心1小时沉淀动基体DNA网络，并在TE缓冲液(Tris-HCl(pH 8.0)10mM，EDTA(pH 8.0)1mM)中重悬。在沉淀动基体DNA后，从剩余的上清液中分离核DNA。将这些上清液温育过夜以在65℃进一步消化蛋白。通过加入等体积的酚/氯仿混合物，彻底混合并随后通过在5000rmp沉淀离心15分钟来使核DNA经历几个循环的酚/氯仿抽提。通过加入良好混合的1/10体积的3M-醋酸钠和2体积的100％乙醇并在-20℃孵育1小时来沉淀核DNA。将混合物在4℃以5000rpm离心30分钟来沉淀混合物。用70％乙醇清洗沉淀，干燥，并将其重悬于TE缓冲液。通过测定260/280nmOD值来测定DNA的浓度和纯度。将DNA储存在-70℃直到使用。
使用50ng分离的核DNA并且使用各种下面引物的组合来进行驱动蛋白相关抗原的PCR扩增，以扩增驱动蛋白基因的重叠部分。所述的引物基于基因库中驱动蛋白基因的序列资料(入藏登记号L07879)进行设计。可用的来自恰氏利什曼原虫的驱动蛋白基因序列长度为3319bp并且具有的ORF从454位置的推定ATG起始密码子到3319位置的最后一个碱基。该基因具有起始自位置2563的起始密码子的5’非重复区域，和一个从碱基2564直到3’末端的保守的免疫显性重复结构域。所述的39氨基酸重复表位是驱动蛋白基因的一部分，在碱基位置2564-3319的3’末端。该重复表位在报道的6.5拷贝处具有117bp串联重复并且在3’末端延伸到3-4kb。在不同位置的高度保守的序列的短延伸被考虑用来设计引物。考虑恰氏利什曼原虫的全部3.33kb的基因，并且我们试图扩增从位置454到3319bp的开放阅读框(ORF)。主要的焦点是117bp大小的免疫显性串联重复；但是，我们试图扩增和表征尽可能多重复的全部ORF。设计三个正向和两个反向引物来扩增该基因，细节如下引物LKF93(SEQ ID NO7)在455bp处预测起始密码子的上游，并且其覆盖5’到ORF起始的362bp。引物LKF 1527(SEQ ID NO9)是另一个正向引物，其起始于从碱基1开始的碱基1527位置，即，其覆盖从ORF开始的1073个碱基。第三个正向引物是LKF 2564(SEQ ID NO10)，其意在与反向引物LKR3266(SEQ IDNO11)相结合扩增免疫显性串联重复。第一个反向引物是LKR 1803(SEQID NO8)，其包含与带有另一个反向引物LKR3266(SEQ ID NO11)的第二引物组的276bp的重叠区域。引物序列在SEQ ID NO7到SEQ ID NO11中给出。第一PCR引物组LKF 93(SEQID NO7)和LKR 1803(SEQ IDNO8)扩增一个从驱动蛋白基因5’末端的93碱基位置到3’位置中的位置1803bp的1.71kb片段。第二PCR引物组LKF 1527(SEQ ID NO9)和LKR3266(SEQID NO11)扩增具有一个117bp串联重复的1.15kb片段。该PCR扩增子在5’末端与扩增的第一PCR产物具有276bp的重叠核苷酸。第三PCR引物组LKF 2564(SEQ ID NO10)和LKR 3266(SEQID NO11)扩增免疫显性117串联重复区域。该第三引物组扩增一个对应于MHOM/IN/KE16/1998的第四个117bp串联重复的大小为大约470bp的片段，和对应于MHOM/IN/DD8的第五个串联重复的大小为大约590bp的片段。所有的PCR产物如下所述的那样被纯化并且被克隆在pGEMTE克隆载体中，并在自动DNA测序仪中测序。
通过使用不含气溶胶(aerosol)的吸头(pipette tips)并将前和后PCR产物分别保持，避免了扩增子携带的污染。所有的PCR反应都使用标准的方法操作(Sambrook等，1989)，并提供一组阴性对照。
10XTaq缓冲液 5.00μl10mM dNTPs 1.00μl正向引物(25μM) 1.00μl反向引物(25μM) 1.00μlTaq DNA聚合酶(5U/μl)0.25μl(Promega，USA)模板DNA 2.00μl无菌水将体积补充到 50.00μl将管保持在热循环仪中(MJ Research，USA)并在95℃下温育5分钟，随后进行35个循环的扩增。
将扩增的PCR产物在琼脂糖凝胶电泳中分析。将胶在紫外线投照器(UVP)下显影并使用Polaroid照相机照像。
PCR扩增后的驱动蛋白基因被如下克隆到TA克隆载体中。将PCR扩增的DNA在琼脂糖凝胶上分解，并且用无菌解剖刀切下含目的带的部分。使用胶洗脱试剂盒(Qiagen，德国)，按照生产商的使用说明书将DNA从胶上洗脱。洗脱DNA的浓度通过分光光度计中260nm处的吸光度测量。
将胶纯化的PCR目的产物直接连接到pGEMT-Easy载体上。向1.5ml微量离心管中加入下列组分pGEM-T Easy1.00μl10X连接缓冲液 1.00μlDNA(200ng) 5.00μlT4DNA连接酶(2U/μl)1.00μl用水将体积补充到 10.00μl轻柔混合后，将管在4℃下孵育过夜并在70℃下加热10分钟。将样品在-20℃下储存直到转化。
随后用热激处理转化连接的混合物。通过使用氯化钙方法制备感受态细胞[Sambrook等，1989]。将单个集落的大肠杆菌接种到5ml的LB培养基中并在37℃下振荡(200rpm)培养过夜。第二天，将1ml的过夜培养物接种到新鲜原液的100ml LB培养基中，并在37℃下连续振荡培养直到OD值达到600nm下的0.6。将培养物在冰上冷却30分钟并且用4000g、4℃下离心10分钟收集细胞。将细胞沉淀在1/10体积的冰冷的过滤的无菌50mM CaCl2中重悬并在冰上保持30分钟。将细胞沉淀下来并最终重悬在1/25体积的冰冷的50mM CaCl2中(具有20％ V/V的高压消毒的甘油)，并以200μl的等份储存在-70℃或者立即使用于转化。
将大约5μl的连接混合物轻柔地与感受态细胞(200μl)混合，并在冰上培养30分钟。培养后，将细胞置于42℃的水浴中90秒(热激)并立即转移到冰上。将800μl的LB培养基加到细胞中并在37℃下振荡(150rpm)保持90分钟。将细胞与16μl的X-gal和10μl的1M的IPTG在含有50μl/ml氨卞青霉素的LB琼脂平板上铺板。将板在37℃下培育12-16小时。选择白色的集落并检查插入物。为了筛选，将质粒用快速沸腾法分离[Holmes和Quigley，1981]。用无菌的牙签挑选集落并接种在5ml的新鲜培养基中。沉淀生长过夜的培养物并且将细胞重悬于500μl的STET缓冲液(蔗糖8％(w/v)，Tris-HCl，(pH 8.0)，50mM，EDTA Na2，(pH 8.0)50mM，Triton-X 100 5％(w/v)中，随后用40μl的溶菌酶裂解。将混合物充分混悬并在沸腾的水浴中培育90秒钟。通过在12000g离心10分钟来移除细菌碎片和染色体DNA。将上清液与400μl的异丙醇和200μl的7.5M醋酸铵混合。离心沉淀质粒DNA。将干燥的沉淀重悬于100μl无菌水中，与50μl7.5M的醋酸铵混合，并在冰上培育30分钟。将样品在4℃下离心10分钟并且用乙醇沉淀质粒DNA。离心后得到的纯DNA沉淀被70％的乙醇清洗两遍，干燥，并溶解在50μl的无菌水中。
使用载体多个克隆位点两侧的合适的限制性酶位点对重组体质粒进行限制性酶切分析。反应设置如下质粒DNA 8.00μl(2μg)10X反应缓冲液2.00μlRNA酶A(10mg/ml) 5.00μl限制性酶 5单位无菌水补充体积到20.00μl将反应在37℃下培育6-8小时并在1.5％的琼脂糖凝胶上与标准的分子量标记一起对产物进行分析。限制性消化检测到的含有插入物的阳性克隆被用于测序并保存为甘油贮存液。
在ABI Prism7.0版的自动DNA测序仪中，通过链终止法[Sanger等，1977]进行所有的测序。使用不同的软件如DNASIS，Lasergeneedit；Megalign等(DNA star Inc.)，Clustal W(各种序列文件的多比对)对序列进行分析。使用Seqman II(Lasergene包)将所有得到的序列进行比对以形成连续的伸展。同时，使用来自不同网站BLAST[Altschul等，1997]选项查询序列的同源性。
在序列组装后，所得到全长驱动蛋白序列被呈现在株MHOM/IN/DD8的SEQ ID NO1中，发现其长度为3016bp并具有2670bp的开放阅读框。发现株MHOM/IN/KE16/1998的长度为2937bp并具有2577bp的长开放阅读框(SEQ ID NO2)。对于株MHOM/IN/DD8(图1)，序列分析揭示扩增免疫显性区域的PCR产物的大小为563bp，相应于4.8个117bp的串联重复(相应于4.8单位的39氨基酸重复)；对于株MHOM/IN/KE16/1998(图2)，其大小为466bp，相应于4个117bp的串联重复(相应于4单位的39氨基酸重复)。
另外，序列分析显示了在DNA水平以及预测氨基酸序列与恰氏利什曼原虫序列的显著不同。株MHOM/IN/DD8显示了与恰氏利什曼原虫序列以及株MHOM/IN/KE16/1998的明显不同。使用基因库数据库的非-多余(non-redundant)和专利部Blast搜索株MHOM/IN/DD8(SEQ ID NO5)的预测蛋白序列，结果揭示其分别只有与公布的恰氏利什曼原虫序列和美国专利号i)US5411865和ii)US 5912166序列的38％的同一性(图3)。
在核苷酸水平上对杜氏利什曼原虫株MHOM/IN/DD8和MHOM/IN/KE16/1998(SEQ ID NO3和SEQ ID NO4)与恰氏利什曼原虫之间的免疫显性重复区域进行了Clustal W多重序列比对，结果见图4。相同部分为暗阴影。杜氏利什曼原虫(SEQID NO5和SEQ ID NO6)和恰氏利什曼原虫的免疫显性重复区域的氨基酸水平多重序列比对见图5。杜氏利什曼原虫株MHOM/IN/DD8(SEQID NO5)和恰氏利什曼原虫的免疫显性重复区域的氨基酸水平多重序列比对见图6。两个杜氏利什曼原虫株MHOM/IN/DD8和MHOM/IN/KE16/1998(SEQID NO5和SEQ ID NO6)的免疫显性重复区域的氨基酸水平多重序列比对见图7。杜氏利什曼原虫，株MHOM/IN/DD8和MHOM/IN/KE16/1998(SEQ ID NO5和SEQ ID NO6)的印度分离株的具有内重复变化的免疫显性39氨基酸重复单元见图8和图9。序列分析显示氨基酸变化很大，在报道的恰氏利什曼原虫的39氨基酸序列的许多位置具有许多保守的和变化的取代。至少杜氏利什曼原虫的5个氨基酸与恰氏利什曼原虫的不同，不同的位置在18，27，29，32和38，在下面的表1中用“*”表示。
在分析序列insilico后，我们发现在株MHOM/IN/DD8的免疫显性区域与恰氏利什曼原虫的区域的氨基酸序列有一个明显变化。而后，为了确认是否该序列变化引起了对抗原检测抗利什曼原虫抗体性能的任何影响，我们将来自大肠杆菌表达载体pRSET(Invitrogen)中的两个印度杜氏利什曼原虫分离株的免疫显性区域表达为6X-His标记的蛋白。我们已经表达了各种免疫显性重复组合象1，2，3，4，4.8个单位和上游于免疫显性结构域的889个核苷酸的一个重复。我们发现具有4和4.8重复单元的重组多肽具有较高的灵敏性和特异性。因此，我们的工作集中在含有39氨基酸的4.0和4.8重复单元的多肽上。
大肠杆菌表达载体pRSET C(Invitrogen，荷兰)被PstI和NcoI限制性酶在37℃下过夜消化完全。将被消化的质粒在琼脂糖凝胶上分解以移除填充片段。将质粒带切下来并用Qiagen胶洗脱系统清洗，并在-20℃储存直到使用。
通过将其用PstI和NcoI消化，将插入物从携带免疫显性串联重复的重组体pGEM-TE质粒(pGEM-TEasy/DD8/LKF2564和pGEM-TEasy/KE16/LKF2564)中释放。将插入物从胶切割下来，用Qiagen胶洗脱系统洗脱并在PstI和NcoI消化的pRSET C载体内框(in-frame)中连接，并通过标准的方法[Sambrook等，1989]将其转化到BL21感受态细胞。在氨苄青霉素板上选择克隆，分离质粒DNA，并用PstI和NcoI消化来检查插入物。这些释放插入物克隆被选择用于蛋白诱导。
表1

而后，将含有插入物的单个重组体大肠杆菌(BL21)集落接种到2ml的含有氨苄青霉素(50μg/ml)的SOB中并在37℃振荡(225rpm)培育过夜。第二天，将25ml的SOB接种到过夜的培养物中并使其在37℃的振荡条件下生长直到0.6的OD600。移除1ml等份的细胞，离心并在-20℃冷冻。将IPTG加入到培养物中使终浓度为1mM并在37℃振荡培育。通过在IPTG诱导后1，2，3，4和5小时取得等份的细胞、SDS-PAGE分析和蛋白印迹来表达一个时间段以确定最大程度蛋白表达的最佳诱导时间。另外，为了确定蛋白的可溶性，将含有插入物的单个重组体大肠杆菌(BL21)集落接种到含有氨苄青霉素(50μg/ml)的2ml SOB中并在37℃振荡(225rpm)培育过夜。第二天，将25ml的SOB接种到过夜的培养物中并使其在37℃的振荡条件下生长直到0.6的OD600。移除1ml等份的细胞，离心并在-20℃冷冻。向培养物中加入IPTG至1mM的终浓度并在37℃振荡培养另外的4小时。通过在4000×g下离心20分钟来收集细胞，将沉淀重悬在裂解缓冲液中于天然条件下纯化(Qiagen，德国)，并且用超声处理裂解(在200-300W下的6×10s，具有10s的间歇)。将裂解物在10,000×g下的冷冻离心机中离心10分钟。将上清液转移到新的管中并且将沉淀重悬在裂解液中并保存在冰上。将沉淀和上清液分别用2×SDS-PAGE样品缓冲液混合，并使用12％的SDS-PAGE和蛋白印迹分析。结果显示该蛋白在可溶的部分中是检测得到的并且因此可以在天然条件下纯化。
将最大的产生蛋白的克隆接种到20ml含有100μg/ml氨苄青霉素的SOB中并在37℃剧烈振荡生长过夜。第二天，向1升SOB接种1∶50的非诱导的过夜培养物，并使其在37℃的振荡条件下生长直到0.6的OD600。诱导前立刻取5ml等份的培养物。通过加入IPTG至1mM终浓度并在37℃继续培养4小时诱导细胞。通过在4000×g下离心20分钟来收集细胞，并在-20℃存储直到纯化。
使用Ni-NTA琼脂糖柱(Qiagen，德国)在天然条件下按照生产商的说明对重组体蛋白进行纯化。将细胞沉淀在冰上融化15分钟并以5ml每克湿重重悬在裂解缓冲液中。加入1mg/ml的溶菌酶并在冰上培育30分钟，并在冰上使用6个200-300W的10s的脉冲超声处理，每个脉冲间有10s的冷却期。将裂解物在10,000xg下4℃下离心30分钟以沉淀细胞碎片。保存上清液。取50μl等份的上清液并储存在-20℃用于以后分析。将1ml的50％Ni-NTA混悬液加入到4ml澄清的裂解液中并通过在4℃振荡(200rpm在旋转振动器上)60分钟轻柔混合。将裂解物-Ni-NTA混合物上载到底部出口加帽的柱上。在移去底部的帽后，收集流过物，并用4ml的清洗缓冲液将柱子清洗两次，收集馏分用于SDS-PAGE分析。用0.5ml的洗脱缓冲液将蛋白洗脱4次，将洗脱物收集在4个管中并用SDS-PAGE分析。发现纯化后的蛋白表达为4mg/L。
为了分析表达的蛋白，使用迷你胶电泳单元(Bangalore Genei，印度)。依照确定的方案进行SDS-PAGE[Laemmeli，1970]。通过混合下列的组分制备10％的分离胶2.66ml的水，1.562ml 30％的丙烯酰胺，1.250ml 1.5M的Tris-HCl，50μl 10％的APS，10％的TEMED。胶顶有～400μl的水饱和的丁醇并允许聚合。聚合以后，将丁醇引流出并用蒸馏水清洗。而后，将2ml的积层胶混合物(1.25ml水，250μl 30％的丙烯酰胺，500μl 0.5M的Tris-HCl，30μl 10％的APS和5μl TEMED)仔细地倒出，避免分离胶顶端产生任何气泡。将梳子插入到积层胶部分并使其聚合。聚合后，用过量的水清洗孔。将样品应用到积层胶的确定的孔中，以恒定的电压(60V对积层胶并且100V对分离胶)进行电泳。标准分子蛋白标记(MBI)和对照(载体蛋白)与样品并排跑胶。随后将完成的胶用考马斯亮兰进行染色，去染，和白光下显影。
来自株MHOM/IN/DD8的纯化的蛋白以29kDa的大小对应于预测分子量进行迁移，株MHOM/IN/KE16/1998的预测分子量是26kDa，但是来自该株的纯化的蛋白具有异常的PAGE迁移性并且以更高的大约为32kDa的分子量迁移(图10a)。报道的抗原与恰氏利什曼原虫的230kDa抗原全然不同。抗原变化显著，超过60％的预测氨基酸序列与来自恰氏利什曼原虫的K39重复抗原的序列有差别。同样公开的是编码29kD和26kD抗原的DNA，以及包含该抗原的治疗组合物和疫苗组合物。
株MHOM/IN/DD8和MHOM/IN/KE16/1998的纯化的重组体多肽被用来在兔中免疫。用等体积的弗氏完全佐剂(Sigma，USA)乳化100毫克的每种多肽。在多个位点将混合物皮内注射。以30天的间隔给予三个加强剂量的相同量的被弗氏不完全佐剂乳化的抗原。第一次免疫前，收集免疫前血清并在蛋白印迹上测试。最后一次加强免疫后，从免疫的动物无菌收集血液，分离血清并在-70℃下储存直到使用。
将大肠杆菌表达的蛋白在12％的SDS-PAGE上分解，随后电转移到硝化纤维膜上[Towbin等，1976]。在Bio-Rad半干转移单位中，使用转移缓冲液(Tris碱3.08g，甘氨酸14.66g，甲醇200ml，加水到1000ml的终体积)执行转移。对于转移，应用15V并使其在室温下跑45分钟。转移后，将膜放入含有2.5％BSA的磷酸盐缓冲液(PBS，NaCl 8.00g，KCl0.20g，NaH2PO41.44g，KH2PO40.24g，pH 7.4)的封闭液中。用含有0.02％吐温-20(PBS-T)的PBS清洗封闭的膜3次。将膜与黑热病患者的血清(在PBS中1∶200稀释)在25℃培育1小时。此外，在PBS-T中将其清洗4次并且在1∶4000稀释的抗人IgG抗体中培育，与碱性磷酸酶室温下缀合45分钟。用PBS清洗几次后，通过加入BCIP-NBT(Amresco，USA)对膜进行显影。
将纯化的抗原首先在SDS-PAGE上跑胶并随后用五-抗-his HRP缀合抗体进行免疫印迹(图10a和10b)。为了研究纯化蛋白的抗原性，SDS-PAGE后用黑热病患者的血清(图11a和11b)和PKDL患者的血清(图12a和12b)进行免疫印迹，随后用合并的(n＝5)健康个体血清作为对照进行蛋白印迹并示于图13a和13b。同样，如图14a和14b进行只有AP标记的抗人第二抗体的免疫印迹。免疫印迹和序列分析的结果揭示尽管具有不同的表位，杜氏利什曼原虫的重组体抗原氏特异的。
在用BCA方法(Sigma)进行蛋白评价后，取纯化的抗原用于ELISA评价。用适当的血清和试剂对照将ELISA最初以不同的参数标准化。最佳选择50ng/孔和1∶100血清稀释的ELISA并且相同的条件被用于2个来自杜氏利什曼原虫即MHOM/IN/DD8和MHOM/IN/KE16/1998的抗原进行ELISA。每个板中包括一个阳性对照(寄生虫学和血清学上rK39阳性)和一个来自非地方流行性地区的阴性对照，和另一个试剂对照。板被如下包被；按照仅被少许改动的标准方法[Singh S等，1995]，通过将50ng的纯化的驱动蛋白加入200μl 0.1M的重碳酸盐缓冲液(pH 9.2)，用抗原包被具有96个平底孔的聚苯乙烯微滴度板。盖上该板并于4℃过夜温育。随后移除抗原溶液并且用PBST(带有0.05％吐温20的PBS)清洗板3次。随后用200μl的1％的BSA封闭孔1小时，用PBST清洗3次。将板在室温下干燥，密封，并在4℃下储存直到使用。将敏化的板用50μl的从1∶100到终点稀释于PBST中的患者血清培育2小时。再次用PBST清洗孔并与50μl缀合了碱性磷酸酶的山羊抗人IgG以其10-3稀释度培育另外的2小时，随后用PBST清洗3次。在37℃与50μl二乙基胺缓冲液中的p-硝基苯基磷酸盐(酯)中培育30分钟后，用50μl的3N NaOH终止反应。在Tritrius板读数仪中在450nm处测量每个孔的光密度。对于同组的样品，对来自MHOM/IN/DD8(SEQID NO5)的重组蛋白的抗体滴度要远小于MHOM/IN/KE16/1998(SEQ ID NO6)。用72个地方流行性的和非地方流行性的健康对照，92个结核杆菌阳性，32个HIV阳性，31个HCV阳性和27个HbsAg阳性血清的预实验结果显示没有交叉反应性。但是以前确定的10个VL病例和10个PKDL病例的血清的rK39阳性显示两种抗原在50ng/孔浓度均有高的抗体滴度。该数据显示，这两个良好表征的来自印度株的抗原将对印度黑热病的诊断非常有益。
图15描述了不同样品经过使用纯化的MHOM/IN/DD8源抗原的ELISA的平均滴度值。图16显示了不同组样品对纯化的MHOM/IN/KE16/1998源抗原的平均滴度值。
使用抗体检测利什曼原虫抗原从株SEQID NO5和SEQ ID NO6纯化的重组体多肽被用于兔中的免疫。用等体积的弗氏完全佐剂(Sigma，USA)乳化100毫克的每种多肽。在多个位点将混合物皮内注射。以30天的间隔给予三个加强剂量的相同量的被弗氏不完全佐剂乳化的抗原。第一次免疫前，收集免疫前血清并在蛋白印迹上测试。最后一次加强免疫后12天，从免疫的动物无菌收集血液，分离血清并且血清中的抗体被亲和纯化并在4℃储存直到使用。
具有96个孔的聚苯乙烯微量滴度板被如下包被在包被缓冲液(pH 9.2)[1.59g碳酸钠(Na2CO3)，2.93g重碳酸钠(NaHCO3)，0.20g叠氮化钠(NaN3)，溶解在900ml H2O中，用HCl调节pH到9.6，并补充到1L]中稀释储存在4℃的抗体，并且在微量滴度板的每个孔中加入200μl。将板在37℃下培育4小时并用PBST清洗3次。通过在绵纸上上下轻扣使板干燥。随后将包被到固体支持物上的抗体用来检测利什曼原虫抗原，该方法称为双抗体或者夹心ELISA，并且如下进行操作。向每个孔中加入200μl等份的测试样品并且在37℃下培育4小时，将板用PBST清洗三次，并随后与抗体缀合物一起培育，在37℃下培育2小时，用PBST清洗3次，向每个孔加入200μl等份的底物，在室温下培育60分钟。在405nm下在Tritrius板读数仪中测量每个孔的光密度。夹心ELISA测量两层抗体之间的抗原的量。要测定的利什曼原虫抗原含有至少两个抗原位点，其能够与抗体结合，这是由于至少两个抗体在该夹心中发挥作用。这样的夹心测试限制于多价抗原如蛋白质或者多糖的定量。用于抗原定量的夹心ELISA在抗原浓度低和/或抗原被包含在高污染浓度的蛋白中的时候特别有用。
以下实施例描述了本发明，其不能解释为限制了本发明的范围。
实施例1该实施例阐述了从杜氏利什曼原虫的印度分离株克隆驱动蛋白免疫显性重复区域。PCR克隆策略如下使用引物组LKF 2564和LKR 3266(分别为SEQ ID NO10和SEQ ID NO11)扩增免疫显性117串联重复区域。该引物组扩增了一个大小约为470bp的片段和一个大小约为590bp的产物，前者相应于杜氏利什曼原虫株MHOM/IN/KE16/1998的4个117bp串联重复，后者相应于来自杜氏利什曼原虫株MHOM/IN/DD8的5个免疫显性串联重复。将PCR扩增后的驱动蛋白基因如下克隆到TA克隆载体中。将PCR扩增的DNA在琼脂糖胶上分离，用无菌解剖刀将含有目的带的部分切下。用胶洗脱试剂盒(Qiagen，德国)按照生产商的说明书将DNA从胶中洗脱。在分光光度计中的260nm吸光度处测定洗脱DNA的浓度。
将胶纯化的PCR目的产物直接连接到pGEMT-Easy载体(Promega，USA)上。向1.5ml微量离心管中加入下列组分pGEM-T Easy(100ng/μl) 1.00μl10X连接缓冲液 1.00μlDNA(200ng) 5.00μlT4DNA连接酶(2U/μl) 1.00μl用水将体积补充到10.00μl
轻柔混合后，将管在4℃下孵育过夜并在70℃下加热10分钟。将样品在-20℃下储存直到转化。
随后用热激处理转化连接的混合物。通过使用氯化钙方法制备感受态细胞[Sambrook等，1989]。将单个集落的大肠杆菌接种到5ml的LB培养基中并在37℃下振荡(200rpm)培养过夜。第二天，将1ml的过夜培养物接种到新鲜原液的100mlLB培养基中，并在37℃下连续振荡培养直到OD值达到600nm下的0.6。将培养物在冰上冷却30分钟并且用4000g、4℃下离心10分钟收集细胞。将细胞沉淀重悬在1/10体积的冰冷的过滤的无菌50mM CaCl2中并在冰上保持30分钟。将细胞沉淀下来并最终重悬在1/25体积的冰冷的50mM CaCl2中(具有20％ V/V的高压消毒的甘油)，并以200μl的等份储存在-70℃或者立即使用于转化。
将大约5μl的连接混合物轻柔地与感受态细胞(200μl)混合，并在冰上培养30分钟。培养后，将细胞置于42℃的水浴中90秒(热激)并立即转移到冰上。将800μl的LB培养基加到细胞中并在37℃下振荡(150rpm)保持90分钟。将细胞与16μl的X-gal和10μl的1M的IPTG在含有50μl/ml氨卞青霉素的LB琼脂平板上铺板。将板在37℃下培育12-16小时。选择白色的集落并检查插入物。通过限制性图谱和测序来进一步表征重组体克隆。所有的测序是通过链终止法在ABI Prism7.0版的自动DNA测序仪中完成的[Sanger等，1997]。使用不同的软件如DNASIS，Lasergeneedit；Megalign等(DNA star Inc.)，Clustal W(各种序列文件的多重比对)对序列进行分析。使用Seqman II(Lasergene包)将所有得到的序列进行比对以形成连续的伸展。
同时，使用来自不同网站BLAST[Altschul等，1997]选项查询序列的同源性。
在序列组装后，所得到全长驱动蛋白序列被呈现在株MHOM/IN/DD8的SEQ ID NO1中，发现其长度为3016bp并具有2670bp的开放阅读框。发现株MHOM/IN/KE16/1998的序列长度为2937bp并具有2577bp的长开放阅读框(SEQ ID NO2)。对于株MHOM/IN/DD8(图1)，序列分析揭示扩增免疫显性区域的PCR产物的大小为563bp，相应于4.8个117bp的串联重复；对于株MHOM/IN/KE16/1998(图2)，其大小为466bp，相应于4个117bp的串联重复。
另外，序列分析显示了在DNA水平以及预测氨基酸序列与报道的恰氏利什曼原虫序列(基因库，入藏登记号L07879)的显著不同。株MHOM/IN/DD8显示了与恰氏利什曼原虫序列以及株MHOM/IN/KE16/1998的明显不同。使用基因库数据库的非-多余和专利部Blast搜索株MHOM/IN/DD8的预测蛋白序列(SEQ ID NO5)，结果揭示其分别只有与公布的恰氏利什曼原虫序列和美国专利号i)US5411865和ii)US 5912166序列的38％的同一性(图3)。
对杜氏利什曼原虫株MHOM/IN/DD8和MHOM/IN/KE16/1998(SEQID NO3和SEQ ID NO4)与恰氏利什曼原虫(基因库，入藏登记号L07879)之间的免疫显性重复区域进行了Clustal W多重序列比对，结果见图4。相同部分为暗阴影。杜氏利什曼原虫(SEQID NO5和SEQ ID NO6)和恰氏利什曼原虫的免疫显性重复区域的氨基酸水平多重序列比对见图5。杜氏利什曼原虫株MHOM/IN/DD8(SEQID NO5)和恰氏利什曼原虫的免疫显性重复区域的氨基酸水平多重序列比对见图6。两株杜氏利什曼原虫株MHOM/IN/DD8和MHOM/IN/KE16/1998(SEQID NO5和SEQ IDNO6)的免疫显性重复区域的氨基酸水平的序列比对见图7。杜氏利什曼原虫的印度分离株，株MHOM/IN/DD8和MHOM/IN/KE16/1998(SEQ IDNO5和SEQ ID NO6)的具有内重复变化的免疫显性39氨基酸重复单元见图8和图9。序列分析显示氨基酸变化很大，具有许多取代。在报道的恰氏利什曼原虫的39氨基酸重复区的许多位置具有许多保守的和变化的取代。至少杜氏利什曼原虫的5个氨基酸与恰氏利什曼原虫的不同，不同的位置在18，27，29，32和38并且在下面的表1中用“*”表示。
实施例2该实施例阐述了患者血清对识别重组体杜氏利什曼原虫抗原的反应性。通过用PstI和NcoI消化，将插入物从携带免疫显性串联重复的重组体pGEM-TE质粒(pGEM-TEasy/DD8/LKF2564和pGEM-TEasy/KE16/LKF2564)中释放。将插入物从胶切割下来，用Qiagen胶洗脱系统洗脱并在PstI和NcoI消化的pRSET C载体内框中连接，并通过标准的方法[Sambrook等，1989]将其转化到BL21感受态细胞。在氨苄青霉素板上选择克隆，分离质粒DNA，并用PstI和NcoI消化来检查插入物。这些释放插入物克隆被选择用于蛋白表达。将最大的产生蛋白的克隆接种到20ml的含有100μg/ml氨苄青霉素的SOB培养基中并在37℃剧烈振荡生长过夜。第二天，将1升SOB培养基与1∶50的非诱导的过夜培养物接种，并使其在37℃的振荡条件下生长直到0.6的OD600。诱导前立刻取5ml等份的培养物。通过加入IPTG至终浓度为1mM并在37℃继续培养4小时来诱导细胞。通过在4000×g下离心20分钟来收集细胞，并在-20℃存储直到纯化。在天然条件下按照生产商的使用说明用Ni-NTA琼脂糖柱(Qiagen，德国)纯化重组体多肽。来自株MHOM/IN/DD8的纯化的蛋白以29kDa的大小对应于预测分子量进行迁移(图10a，泳道2)。将纯化的抗原首先在SDS-PAGE上跑(图10a，11a，12a和13a)并随后用五-抗-his HRP缀合抗体(图10b)，黑热病患者的血清(图11b)，PKDL患者的血清(图12b)进行免疫印迹，随后用合并的(n＝5)健康个体血清进行蛋白印迹(图13b)，进行只有AP标记的抗人第二抗体的蛋白印迹(图14b)。免疫印迹和序列分析的结果揭示尽管具有不同的表位，杜氏利什曼原虫的重组体抗原是特异的。
实施例3该实施例阐述了患者血清对识别杜氏利什曼原虫抗原的反应性。用BCA方法(Sigma)进行蛋白评价，并且纯化的抗原被用于ELISA。用适当的血清和试剂对照将ELISA最初以不同的参数标准化。最佳选择50ng/孔和1∶100血清稀释的ELISA并且相同的条件被用于2个来自杜氏利什曼原虫即MHOM/IN/DD8(SEQID NO5)和MHOM/IN/KE16/1998(SEQ IDNO6)的重组多肽进行ELISA。每个板中包括一个阳性对照(寄生虫学和血清学上rK39阳性)和一个来自非地方流行性地区的阴性对照，和另一个试剂对照。板被如下包被布；按照仅被少许改动的报道方法[Singh S等，2002]，通过将50ng的纯化的驱动蛋白抗原加入200μl 0.1M的重碳酸盐缓冲液(pH 9.2)，用抗原包被具有96个平底孔的聚苯乙烯微滴度板。板被覆盖并在4℃下培养过夜。随后移除抗原溶液并且用PBST(带有0.05％吐温20的PBS)清洗板3次。随后用200μl的1％的BSA封闭孔1小时，用PBST清洗3次。将板在室温下干燥，密封，并在4℃下储存直到使用。将敏化的板用50μl的从1∶100到终点稀释在PBST中的患者血清培育2小时。用PBST清洗孔3次并与50μl缀合了碱性磷酸酶的山羊抗人IgG以其10-3稀释物培育另外的2小时，随后用PBST清洗3次。在37℃与50μl二乙基胺缓冲液中的p-硝基苯基磷酸盐(酯)中培育30分钟后，用50μl的3N NaOH终止反应。在Tritrius板读数仪中在450nm处测量每个孔的光密度。对于同组的样品，对来自MHOM/IN/DD8(SEQID NO5)的重组蛋白的抗体滴度要远小于MHOM/IN/KE16/1998(SEQ ID NO6)的抗体滴度。用72个地方流行性的和80个非地方流行性的健康对照，92个结核杆菌阳性，32个HIV阳性，31个HCV阳性和27个HBsAg阳性个体血清进行预实验。这些ELISA结果显示了100％的特异性而没有交叉反应性。但是，对确证的带有rK39抗原的VL(N＝10)和PKDL(N＝10)患者的血清，所进行的ELISA显示对50ng/孔浓度的所有3种抗原高的抗体滴度，所述的三种rK39抗原来自恰氏利什曼原虫(Burns et al.，1993)、杜氏利什曼原虫的株MHOM/IN/DD8(SEQ ID NO5)和MHOM/IN/KE16/1998(SEQ ID NO6)。该数据显示，这两个良好表征的来自印度株的抗原对印度黑热病诊断的具有高度的特异性和敏感性。在对更多样品进行的研究中发现，用恰氏利什曼原虫的rK39无法诊断的许多病例被这两种来自杜氏利什曼原虫的重组多肽检测了出来。这揭示从杜氏利什曼原虫的印度株中新分离的重组多肽对诊断印度VL和PKDL更为特异，因此，其可以被用于该疾病的广泛诊断。
但是，在图15和16中只提供了关于10个阳性样品和其它对照样品的数据。图15描述了不同样品经过使用纯化的MHOM/IN/DD8源抗原ELISA的平均滴度值。图16显示了不同组样品对纯化的MHOM/IN/KE16/1998源抗原的平均滴度值。
实施例4该实施例教导了从动物中获得针对多肽SEQ ID NO5或者SEQ IDNO6的抗体，以及其在检测利什曼原虫抗体中的应用如下。
1.来自含有SEQ ID NO5和SEQ ID NO6的组中纯化的重组体多肽被用于免疫兔。用等体积的弗氏完全佐剂(Sigma，USA)乳化100毫克的多肽。
2.在多个位点将混合物皮内注射。
3.以30天的间隔给予三个加强剂量的相同量的被弗氏不完全佐剂乳化的抗原。第一次免疫前，收集免疫前血清并在蛋白印迹上测试。
4.最后一次加强免疫后，从免疫的动物无菌收集血液，分离血清并亲和纯化血清中存在的抗-抗体，并在4℃下储存直到使用。
5.将抗体首先用0.1M的重碳酸盐缓冲液稀释，pH9.2，并且随后向每个微量滴度板的孔中加入200μl。
6.将抗体包被的板用石蜡包埋并在冷室中于含有湿纸巾的潮湿盒子内培育过夜，或者在室温和湿气下培育两个小时。
7.将板倒空并且用100μl的封闭缓冲液在室温下封闭未被占据的点30分钟，所述的封闭缓冲液含有100mM磷酸盐缓冲液，pH7.2，1％BSA，0.5％吐温-20和0.02％的Thimerosol。
8.将板倒空并且用清洗缓冲液(100mM磷酸盐缓冲液，150mMNaCl，0.2％ BSA和0.05％吐温20)清洗3次。
9.首先在抗原缓冲液(100mM磷酸盐缓冲液，150mM NaCl)中稀释抗原溶液，随后向板中的每个孔加入50μl的体积。将板在室温下培育45分钟到1小时。
10.将板再次倒空并且用清洗缓冲液清洗3次。
11.将酶标记的针对抗原的抗体在0.1M、pH9.2的重碳酸盐缓冲液中适当稀释，随后向板中的每个孔加入50μl的体积并在室温下培育30分钟。
12.将板再次倒空并且用清洗缓冲液清洗3次。
13.加入显色系统并且测量颜色强度。
优点驱动蛋白相关抗原的表征在序列水平已经揭示两个物种杜氏利什曼原虫和恰氏利什曼原虫的驱动蛋白抗原的相似和不同。
从本发明可以清楚地看到，分离自印度株的驱动蛋白相关的抗原的免疫显性重复与早先报道的其它利什曼原虫物种的序列是不同的。
本研究揭示印度株与早先报道的株和来自其它地理区域的物种是非常不同的。
本研究还揭示印度株之间的重复单位的氨基酸序列变化比先前报道的序列高很多。
本发明还导致多肽的分离，所述的多肽在序列上与早先报道的多肽序列不同。
本发明还导致抗利什曼原虫抗体的检测方法的形成，所述的方法基于新发现的来自杜氏利什曼原虫印度分离株的抗原。
本发明还导致用于检测VL的利什曼病检测试剂盒，由于印度的杜氏利什曼原虫物种和其它类似物种可能会被K39多肽漏检。
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权利要求
1.一种如SEQ ID NO5或者SEQ ID NO6所述的分离的多肽，其包含利什曼原虫抗原的免疫原性区域，其中所述的多肽含有一个或者多个39个氨基酸的重复区域。
2.一种如SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所述的分离的DNA序列，其编码如权利要求1所述的多肽。
3.根据权利要求1的多肽，其分离自杜氏利什曼原虫的印度株。
4.一种在样品中检测抗利什曼原虫抗体的方法，所述方法包括a.提供一个固体的支持物或者载体，其与多肽结合，所述多肽选自由如权利要求1所述的SEQ ID NO5和SEQ ID NO6组成的组；b.将来自所述样品的抗利什曼原虫抗体与结合到固体支持物或者载体的多肽结合；c.将与酶或者标记缀合的抗人第二抗体或者蛋白加入到步骤(b)的内容物中；和d.在所述的样品中检测抗利什曼原虫抗体。
5.根据权利要求4的方法，其中的样品选自由全血、血清、血浆和其它体液组成的组。
6.根据权利要求5的方法，其中的样品选自动物或者包括人在内的哺乳动物。
7.根据权利要求4的方法，其中所述的固体支持物选自由硝化纤维，尼龙，胶乳颗粒，聚丙烯和聚苯乙烯材料组成的组。
8.根据权利要求4的方法，其中所述的载体是金粒。
9.根据权利要求4的方法，其中的抗人第二抗体选自IgG，IgM，IgA，IgE抗体类别及其亚类。
10.根据权利要求4的方法，其中的蛋白选自由蛋白A和蛋白G组成的组。
11.根据权利要求4的方法，其中的酶选自由碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶，β-半乳糖苷酶，脲酶，黄嘌呤氧化酶，葡萄糖氧化酶和青霉素酶组成的组。
12.根据权利要求4的方法，其中所述的标记选自由放射性同位素，生物素，生色团，荧光团，化学发光的部分组成的组。
13.根据权利要求4的方法，其中所述的抗利什曼原虫抗体检测步骤选自由检测荧光，检测化学发光，检测光吸收或者检测放射性同位素组成的组。
14.一种用于检测抗利什曼原虫抗体的诊断试剂盒，其包含如权利要求1中要求的多肽，抗人第二抗体或者蛋白，和用于检测所述抗体的常规试剂，其中所述的抗人第二抗体或者蛋白与酶或标记缀合。
15.根据权利要求14的试剂盒，其中所述的多肽与固体支持物或者载体结合。
16.根据权利要求14的试剂盒，其中所述的固体支持物选自由硝化纤维，尼龙，胶乳颗粒，聚丙烯和聚苯乙烯材料组成的组。
17.根据权利要求14的试剂盒，其中所述的载体是金粒。
18.根据权利要求14的试剂盒，其中的抗人第二抗体选自IgG，IgM，IgA，IgE抗体类别及其亚类。
19.根据权利要求14的试剂盒，其中的蛋白选自由蛋白A和蛋白G组成的组。
20.根据权利要求14的试剂盒，其中的标记选自由酶，放射性同位素，生物素，生色团，荧光团和化学发光部分组成的组。
21.根据权利要求14的试剂盒，其中的酶选自由碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶，β-半乳糖苷酶，脲酶，黄嘌呤氧化酶，葡萄糖氧化酶和青霉素酶组成的组。
22.一种获得权利要求1所述多肽的抗体的方法，所述的方法包括将多肽注射入动物，收集针对所述多肽产生的抗体和纯化所述的抗体。
23.根据权利要求22的方法，其中的动物选自由小鼠，兔，马，山羊，绵羊，豚鼠，猪，牛，大鼠，鸡，和仓鼠组成的组。
24.一种使用按照权利要求22获得的抗体来检测样品中利什曼原虫抗原的方法，该方法包括a.将一部分所述抗体与固体支持物或者载体结合；b.将含有利什曼原虫抗原的样品加到所述的结合于固体支持物或者载体的抗体；c.将另一部分与酶或者标记缀合的抗体加入到步骤(b)的内容物中；和d.在所述的样品中检测利什曼原虫抗原。
25.根据权利要求24的方法，其中的样品选自由全血、骨髓、脾抽出物，皮肤活检，其它组织活检和切片涂片组成的组。
26.根据权利要求25的方法，其中的样品选自动物或者包括人在内的哺乳动物。
27.根据权利要求24的方法，其中所述的固体支持物选自由硝化纤维，尼龙，胶乳颗粒，聚丙烯，玻璃和聚苯乙烯材料组成的组。
28.根据权利要求24的方法，其中所述的载体是金粒。
29.根据权利要求24的方法，其中的酶选自由碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶，β-半乳糖苷酶，脲酶，黄嘌呤氧化酶，葡萄糖氧化酶和青霉素酶组成的组。
30.根据权利要求24的方法，其中所述的标记选自由放射性同位素，生物素，生色团，荧光团，化学发光的部分组成的组。
31.根据权利要求24的方法，其中所述的利什曼原虫抗原的检测步骤选自由检测荧光，检测化学发光，检测光吸收或者检测放射性同位素组成的组。
32.一种用于检测利什曼原虫抗原的诊断试剂盒，其包含结合到固体支持物或者载体的抗体，与酶或者标记缀合的抗体，和用于检测利什曼原虫抗原的常规试剂。
33.根据权利要求32的诊断试剂盒，其中所述的固体支持物选自由硝化纤维，尼龙，胶乳颗粒，聚丙烯，玻璃和聚苯乙烯材料组成的组。
34.根据权利要求32的诊断试剂盒，其中所述的载体是金粒。
35.根据权利要求32的诊断试剂盒，其中的酶选自由碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶，β-半乳糖苷酶，脲酶，黄嘌呤氧化酶，葡萄糖氧化酶和青霉素酶组成的组。
36.根据权利要求32的诊断试剂盒，其中的标记选自由放射性同位素，生物素，生色团，荧光团和化学发光部分组成的组。
全文摘要
本发明提供了用于在疑似感染了利什曼虫属原生动物寄生物的个体中检测抗利什曼原虫抗体的化合物和方法，其中的感染物为印度株并且与印度利什曼原虫株类似或密切相关。所提供的化合物包括示于SEQ IDNO5或者SEQ ID NO6的多肽，其被用于在个体中检测利什曼原虫抗体，在所述的个体中激发了针对印度株利什曼原虫物种和与印度利什曼原虫株类似或密切相关的利什曼原虫物种的免疫应答，所述的化合物还被用作疫苗和治疗剂以预防和治疗利什曼病。本发明还提供了用于检测利什曼原虫抗原的诊断试剂盒，其由针对SEQ ID NO5或者SEQ ID NO6所示多肽的抗体组成。
文档编号G01N33/569GK1910197SQ200380111045
公开日2007年2月7日 申请日期2003年12月26日 优先权日2003年12月26日
发明者S·辛格, R·西瓦库玛 申请人:全印度医疗科学学会, 生物技术部